文摘

乳酸杆菌已经被证明能够促进老年人的健康功能。在这项研究中,我们分析了四种不同的益生菌菌株的机制先天免疫的影响,如ROS调节、细胞因子、吞噬、杀菌活性,表明NF -κB pp65, TLR2激活。ROS的产生依赖于浓度和种类的乳酸菌。从测试菌株获得的结果(乳杆菌GG,喂食KLSD,l . helveticusIMAU70129,l .干酪乳杆菌IMAU60214)表明,菌株诱导促炎细胞因子,如引发早期,TNF -α、IL-12p70和il - 6的分泌。然而,il - 1β表达诱导只有l . helveticus和l .干酪乳杆菌菌株(24 h后刺激)。吞噬作用和杀菌活性的巨噬细胞对各种病原体,如金黄色葡萄球菌,美国沙门氏菌感染,大肠杆菌,增加了预处理乳酸菌。核易位NF -κB pp65 TLR2-dependent信号也增加了益生菌的治疗。综上所述,实验证明的益生菌菌株乳酸菌可能起到早期免疫刺激性作用直接关系到最初的人类巨噬细胞的炎症反应。

1。介绍

粮农组织和世卫组织(联合国粮食及农业组织和世界卫生组织)益生菌定义为“活微生物在足够当管理带来的健康益处主机”(1]。特别是,乳酸菌是一个重要的益生菌,扮演着重要的角色在肠道粘膜免疫调节2]。益生菌的临床和实验研究乳酸菌菌株报道,这些细菌有效地预防和治疗antibiotic-associated腹泻,旅行者腹泻和肠道病原体引起的感染(3,4]。此外,一些研究已经表明,他们提供了一个积极的影响通过促进免疫球蛋白IgA的分泌和抗菌分子(即的生产。细菌素),它能够抑制一些肠道病原体(5]。在这种背景下,益生菌的免疫调节作用乳酸菌菌株也被证明能降低炎症反应在某些病理条件下,如坏死性小肠结肠炎和过敏的儿童6,7]。在其他的体外研究中,一些菌株产生的增加促炎细胞因子如肿瘤坏死因子——的生产α、il - 12和引发而另一些产生分泌的增加抗炎细胞因子il - 10等(8,9]。洛佩兹等的研究。10)表明,UV-inactivated和生活乳杆菌GG (LGG)也同样有效的减少引发肠道上皮细胞。此外,李et al。11]表明,生活和heat-killed LGG能够对职业的分泌起到类似的作用,包括抗炎细胞因子和趋化因子,当婴儿饮食的老鼠。然而,这些有利影响相关只有有限数量的压力,和其他菌株和物种不能认为[起到相同的作用12,13]。益生菌的免疫效应因此被证明是极其多样化和strain-dependent除了细胞特定类型。

单核细胞和巨噬细胞是细胞组件的先天免疫系统,防止入侵病原体通过释放细胞毒性分子如活性氧(ROS),通过分泌促炎细胞因子如TNF -α和引发14,15]。巨噬细胞细菌因为细菌表达保守的模式识别受体(PRRs),如toll样受体(通常)。巨噬细胞也间接反应时识别microbe-associated分子模式(mamp),在细胞表面表达的益生菌(16]。一些研究表明,TLR2和TLR4表达既定的巨噬细胞(17]。激活的TLR结果的感应信号级联,调节细胞因子等各种反应基因的表达,可能激活信号通路,比如NF -kB信号通路(18]。比赛当天艳阳高照et al。19)表明,可行和死亡喂食通过激活NF - GG增加巨噬细胞功能kB STAT1和STAT3 dna结合蛋白的活动。虽然免疫活动已被归因于一些益生菌,这些影响的分子机制尚未建立。确定益生菌的影响乳酸菌在先天免疫反应和主机健康可以支持应用程序旨在预防和治疗不同的疾病。更清楚的了解益生菌与宿主细胞相互作用因此需要优化这样的应用程序。

2。材料和方法

2.1。细菌菌株和生长条件

4株乳酸菌被用于这项研究:乳杆菌GG,乳杆菌逗留一番,乳酸菌helveticusIMAU70129,干酪乳杆菌IMAU60214先前孤立从商业产品Cruz-Guerrero et al。20.,21]。在刺激实验,乳酸菌之前培养用汤夫人(Difco)一夜之间在37°C。细菌细胞在固定相使用离心收获(4000×g, 10分钟)和无菌生理盐水洗两次。集中细菌细胞被加热灭活细胞为15分钟85°C。冰冻的细菌细胞被存储在社保基金在股票−80°C到使用。此外,金黄色葡萄球菌(写明ATCC 2913),大肠杆菌(写明ATCC 35218)沙门氏菌肠型沙门氏菌感染(写明ATCC 14028)种植在大豆胰蛋白酶的肉汤(Difco实验室)37°C。细胞后离心机(4000 g×5分钟)和无菌生理盐水洗了三次,菌株是规范化的密度~ 10⁸CFU /毫升。在一些实验中,使用热灭活细菌和丧失生存能力证实了电镀灭活细菌的琼脂板(48 h在37°C)。FITC-labeled细菌(金黄色葡萄球菌,美国typhimurim,大肠杆菌)被加热在80°C细胞60分钟,然后resuspended 5毫克/毫升的浓度在50 mM碳酸盐缓冲(pH值9.6)。FITC异构体(σ)然后添加到细胞,这是孵化在37°C为30分钟,然后用无菌水洗PBS和储存在−80°C到使用。

2.2。巨噬细胞来源于人类单核细胞

Leukocyte-rich淡黄色的外套从志愿者获得捐助者(墨西哥儿童医院血库,费德里科•戈麦斯),与当地伦理委员会的批准。单核细胞使用梯度离心分离,如前所述[22]。简单,接口单核细胞与无菌生理盐水洗了两次,然后在猎鹰管收集。这些细胞被立即计入纽鲍尔室和细胞生存能力评估用台盼蓝染色的细胞。分离出单核细胞,我们执行磁标签与负选择使用单核细胞隔离设备二世(Miltenyi研究),根据制造商的指示。净化然后单核细胞分化成巨噬细胞培养中的细胞rpmi - 1640中补充10%的边后卫(Gibco,英杰公司美国)7天。

2.3。ROS生产

ROS分泌luminol-amplified系统中使用化学发光测定的数量在一个lkb - 1251光度计,将光子在photomultitiplier管中电流的过氧化物酶如合,根据Rellstab中描述的方法等。23]。短暂,巨噬细胞坚持圆玻璃盖玻片(9毫米)1×10的浓度⁵细胞每盖玻片,然后放置在比色皿包含1毫升的汉克的解决方案(鲁米诺0.8×10⁻⁴M和合4 U)。在37°C试管加热后10分钟,基线化学发光被记录。随后,不同浓度的heat-inactivated乳酸菌被添加到反应混合物(如莫伊,1:10,1:100年,1:250年,和1:500)。调理的酵母聚糖(za),如果巨噬细胞(汉克的解决方案)是作为积极的和消极的控制,分别。

2.4。细胞因子

巨噬细胞培养,如果或刺激heat-inactivated乳酸菌的莫伊500:1(细菌:巨噬细胞),6 - 24小时后收集上层的。细胞因子水平(IL-12p70 TNF-α引发,il - 6, il - 1β,并使用一种ELISA检测il - 10)量化工具(BD OptEIA Pharmingen,圣地亚哥,美国)根据制造商的指示。标准曲线是用来计算不同细胞因子的浓度pg / ml。

2.5。巨噬细胞吞噬试验

吞噬作用分析,1×10⁴巨噬细胞rpmi - 1640年被镀到12毫米玻璃盖玻片(康宁)和放置在无菌24-well组织培养板(配角)。这些细胞被允许在大气中含有5%坚持有限公司₂。调理的酵母聚糖被添加到巨噬细胞(MOI 10: 1)。同时,巨噬细胞在不同的井是使用乳酸菌在莫伊(500:1对1 h在37°C),随后挑战与酵母聚糖和调理的细菌等金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,FITC-labeled鼠伤寒沙门氏菌莫伊的10:1。终止的吞噬作用,细胞被大力用PBS (pH值7.4)洗净,然后固定在4%多聚甲醛(pH值7.4)。随后,细胞的细胞核与DAPI染色(1毫克/毫升)。玻璃盖玻片被风干,装显微镜玻片上使用Vectashield (Vysis)。吞噬细菌是可视化使用数字化的蔡司Axioskop 2配备了蔡司显微镜Axiocam(蔡司AG),从德)。摄入细菌的比例是由评估100细胞/字段在四个独立的实验。细胞的吞噬指数按照百分比计算执行每细胞吞噬作用使用平均粒子数。

2.6。巨噬细胞杀菌活性

细菌吸收和生存测量使用庆大霉素保护试验(24]。在细胞被感染之前,1×10⁴巨噬细胞rpmi - 1640年补充10% SFB被安置在无菌12-well组织培养板(配角)。这些细胞被允许在大气中含有5%坚持有限公司₂。同时,巨噬细胞在不同的井是使用乳酸菌在莫伊(500:1对1 h在37°C)和随后的挑战大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,沙门氏菌型沙门氏菌感染莫伊的1:10。这些细胞被培养60分钟37°C大气中含5%股份有限公司₂。这个潜伏期时间被认为是0。每个被清洗和处理媒体包含200μg / ml庆大霉素为30分钟37°C的气氛中含5%股份有限公司₂杀死任何细菌细胞外。媒体是媒体包含20所取代μg / ml庆大霉素期间的实验。在时间点1(120分钟),井洗4次,每次1毫升的PBS。他们在室温下培养10分钟在无菌水含有1% triton - x - 100对巨噬细胞溶解。稀释的溶解产物被镀在磅琼脂板和可行的细胞内细菌的数量是算作菌落(CFU)。

2.7。NF -κB (p65)检测使用间接免疫荧光和Transnuclear活性测定

人类巨噬细胞被附加到圆形玻璃盖玻片(9毫米),然后如果或刺激使用酵母聚糖(10μg / ml)和益生菌heat-inactivated乳酸菌的莫伊1:500。NF -kB活动在巨噬细胞用间接免疫荧光法测定Cellomics NF -kB工具包(热科学)根据制造商的协议。荧光发射的30分钟内添加不同的刺激被拍到使用数字化的蔡司Axioskop 2配备了蔡司显微镜Axiocam(蔡司AG),从德)。阳性的细胞比例pp65决心在100细胞/领域跨四个分离实验。

2.8。瞬时表达TLR2在HEK293细胞(293 - htlr2)

人类胚胎肾(HEK293-hTLR2)细胞获得InvivoGen(圣地亚哥,CA)和生长在24-well文化板块在DMEM补充10% FCS和10μg / ml杀稻瘟菌素在37°C (InvivoGen) 5%的股份有限公司₂的气氛。在70 - 80%融合文化的挑战与益生菌乳酸菌的莫伊1:500。板块在37°C被孵化24小时在大气中含有5%股份有限公司₂。收集上清液,TLR激活使用ELISA分析引发的大量生产,根据制造商的协议。控制、文化与TLR2受体激动剂刺激酵母聚糖10μg / ml或LTA (10μg / ml)。使用10阻塞进行化验μanti-hTLR2-IgA g / ml。引发的水平被确定为细胞因子如前所述。

2.9。统计分析

结果报告为均值±SD,对于每一个实验。总共有四个捐助者包括在复制样品。化验条件之间的差异进行了分析使用单向方差分析(方差分析)垫棱镜在图5的软件。一个的价值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。ROS生产

heat-killed乳酸菌的影响上一代的活性氧物种用化学发光测量(图1)。结果表明,添加heat-killed乳酸菌在人类巨噬细胞诱导主动呼吸爆发。ROS生产依赖于细菌:巨噬细胞莫伊的物种乳酸菌。的ROS-induced免疫刺激性效果最大化的莫伊500:1喂食GG,l。喂食KLSD,l . helveticusIMAU70129,l。干酪乳杆菌IMAU60214产生化学发光峰值(175±196±190±15日,24日,12日和200±14 Mv,职责),(图1(一))。然而,氧化反应引起的乳酸菌是低于引起酵母聚糖(200±14 Mv与600±20 Mv)。

此外,如图1 (b),zymosan-induced ROS生产动能是快速和短(500秒),而heat-killed lactobacillus-induced ROS生产动能被推迟(2000秒),再回到基线。这些结果表明,heat-killed乳酸菌激活人类巨噬细胞活性氧的生产。

3.2。在巨噬细胞细胞因子生产

巨噬细胞治疗乳酸菌被诱导产生细胞因子治疗开始后6 - 24小时。500年巨噬细胞与莫伊挑战1:heat-inactivated乳酸菌,引发的最大浓度观察6 h(图2)。所有的乳酸菌株诱导引发的一个重要层面。结果表明,巨噬细胞治疗,有一个对数增加比未经处理的巨噬细胞中可观察到什么,但相似的价值观zymosan-stimulated巨噬细胞(图2)。引发的水平产生24 h后没有不同的跨组织和保持高细胞处理所有乳酸菌的益生菌菌株。肿瘤坏死因子-获得的水平α相近的治疗(图2)。相比之下,最大24 h后,获得了il - 6的浓度水平的细胞因子治疗(图是不同的2)。l .干酪乳杆菌IMAU60214和l . helveticusIMA70129诱导il - 6的最高水平(例如,高于水平所产生的喂食KLSD和喂食GG)。此外,细胞因子的合成IL-12p70明显高于在这些压力。il - 1β24只后刺激后表达增加l . helveticusIMA70129和l .干酪乳杆菌IMAU60214。相比之下,既不喂食GG也不喂食KLSD诱导细胞因子il - 1的显著增加β(图2)。在这个实验中,我们发现所有的益生菌乳酸菌菌株诱导il - 10的生产后,24 h后,产生的水平是不同的菌株(图2)。这些数据都表明,每一个的乳酸菌菌株诱导巨噬细胞的炎症反应。

3.3。乳酸菌调节巨噬细胞的吞噬作用

细菌的吞噬作用是一种有效的机制采用的先天免疫反应。因此我们preincubated巨噬细胞与乳酸菌的益生菌菌株,以确定增加吞噬作用,以应对挑战的能力与不同的病原体(图3)。在这项研究中,我们应用四之前选定的刺激从酵母和酵母聚糖(准备酿酒酵母)两种革兰氏阴性(美国沙门氏菌感染和大肠杆菌)和一种革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)微生物。在细胞被质疑FITC-labeled吞噬刺激,摄入的增加率的巨噬细胞吞噬颗粒高预处理比未经处理的细胞(图1 h3)。此外,预处理与乳酸菌导致显著提高巨噬细胞吞噬作用的效率比未经处理的细胞(图中观察到3 (b))。乳酸菌helveticusIMAU70129和l .干酪乳杆菌IMAU60214强烈激活巨噬细胞的吞噬功能。然而,总之,所有的乳酸菌菌株产生了积极的影响的摄入FITC-labeled细菌,包括金黄色葡萄球菌,美国沙门氏菌感染,大肠杆菌由人类巨噬细胞和酵母(酵母聚糖)(图3 (c))。

3.4。杀菌活性

巨噬细胞被感染中描述的材料和方法。如图4preincubating人类巨噬细胞为120分钟heat-killed乳酸菌诱导减少数量的可行的细胞内美国沙门氏菌感染(图4(一))。这种治疗的影响杀菌活性在细胞治疗所观察到的类似大肠杆菌(图4 (b)),金黄色葡萄球菌(图4 (c))。此外,这些结果表明,这些影响在不同的物种是没有区别的乳酸菌。综上所述,这些数据确认乳酸菌细菌限制这些病原体的生存。

3.5。乳酸菌细菌引起的易位NF -κB

各种促炎和抗炎细胞因子,调节至少部分的转录激活剂NF -k如图5,激活和易位NF -kB pp65被诱导巨噬细胞与乳酸菌(图的挑战5(一个))。NF -的表达kB易位因子在60%以上的细胞孵化(图30分钟后治疗5 (b))。在巨噬细胞和酵母聚糖刺激,超过90%的细胞表达了这个因素。然而,在未经处理的巨噬细胞,大约20%的细胞表达(图5)。综上所述,这些表明heat-killed乳酸菌激活NF -的表达kpp65 B因素。

3.6。TLR2介导的识别乳酸菌

我们接下来试图确定是否TLR2被乳酸菌在HEK293细胞刺激。结果表明,引发诱导的浓度与heat-killed应对挑战乳酸菌是类似于由TLR2的受体激动剂,酵母聚糖和英国网球协会(图6)。此外,验证乳酸菌扮演一个角色在TLR2识别在人类巨噬细胞炎症反应,我们执行一个阻塞分析运用anti-hTLR2-IgA抗体的浓度为10μ克/毫升30分钟,然后添加刺激。如图624小时后,引发的生产几乎完全由所有菌株的抑制乳酸菌。这种抑制作用引发生产也是TLR2受体激动剂配体诱导的酵母聚糖和英国网球协会。这些结果表明,TLR2参与cytokine-mediated促炎反应。

4所示。讨论

在肠道内稳态,巨噬细胞发挥重要作用作为免疫哨兵在胃肠道25]。大多数这些细胞渗透固有层,产生各种各样的分子(细胞因子)调节和激活先天免疫反应。巨噬细胞浸润,来源于单核细胞、肠可能引发炎症反应,感染,和内稳态的破坏这些细胞可能导致慢性炎性疾病的免疫损伤观察(26]。几个团体提出,可以恢复肠道内稳态管理补充含有发酵乳制品和有益微生物(益生菌)等乳酸菌。在这项研究中,我们评估了四个益生菌属免疫的影响乳酸菌(例如,喂食GG,喂食逗留一番,l . helveticusIMAU70129,l .干酪乳杆菌IMAU60214)诱导的炎症介质的合成,包括活性氧。ROS一直在强调个人的免疫作用与蛋白质合成所需的生化机械缺陷。ROS实体都是有毒物质,有害的影响各种各样的病原体,如真菌、寄生虫和细菌(27]。激活单核吞噬细胞(即。,monocytes and macrophages) are the main source of microbicidal ROS. We demonstrated that in macrophages, the production of ROS in response to challenge with lactic bacteria was dependent on the concentration and species of bacteria. Both of the probiotic bacteria used in this study (l .干酪乳杆菌IMAU60214和l . helveticusIMAU70129)诱导活性氧的最高水平在人类巨噬细胞获得健康的主机。支持这些结果,Marcinkiewicz et al。28]表明,活性氧产量也诱导小鼠巨噬细胞刺激与乳酸菌。同样,生产新乳酸菌与活性氧分子反应机制il - 12的合成(29日]。

相比之下,其他的调查表明,提取LGG和自由l . paracasei有抗氧化活性在细胞生长的超氧化物歧化酶(30.]。生物效应的变化产生不同的益生菌可能与很多因素有关,如分泌的因素,包括细菌素、乳酸、短链脂肪酸,和SOD活性的存在。不同的研究报道,不同乳酸菌的益生菌影响物种影响各种蜂窝组件的免疫调节能力先天和黏膜免疫系统,如T、B、NK淋巴细胞(31日]。我们证明了heat-killed乳酸菌喂食GG,喂食KLSD,l . helveticusIMAU70129,l。干酪乳杆菌IMAU60214诱导细胞因子的生产引发人类巨噬细胞。趋化因子在别人的招聘起着非常重要的作用的免疫细胞在炎症反应(32]。产生趋化因子引发在乳酸菌的交互和巨噬细胞的早期阶段(即。,within 6 h of stimulation), and this response was sustained for 24 h at much higher levels (> 2000 pg/ml) than that of the production of other cytokines analyzed in this study. In similar studies, other authors have demonstrated that the TH1 lymphocytes display chemotaxis in response to the expression of the IL-8 mRNA and other soluble factors derived from LGG [33]。相比之下,江et al。34]表明,引发合成时没有诱导上皮肠线(即。,T84 CaCo2和HT-29)和THP-1单核细胞被刺激这种l .。这些差异是由不同的研究模型和使用的类型的细胞。在当前的研究中,我们也证明了TNF -α和引发类似的诱导和他们保持24小时的高水平。两种肿瘤坏死因子-α起到了非常重要的生物作用和引发蛋白质调节巨噬细胞的炎症反应35]。这些结果共同表明,益生菌菌株在本研究分析对高水平的细胞因子的合成免疫刺激性影响,包括il - 6、il - 12、il - 1β在人类巨噬细胞,至少24小时。本研究的一个有趣的结果是,il - 1的生产β起着非常重要的作用在T淋巴细胞功能的聚集有关,不是反应诱导的菌株。乳酸菌的影响部分的调节免疫反应诱导il - 10的合成,这是观察到高水平在24 h后刺激。il - 10也被证明在慢性胃肠道疾病中发挥作用,益生菌及其调制的一直在观察溃疡性结肠炎患者和炎症性肠病(36]。毫无疑问,il - 10会使炎性级联。我们也证明了这些乳酸细菌会影响巨噬细胞的吞噬活动与细胞外病原体等金黄色葡萄球菌和大肠杆菌和细胞内病原体等美国沙门氏菌感染。支持这些结果,先前的研究表明,在小鼠模型中补充营养l .杆菌1.557 CGMC 20天增强巨噬细胞吞噬活动(37]。此外,Kausahal et al。38)表明,嗜酸乳杆菌和双歧杆菌bifidum改善衰老小鼠巨噬细胞的吞噬潜力。然而,信号引起的生产一些介质,如细胞因子,包括下游转录因子的激活,如NF -kB (39]。在目前的工作中,我们证明了NF -kB激活炎症反应,以应对heat-inactivated乳酸菌。类似的报道表明,刺激l .干酪乳杆菌诱导MAPK和NF -kB信号通路,与细胞因子的分泌TNF -α和从小鼠脾细胞il - 1240]。喂食GG也启动了信号级联包括NF -kB和STAT信号通路在人类巨噬细胞。在这项研究中,我们还发现,结合NF -的激活kB, TLR2也扮演着重要的角色通过激活引发的合成HEK-hTLR2细胞对外界刺激的反应通过乳酸菌(乳杆菌GG,喂食KLSD,l . helveticuIMAU70129,l .干酪乳杆菌IMAU60214)。相比之下,师大et al。41)报道,PGN来自l . jonhsonii和l .杆菌通过TLR2-dependent和独立的机制产生抑制效应。在其他的研究中,利用小鼠巨噬细胞,刺激LTA扭转的能力一些乳酸菌菌株诱导il - 12的合成增加il - 10的生产通过一种机制涉及ERK的活化依赖家庭影响TLR2的激活(42]。其他调查也表明,可行的免疫调节和冻干乳酸菌产生不同的影响,这些差异部分归因于toll样受体的参与而不是TLR4和TLR9识别43]。

最后,调查机制激活巨噬细胞的乳酸菌益生菌是重要的,这样的研究结果显示,这组乳酸细菌,包括乳杆菌GG,喂食KLSD,l . helveticuIMAU70129,l .干酪乳杆菌IMAU60214,潜在的佐剂对宿主生物体的免疫反应的影响。

5。结论

四个heat-killed乳酸菌益生菌菌株对免疫刺激性属性通过激活巨噬细胞的体外炎症反应通过涉及促炎介质的合成机制,包括细胞因子、ROS,和参与信号级联,如NF -kB和TLR2通路。这些观察表明,heat-killed益生菌的特性可以提高先天免疫反应。但是,体外测试不一定代表体内可能发生,所以它是重要的评价益生菌的作用与免疫抑制动物模型和临床研究。根据获得的结果,这些益生菌作为潜在的免疫调制剂的影响免疫功能不全的主机可以评估。

缩写

PRRs:	模式识别受体
通常:	toll样受体
mamp:	Microbe-associated分子模式。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Rocha-Ramirez LM和Perez-Solano RA研究构思,Eslava C导致其实验设计。Rocha-Ramirez LM和Eslava C写的手稿。Eslava C和加西亚Garibay M参与修订手稿。吞噬作用和杀菌活性实验由Castanon-Alonso SL。细胞培养和人类巨噬细胞是由拉米雷斯帕切科a细胞因子水平量化(ELISA)莫雷诺格雷罗州SS免疫荧光分析用于评估NF -kB表达和chemilumiscence是由Rocha-Ramirez LM和佩雷斯索拉诺RA。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持由洋底墨西哥联邦(/ 2011/007 SSA.929和他/ 2014/013 SSA.1120)。