文摘
哮喘管理的一个未满足的需求是一种新的治疗剂与抗炎和anti-smooth肌肉(ASM)重构效果。甘露糖受体(MR)的家庭中扮演一个重要的角色在过敏原主要过敏原Der p的吸收和处理1和恶魔d 1。我们以前报道,ASM细胞表达甘露糖受体(ASM-MR)和甘露聚糖来自酿酒酵母(SC-MN)抑制mannosyl-rich溶酶体hydrolase-induced牛ASM细胞增殖。使用人性化的转基因小鼠应变(huASM-MRC2)表达人类MRC2受体SM的修复方式,我们已经表明,ASM /增生肥大可能发生早在15天后过敏原挑战与SC-MN这老鼠模型,这种现象是可以预防治疗。这个概念验证研究将有利于未来发展的一个潜在的哮喘治疗代理人双重作用的抗炎和anti-smooth肌肉重建效果。
1。介绍
当前可用的哮喘治疗有效控制炎症但无效的控制气管平滑肌(ASM)重塑的病理变化可能发生在年轻的时候(1,2]。因此,抗炎剂能成功地抑制ASM装修非常可取的减少与哮喘有关的发病率和死亡率。
已经被越来越多的兴趣生活治疗用途的微生物(益生菌)对许多人类疾病,包括哮喘(3- - - - - -5]。同样,益生元是无生命的和消化多糖可以在主机有有益的影响。多个mannose-rich低聚糖能够阻止抗原驱动T细胞增殖和抗原摄取和演示(6,7]。芦荟植物诱导成熟的树突细胞,乙酰化甘露聚糖(8),抑制肿瘤细胞的增殖反应影响T淋巴细胞的表达(9]。自从发现啤酒美索不达米亚的农民酿酒酵母(啤酒和面包酵母)是定量和经济上最重要的一组微生物利用食品和酒精饮料。甘露聚糖来自酿酒酵母甘露糖(SC-MN)生命起源以前的聚合物(Man9 Gln残渣,连接α联系),组成细胞壁的45%酿酒酵母(10]。
甘露糖受体(MR)家族是一个错综复杂的一部分先天免疫和稳态间隙系统(11),扮演着一个重要的角色在吸收和处理的主要过敏原Der p和恶魔d 1,尽管这些抗原的结合位点不同(12,13]。我们以前报道,气道平滑肌细胞表达甘露糖受体(ASM-MR) [14)和牛ASM SC-MN可以抑制细胞增殖引起的内源性mannosyl-rich先生配体如溶酶体水解酶(β-hexosaminidases十六进制A和B和十六进制β葡萄糖醛酸酶)[15]。
在小鼠过敏性哮喘模型中,分枝杆菌酰基链和甘露糖组lipoglycans已被证明抑制过敏性疾病,增加从颈部淋巴结和脾细胞il - 10分泌16]。我们选择调查的影响SC-MN因为甘露聚糖从病原微生物能够诱发IL-17生产(17]。然而,这是不正确的SC-MN [17),使其有吸引力的治疗代理作为其有益效果可以达到没有IL-17-driven炎症。我们在研究中证实了这一发现,以及记录缺乏诱导小鼠的肺IL-13生产能力尽管潜在问题的能力调节树突细胞T的函数H2极化[18]。此外,IL-33 SC-MN没有影响,可以刺激组2先天淋巴细胞重要的真菌过敏(19]。
这里,我们目前的证据表明,通过克隆huASM-MRC2和人性化的转基因小鼠模型的发展,过度的huASM-MRC2导致加速ASM重构和SC-MN可以提供双重抗炎和anti-smooth肌肉重建的好处。
2。材料和方法
2.1。动物,克隆huASM-MRC2,转基因结构
批准的协议都是田纳西大学健康科学中心(UTHSC)机构生物安全委员会和动物保健和使用委员会制度。野生型(WT) FVB / NJ和BALB / c从查尔斯河实验室或购买杰克逊实验室和安置在一个无菌UTHSC植物园。克隆人类ASM-MRC2通过rt - pcr引物设计从cDNA MRC2和mRNA隔绝人类支气管ASM细胞。人类ASM-MR cDNA(5658个基点)99%相同的EST克隆KIAA0709(5641个基点;成人大脑),编码区是一样的,MRC2 cDNA (Endo180, 4639个基点)。全长cDNA huASM-MRC2编码地区的重建,和转基因小鼠模型overexpressing huASM-MRC2光滑的阳性SM22α基因催化剂开发为目的的测试他们对过敏性哮喘表型。意识和反义寡核苷酸引物设计基于SM22的沉积序列α基因(5′地区和外显子1;3892个基点;加入U36589)。后第三网站添加到两个引物的5′端用于克隆。502 bp片段引物被用来生成一个包含445个基点SM22α启动子包括外显子1 (20.通过PCR老鼠基因组DNA。启动子片段被结扎的5′末端的全长编码区ASM-MR cDNA(4437个基点)质粒pCR 3.1单,并包含一个片段β球蛋白基因内区和聚腺苷酸化信号(1.2 kb)结扎ASM-MR cDNA的3′末端。6.2 kb转基因片段与限制性内切核酸酶切除中外我和用于生成转基因老鼠在FVB /新泽西的压力。
转基因小鼠(FVB / NJ)然后backcrossed到一个容易过敏的BALB / c应变,和N10代年龄6 - 8周的老鼠被用于这项研究。转基因表达被证实使用qPCR Transnetyx Inc .(美国孟菲斯,TN):目标序列3′-cagcgaggacctatgtgctctgccctacacgaggtctacaccatccagggaaactcccacggaaagccg-5′。
平滑肌重塑研究小鼠qPCR信号值在7.5和13.0之间。
2.2。过敏原致敏和挑战
WT BALB / c或人性化的转基因小鼠OVA-immunized与20 0和14天μg卵子(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在Imject®明矾(美国皮尔斯,罗克福德,IL) [21),i.p。;没有免疫小鼠(敏感)收到明矾。增加血清OVA-specific IgE水平在第一天与天21日被证实使用ELISA (AbD Serotec,牛津大学,英国)。响应老鼠(锗硅≥500 ng / ml)使用控制盐水或SC-MN(σ,准备专利用于哮喘的治疗,内毒素水平< 2欧盟/毫升)30分钟在卵子挑战天28日29日和30 (100μ在25 g卵子i.n.μl磷酸盐(PBS)。
2.3。气道生理测量
评估孤立胸流,区分双室(Buxco)被用来排除鼻气道阻力。有意识的自发呼吸动物被重新训练室分析thoracic-specific气道阻力(sRaw)针对雾化盐水或升级剂量的妇幼保健(-25 - 2.5毫克/毫升,1毫升)3分钟(22]。监测读数平均每次雾化后的5分钟。
2.4。脂质体结构
脂质体是由蒸发方法使用不同摩尔比的公司:胆固醇:DSPE-PEG2000(例如,50:45:5)(乔治·c·伍德博士制药科学系的,UTHSC)。适当数量的脂质和近红外荧光染料(DiIC18 = DiR)溶解在1:9溶剂氯仿和甲醇的混合物。混合物的蒸发在40°C下真空Rota-evaporator一夜之间100 rpm。脂质膜水化在65°C和消息灵通的缓冲区包含0.15 M氯化钠和10毫米EDTA在100 rpm的Rota-evaporator 2小时。由此产生的荧光脂质体很大multilamellar囊泡约为0.8 - -1.0μm。根据所需泡大小,脂质体被挤压通过堆叠nucleopore过滤器总共6 - 10,生产单膜脂质体的粒径分布窄。执行PEG-maleimide脂质体的靶向cRGD肽通过共价耦合硫酯键形成脂质体的马来酰亚胺组和循环之间RGD (23]。
2.5。荧光反射成像(星期五)
32天,48小时后卵子挑战,老鼠使用isofluorane麻醉。荧光脂质体(dir)(800海里,90μg / ml, 25岁μl,每个鼻孔,i.n。)或荧光cRGD-liposome (dir) (80 nm, 20μg / ml, 200μl,老鼠增长值)管理。成像过程进行,6,24小时postadministration固定基准标记的荧光脂质体光学成像与不同染料浓度作为标准。星期五系统包括一个液氮CCD相机(光度Chemipro Roper科学,特伦顿,新泽西州)安装到darkbox和快门安装滤光轮(萨特工具有限公司,λ滤光片10变换器,诺瓦托,CA),允许多个激发过滤器通过软件控制(唐宁敦Metamorph,通用成像,PA)。一个激发过滤器集中在710 nm(浓度技术Corp .)为Rockingham市增加,VT)和3-cavity窄的带通滤波器(10 nm光谱宽度)在峰波(780海里)(安多弗萨勒姆,NH)被用来可视化近红外光。生物自发荧光区域大约是400 - 600 nm波长,因此,DiR信号能够被自体荧光检测不受干扰。
2.6。支气管肺泡灌洗(BAL)和肺组织收集
支气管肺泡灌洗进行0.5毫升的温暖PBS (37°C)下氯胺酮和甲苯噻嗪镇静(100毫克/公斤)。细胞计数是由cytospin, BAL游离液(BALF)存储在−80°C。总肺组织均质1毫升含有蛋白酶抑制剂的PBS鸡尾酒(σ)冰。蛋白质被使用布拉德福德量化分析工具(热费希尔)。落下帷幕的液体和肺匀浆细胞因子的分析Quantikine酶联免疫试剂盒研发系统根据制造商的指示。Muc5ac在BAL流体分析的酶联免疫试剂盒(USCN生命科学。公司,休斯顿,德克萨斯州)根据制造商的指示。
2.7。有关酶联免疫斑点分析il - 10
天真的老鼠一旦与SC-MN(80毫克/公斤)或生理盐水,通过强饲法。18小时后,BAL细胞和未经选择的脾细胞(1×105细胞/每个细胞类型)镀上一个微孔微量滴定板有关酶联免疫斑点分析il - 10。细胞被刺激有或没有SC-MN(1毫克/毫升)和培养72小时37°C有限公司2孵化器(5%股份有限公司2空气/ 95%)。IL-10-producing细胞被确定后,制造商的指令(BD Pharmingen)和发送BD生物科学分析服务。
2.8。组织学、免疫组织化学、组织化学和分析
老鼠牺牲(麻醉下颈椎脱位),用4%多聚甲醛灌注。石蜡包埋气管和肺组织部分被削减时10μm)染色、免疫组织化学是平滑肌isoactin执行,阿尔新blue-periodic酸希夫(PAS)污渍被用于mucin-containing杯状细胞。平滑肌α-isoactin探测的α平滑肌肉肌动蛋白抗体克隆1 a4根据制造商的指示使用工具包(σ)。所有幻灯片都扫描使用ScanScope®XT为0.25μ米/像素的分辨率(~ 400 x放大)。气管trachealis肌肉的横截面进行了分析区域38天,45岁,52。分析了小气道平滑肌区域通过选择3 - 5小气道分支代表性的削减(120 - 300年μ在天45 m管径)。数据收集和分析盲法(使用信托标志200 = 5 - 6小鼠)μ平均(身份证)呼吸道口径和31416μ米2腔的面积。平均每个数据点代表一个值从一个鼠标。
2.9。统计分析
所有动物实验重复三次。数据表示为均值或中位数±95%可信区间(PC200R,挑衅methylcholine浓度影响气道阻力增加200%)或平均数±标准差(SEM)及克鲁斯卡尔-沃利斯的分析测试之后,事后未配对的测试数据或单向方差分析后跟Dunnett事后测试使用棱镜6软件(GraphPad,圣地亚哥,CA)。对于星期五数据,软件(唐宁敦Metamorph,通用成像,PA)被用来量化的荧光强度。值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。抗炎作用的SC-MN OVA-Allergic WT BALB / c小鼠
SC-MN全局视图的抗炎作用,我们采用全身成像系统来识别网站的炎症;荧光循环arginine-glycine-aspartic酸- (cRGD)标记为脂质体被用来检测整合素upregulation炎症的标志。静脉注射(注射)管理cRGD首先引入了颈部淋巴结和肺部OVA-allergic老鼠,由鼻内部分减轻(i.n)管理SC-MN治疗。信号淋巴结的上限是4倍的信号在肺部。循环RGD归航颈部淋巴结和肺是著名的控制或SC-MN治疗小鼠(相比数字1(一),1 (b),1 (c),1 (d),1 (e),1 (f)),这表明SC-MN治疗抑制炎症的引流淋巴结和肺。鼻内预处理与SC-MN(1毫克,每三个卵子的挑战之前30分钟)抑制过敏性气道炎症允许i.n.管理达到SC-MN-pretreated过敏小鼠的肺脂质体,相比小的脂质体沉积控制过敏小鼠的肺(数字2(一个),2 (b),2 (c),2 (d),2 (e),2 (f),2 (g),2 (h))。这一发现可能是由于黏膜纤毛的清除脂质体粒子治疗过敏红肿的航空公司的老鼠。过敏小鼠使用SC-MN显示显著抑制细胞渗透(表1)。
类似于报告lipoglycan [16),SC-MN可以刺激细胞因子il - 10的监管,如表所示2。
确认SC-MN不会引起有害影响IL-17生产(17),TH2极化[18),或IL-33生产可以刺激ILC2细胞(19],我们测量IL-13 IL-17, il - 22生成,IL-33 BALF和肺匀浆上清液在天真的BALB / c小鼠每日SC-MN(或盐水)连续3天。没有增加任何上述细胞因子在SC-MN -治疗天真的BALB / c小鼠肺匀浆上清液:IL-13, 115±82比51±11;IL-17 125±31和123±28;il - 22生成时,8±7和8±9;IL-33, 5792±2012和5553±1257 pg /毫克蛋白(生理盐水和SC-MN组,分别地。 老鼠)。同样,没有明显的区别这些BALF中细胞因子测定两组。
3.2。SC-MN对气道粘蛋白的影响
粘液分泌过多的杯状细胞是哮喘的一个特点,从而导致气道阻塞和发病率增加24]。SC-MN的影响上气道中性粘蛋白是检查midlung PAS染色的部分(图3);存储粘蛋白在上皮被SC-MN抑制过敏小鼠(59 - 81%抑制, )。Muc5ac在平衡液蛋白质含量显著升高过敏小鼠被有效地抑制SC-MN治疗(图4)。
3.3。抑制的AHR SC-MN(鼻内)WT BALB / c小鼠过敏
基于初步剂量反应研究(6-60毫克/公斤),我们选择了45毫克/公斤作为最佳有效剂量SC-MN针对ASM细胞和胸sRaw参数。老鼠用SC-MN预处理(45毫克/公斤,i.n。,30. min before OVA challenges) showed significantly blunted AHR, measured by PC200R (provocative Mch concentration effecting a 200% increase in airway resistance), compared to untreated allergic mice (OVA group) (Figure5)。
3.4。加速ASM huASM-MRC2小鼠模型重构
Groneberg等人已经证明了气道平滑肌重构在OVA-allergic使用长期BALB / c小鼠,labor-intense协议(24]。我们已经开发出一种小鼠模型大幅度缩短过程从共有163天到45天(数字6(一)和6 (b))。Trachealis肌肉OVA-sensitized OVA-challenged老鼠保持不变,WT(数据没有显示)和Tg-negative同窝出生仔畜对照组52(图在一天6 (b))。转基因老鼠的AHR过敏转向左边的胸气道阻力曲线(妇幼保健灵敏度)相比Tg-negative同窝出生仔畜控制过敏小鼠(图6 (c))。最大剂量的妇幼保健(25毫克/毫升),无数次的Tg +过敏小鼠拒绝从数据采集由于浅呼吸困难。
(一)
(b)
(c)
3.5。抑制大型和小型气管平滑肌重构和光滑的AHR SC-MN阳性huASM-MRC2转基因小鼠过敏
的水平β十六进制BAL流体的过敏小鼠是3倍的天真的同行(数据未显示)。阻塞ASM-MR /检查的影响β使用SC-MN -Hex-mediated重塑,通用过敏原卵被用来诱导过敏性炎症在转基因小鼠。大大小小的SC-MN不仅显著地抑制气道平滑肌质量(数据7和8),但也抑制了增加数量的小气道平滑肌细胞核(图8 (d))。SC-MN治疗(45毫克/公斤)显著减少恢复PC200R在转基因小鼠过敏(图9)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
在这项研究中,我们演示了SC-MN在抑制炎症的功效包括储存和分泌粘蛋白和气道代WT BALB / c小鼠过敏。此外,我们新开发的转基因huASM-MRC2小鼠模型使我们能够证明ASM重构在合理的实验时间,相比其它模型(25),由SC-MN成功修改。气道代也抑制了在这个模型。气道重塑在这个模型中显示两个元素:(1)加速ASM质量和增加(2)ASM扩散,由ASM核数表示。被SC-MN有效抑制这两种元素,符合antimitogenic /抗增殖效益在牛ASM细胞(15]。
甘露糖受体阻滞剂、甘露聚糖、抒发结构和微分响应对话框进行更多在树突细胞(26]。例如,反应单体的订婚mannan-MR刺激干扰素-γ白介素、帮助宿主对病原体的免疫调节TH2微环境。另一方面,分枝杆菌lipoglycans有脂质附属物倾向于总夫人和抑制干扰素-γ和白介素生产,导致宿主免疫抑制。SC-MN准备用于本研究缺乏酰基半个(两代情极性脂质inc .)分析证实了服务)。因此,高剂量的SC-MN比lipoglycans [16)是需要发挥抗炎作用。关于抗炎的机制,单剂量口服SC-MN天真FVB /新泽西老鼠,紧随其后在体外刺激与SC-MN 72人力资源,导致通过平衡细胞和脾细胞il - 10生产。塞耶斯等。也报道了一个健壮的il - 10的感应lipoglycan从过敏小鼠脾细胞和纵隔淋巴结使用anti-CD3 / CD28刺激在体外(16]。然而,转基因超表达的il - 10可能导致肺纤维化,表明il - 10过剩的潜在有害影响超出其有益的免疫调节作用[27]。有多种优势的SC-MN甘露聚糖从其他来源:SC-MN水溶性和分子质量相对较小(36 kD)比锰索芦荟(1000 kD) (8]。另外,从其他来源和MN,乙酰化甘露聚糖β联系,很可能是抗原(28]。
我们的研究结果强调的一个重要角色huASM-MRC2(系统守恒的模式识别受体)编码在chromosome17q23.2 ORMDL3 17 q12-21附近的致病性变异增加哮喘的风险(29日]。因此,先生家庭的成员,内源性配体和受体阻滞剂可以利用人类哮喘和其他疾病的治疗。糖蛋白的配体,家庭成员可能与偏爱不同的绑定到不同的领域(30.),和每个成员的具体功能可能不同取决于配体的类型,细胞和组织。例如,复杂protease-resistant内生糖蛋白结合先生的高亲和性结合域(CTLD4-5),而通过CTLD4-8 SC-MN绑定(14]。单核苷酸多态性(snp)与哮喘有关的MRC1已经在日本和非洲裔人口(31日]。调查以确定MRC2 SNPs和哮喘之间可能存在的相关性正在进行中。它是合理的假设一个家庭的受体与这样一个复杂的角色先天和过继免疫以及自我平衡的间隙可以在免疫调节发挥重要作用。最近,基因变异的糖蛋白,影响血清水平的各自的糖蛋白,在哮喘的重要因素[已报告32]。关于先生的糖蛋白内源性配体,β己糖胺酶水平显著升高血清中严重的哮喘病人(33]。也有越来越多聚糖和glycan-binding蛋白的免疫调节能力的兴趣如泌乳激素,selectins (c型凝集素,是一种配体L-selectin) (34],siglecs [35]。
总之,生命起源以前的甘露糖受体阻滞剂SC-MN是一种很有前途的代理可以在哮喘呈现双重好处:抗炎和anti-smooth肌肉重塑的大型和小型航空公司。
缩写
| :气道高反应性 | 气道代 |
| ASM: | 气道平滑肌 |
| 拜尔港: | 支气管肺泡灌洗 |
| βA和B十六进制: | β己糖胺酶A和B(又名娜迦(n -乙酰-βD-glucosaminidase)、唠叨和“) |
| CCD: | 电荷耦合器件 |
| CTLD: | 这种(calcium-dependent绑定)lectin-like域 |
| cRGD: | 循环arginine-glycine-aspartic酸(D) |
| DiR: | DiIC18-indotricarbocyanine iodide-phycoerythrin |
| DSPE-PEG: | 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylene乙二醇 |
| 星期五: | 荧光反射成像 |
| huASM-MRC2: | 甘露糖受体c -型2从人类气管平滑肌细胞克隆 |
| MRC1: | 这种甘露糖受体1 (CD206,巨噬细胞甘露糖受体) |
| MRC2: | 这种甘露糖受体2 (CD280 Endo180,尿激酶纤溶酶原激活物receptor-associated蛋白质) |
| 卵巢: | 卵清蛋白 |
| PC200R: | 挑衅醋甲胆碱(methylcholine)浓度影响气道阻力增加了200% |
| PC: | 磷脂酰胆碱 |
| SC-MN: | 甘露聚糖来自酿酒酵母。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者希望承认博士埃里克粗毛格子围巾,亚历山德拉维'Azzo博士和圣裘德儿童研究医院转基因核心设施huASM-MRC2转基因小鼠发展;乔治·c·伍德博士(UTHSC制药科学系的)脂质体建设;伊丽莎白·a .击发弹博士(UTHSC、生物统计学和流行病学)统计咨询;组织学在UTHSC数字化服务的核心;和玉玲赵,伊桑Stranch,格雷戈里·麦格劳,阿什利·罗伯森,朱莉Chang技术援助。这项工作的部分支持由美国过敏、哮喘和免疫学/安内特(d .贝蒂卢),NIH R01HL56812和R41HL090108 (d .贝蒂卢),田纳西大学研究Foundation-Cumberland制药和新兴技术(d .贝蒂卢),和田纳西大学临床转化科学研究所(d .贝蒂卢)。