文摘

霍乱弧菌霍乱的病原体,每年导致全球成千上万人的死亡。两个因素在这种细菌的发病机制是其纤毛和鞭毛。的主要单元pili TcpA、TcpB FlaA鞭毛的组成单元。在这项研究中,我们研究了菌毛和鞭毛的能力单元来刺激小鼠的免疫反应。TcpA放大后,TcpB FlaA使用PCR基因,他们克隆表达质粒。上述蛋白质通过IPTG生产后,蛋白质纯化,然后用免疫印迹方法得到批准。后注射纯化蛋白的小鼠模型,免疫反应刺激被测量的水平评估IgG1 IgG2a抗体滴度,IL5和干扰素-γ。免疫反应的刺激与菌毛和鞭毛抗原是足够的。考虑到高水平的IL5效价和IgG1抗体,对Th1刺激免疫反应。体液免疫反应的刺激是预防霍乱的关键重要性。我们的免疫分析显示适当的免疫反应与重组蛋白疫苗接种后小鼠模型。IL5的高水平和低水平的干扰素-γ显示Th2细胞的活化反应。

1。介绍

霍乱弧菌是一种非侵入性,革兰氏阴性细菌引起人类急性胃肠炎。数以百万计的世界各地的人们遭受霍乱、和死亡率每年100000多例报道从这种疾病1,2]。

细菌的主要结构在疾病过程中起着重要的作用包括细菌毒素,细胞壁,鞭毛,菌毛3,4]。纤毛的开发和发展过程中起着重要作用的感染。一些蛋白质参与纤毛的形成,但只有有限数量的细菌细胞表面。其中最重要的蛋白质毒素coregulated纤毛亚基(TcpA)和TcpB [5]。几项研究已经表明,抗体TcpA TcpB可以影响免疫原性降低霍乱弧菌殖民。一项研究由Rollenhagen et al。(2006)表明,免疫的小鼠菌毛蛋白蛋白可以诱导保护性免疫(6,7]。

TcpA能够刺激Th1-type免疫反应,所以Tcp抗原能刺激细胞因子il - 4和生产IgG1抗体。TcpB有有限的信息;这个亚基被认为是有效的免疫反应,霍乱。此外,flagella-A (Fla-A)霍乱弧菌有一个主要角色在疾病的致病性8,9]。

尽管细菌菌毛和鞭毛抗原具有重大意义在霍乱的开发和发展,有一个缺乏研究这些抗原引起的免疫反应的类型。此外,当同时接种,这些抗原的作用尚未研究。因此,本研究的目的是评估对重组蛋白的免疫反应TcpA, TcpB, FlaA或组合的动物模型。

2。材料和方法

2.1。细菌和血清

稻叶型霍乱弧菌(一个礼物来自伊朗的巴斯德研究所)是生长在tcb (thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose琼脂,默克公司,德国)为24小时。重组蛋白生产、原核表达载体pET32a (Novagene)和pGEX4T1。大肠杆菌应变DH5α(Stratagene)首次克隆和使用大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS和大肠杆菌BL21被用作宿主菌株蛋白质产量。

所需的抗生素(氨苄青霉素、氯霉素)被添加到磅媒体根据参考建议10]。我们收到了标准的兔抗霍乱弧菌血清从Tarbiat Modares大学里(微生物学系,德黑兰,伊朗)。所有化学品都来自默克有限公司(德国)。

2.2。基因扩增、表达和纯化的重组蛋白

霍乱弧菌染色体DNA制备根据标准CTAB /生理盐水的方法(11]。

引物设计根据TcpB发表序列(加入数字:FJ209011) TcpA(加入数字:U09807)和FlaA(加入数字:Af019213)霍乱弧菌如下:TcpB:转发:5′TCGGATCCATGAGAAAATACCAA3′和反向:5′CTCGAGATTTTCACACCATTGA3′;TcpA:转发:5′ag)GGATCCATGACATTACTCGAAG-3′和反向:5′aaCTCGAGGCTGTTACCAAATGC-3′;FlaA:转发:5′CTGGATCCATGACCATTAACGTAAA3′和反向:5′CCTCGAGCTGCAATAACGHAGATT3′。所有的引物包含BamHI(前锋)和XhoI(逆转)网站,分别。限制性内切酶网站(下划线)被添加到引物对随后的克隆程序。PCR扩增分析了(分别)和执行水平的琼脂糖凝胶电泳1 x此种缓冲和可视化的溴化乙锭染色紫外透照器。

PCR产品消化BamHI和和结扎XhoI pGEX4T1 (TcpA-pGEX4T1)和pET32a (TcpB-pET32a和FlaA-pET32a),由相同的限制性内切酶消化,使用T4在一夜之间16°C DNA连接酶。大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS主管细胞由氯化钙法和用于转换TcpA-pGEX4T1, TcpB-pET32a,和FlaA-pET32a质粒分别12]。

大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS(改变了TcpB-pET32a和FlaA-pET32a质粒)大肠杆菌由TcpA-pGEX4T1 BL21(转换)是生长在营养肉汤培养基2毫升与氨苄青霉素(100毫克/毫升)补充和氯霉素(35毫克/毫升大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS)在一夜之间摇晃孵化器37°C。在第二天,500人μL文化在50毫升的营养肉汤培养基接种0.5克酵母提取物,1 g bactopepton, 0.1克葡萄糖,0.5克氯化钠,氯化钾0.05克,0.025 g MgCl₂h·6₂啊,0.025 g CaCl₂0.25 g营养肉汤,氨苄青霉素(100毫克/毫升),和氯霉素(35毫克/毫升大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS)在37°C和剧烈搅动在220 rpm。细胞生长,直到OD(光密度)在600 nm达到0.6。表达的重组蛋白诱导的异丙基-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG Fermentas)最后一个1毫米的浓度和孵化了4个小时13]。

TcpB和FlaA纯化使用Ni-NTA列(试剂盒)和TcpA纯化了销售税列(生物学)根据制造商的指示。纯化蛋白两次透析对PBS (pH值7.5)在一夜之间在4°C。纯化重组蛋白的质量和数量进行了分析通过sds - page(15%)和布拉德福德方法,分别。

2.3。免疫印迹分析

证实了的完整性纯化重组蛋白免疫印迹分析。西方墨点法进行根据标准协议(14)利用兔的血清免疫霍乱弧菌和消极的血清(负控制)作为主要的抗体在1:100稀释和HRP-conjugated(辣根过氧化物酶)山羊anti-rabbit免疫球蛋白(英国Abcam) 1: 2500稀释1 x TBST缓冲区(10 x: 15 mMNaCl 10 mMTris-HCl (pH = 7.4), 0.1%渐变20)作为二级抗体。的反应是由diaminobenzidine (DAB)解决方案(罗氏公司、德国)。

2.4。评估对重组蛋白的免疫反应

调查对重组蛋白的免疫反应,六组雄性BALB / c小鼠进行了研究()六周的平均年龄和体重约60 g。的组注射聚丁烯琥珀酸)(PBS、消极控制),TcpA, TcpB, TcpA + TcpB FlaA, TcpA + TcpB + FlaA。注射进行皮内三个剂量的间隔两周。蛋白质的第一剂量注射注射完全弗氏佐剂,,在下一个会议,蛋白质被注射完全弗氏佐剂。每个老鼠注射75μ每注射g的蛋白质。

2.5。从脾脏单核细胞的分离

在免疫后28天,老鼠被公司牺牲₂吸入,脾脏被切除。脾脏在RPMI洗(修改5毫米玫瑰,100 U /毫升的青霉素,和100年μ克/毫升的链霉素(所有从Gibco生命技术公司,盖瑟斯堡,MD)。脾脏被戳破了多次与一对钳释放脾脏细胞。低密度单核细胞分离后收集标准Ficoll-Paque(法玛西亚生物技术,乌普萨拉,瑞典)和洗RPMI heat-inactivated 10%胎牛血清的边后卫。可行的细胞的数量被台盼蓝排斥评估。细胞被resuspended RPMI补充10%的边后卫和用于扩散试验和细胞因子检测。

2.6。细胞因子测定

细胞因子(IL5和干扰素-的水平γ)测定血清和上层的跨国公司(单核细胞)的培养。跨国公司从脾脏分离的小鼠在接种后28天孵化1毫升文化的密度~ 2×106细胞/毫升的存在与否,具体的重组蛋白(20μg / mL)和放置在一个5%的股份有限公司₂72年,37°C孵化器h。定量IFN-gamma IL5作品,上层清液收集和大量IFN-gamma IL5上层清液中被酶联免疫试剂盒量化(研发系统)根据制造商的协议。96 -孔板涂有anti-mouse IFN-gamma和IL5抗体涂层缓冲区和孵化过夜。阻塞后,样品和标准1:2系列稀释IFN-gamma IL10(标准曲线)被添加到盘子和孵化在室温下60分钟。之后,生物素化的anti-mouse IFN-gamma和IL5马伯添加和孵化了60分钟。HRP-conjugated链霉亲和素是30分钟接着说。进一步洗后,三甲衬底被添加到孵化为30分钟,其次是增加0.18 H₂所以₄解决方案停止反应和阅读450海里。

2.7。测量IgG1和IgG2a抗体

抗体ELISA法测量IgG1和IgG2a接种疫苗的动物。在这种方法中,10μ克的重组蛋白TcpA、TcpB FlaA首次绑定在96孔板4 h。洗后,蛋白质被保持在4°C。孵化后2% BSA的解决方案一个小时,阻塞阶段进行。此后,100年μL接种小鼠的血清被添加到每个96孔酶标(NUNC)。盘子被保持在37°C 2 h。洗后,50μL 1/10000稀释抗体IgG1和IgG2a共轭类被添加到合(英国Abcam)和他们保持在37°C 2 h。最后,光吸收波长490 nm决心通过增加100μL (o-phenylenediamine(门诊部当)衬底解决每个孵化了10分钟。

2.8。增生性反应检查由麻省理工

检查扩散通过MTT法(15]。总共1 - 2×10³细胞/在100μL RPMI 1640补充与10%的边后卫刺激20μg / mL特异抗原(TcpA、TcpB FlaA)或1μg / mL PHA(植物凝集素)浓度(有丝分裂原)用于t细胞活化和增殖。板被放置在一个5%的股份有限公司₂72年,37°C孵化器h。10毫升水中5毫克/毫升MTT (3、4、5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化,σ,德国)添加到细胞,其次是孵化4 h。离心后,介质被移除,200μL的DMSO溶液添加到每个。然后,570纳米的光密度是衡量微量滴定板读者(2100年统计传真,美国)。实验进行了一式三份。Blastogenic MTT试验的反应表示为一个意味着刺激指数(SI)除以OD值刺激细胞(C) -相对细胞的数量如果细胞(C)的相对OD值如果细胞。如果= (−C) /。

2.9。统计分析

统计分析包括独立样本以及评估差异变量组。使用Mann-Whitney对比组评估U测试。数据通过SPSS软件分析了版本16.0 (SPSS, Inc .,芝加哥,伊利诺斯州,美国),用平均数±标准差表示。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。表达的蛋白质量

聚合酶链反应(PCR)的结果包括所需的基因片段的大小(数字1(一),1(b)1(c))。测序和分析使用爆炸表示获得序列的准确性。放大DNA片段(TcpA TcpB, FlaA)在pET32a克隆和pGEX4T1向量。

TcpA、TcpB FlaA蛋白质都是在这里生产的大肠杆菌。生产FlaA和TcpA蛋白质纯化使用Ni-NTA工具包和TcpB蛋白纯化使用GST-Sepharose设备;产生的蛋白质在预期的大小。净化后产生的大量蛋白质和透析(PBS缓冲,在pH值7.5)测量是2.1,2,1.5毫克/毫升。免疫印迹蛋白质产生的展出。

根据免疫印迹结果,纯化蛋白对感染兔血清的反应霍乱弧菌。然而,没有观察到反应在健康对照组的血清和正常兔血清免疫印迹(数字2(一),2(b)2(c)。

3.2。细胞因子反应(血清和上层清液)

淋巴细胞产生的细胞因子的类型文化(血清和上层清液)重组蛋白免疫小鼠的决心最后三周后接种。数据3(一个)和3 (b)显示的水平IFN-gamma和IL5培养淋巴细胞(上层清液)的免疫动物。如前所述在图3(一个)IFN-gamma水平增加在所有的研究小组除了FlaA。在图3 (b)曲线,IL5水平较高的实验组相比治疗组。增加,尤其是FlaA和TcpA / B组,高于其他组。在血清(数据4(一)和4 (b)),血清IFN-gamma水平不显著。在图4 (b)曲线,IL5水平更高FlaA相比治疗组。

3.3。抗体反应

血清收集后纯化重组蛋白疫苗接种是评估TcpB, TcpA, FlaA IgG2a和使用ELISA方法IgG1抗体滴度。见数据5(一个)和5 (b)IgG1抗体效价的水平在所有接种组与对照组相比,比IgG2a抗体效价高。在TcpB IgG2a抗体效价水平高于对照组。然而,IgG2a抗体效价水平组接收TcpA / B + FlaA低于对照组。IgG1 IgG2a比图所示5 (c)。

3.4。淋巴细胞增殖

根据结果,最高的细胞响应实验小组观察TcpA + TcpB组。细胞增殖率最低的是指出FlaA组。MTT图可以观察到的结果6。

4所示。讨论

结果表明,菌毛和鞭毛抗原霍乱弧菌免疫后能引起强烈的体液免疫反应。然而,TcpB抗原免疫反应的体液免疫反应。

霍乱是一种急性腹泻疾病所致霍乱弧菌。摄入受污染的水或食物和后殖民的细菌在小肠,毒素是由细菌分泌的,和,因此,病人失去了大量的水和电解质。考虑到高死亡率的疾病,预防是至关重要的,特别是在高危地区(16]。

大量的减毒活疫苗和灭活疫苗已经被研究过,但这些类型的疫苗已经能够成功地阻止这种疾病,特别是在流行地区。因此,更多的注意力被吸引到的亚单位疫苗霍乱弧菌(17]。附着力和能动性的过程中起着非常重要的作用霍乱弧菌传染性(18]。

纤毛和鞭毛是两个重要的结构霍乱弧菌细菌的粘附和能动性。TcpA和TcpB是主要的子单元毛在霍乱弧菌可以看到在其外表面(19]。

TcpA是主要的亚基毛在霍乱弧菌。这种抗原在附件中扮演主要的角色肠道细菌的细胞。在研究蛋白质的合成版本,它已经表明,肽由TcpA诱导小鼠保护性抗体,这些抗体具有较高的保护作用。然而,对这种蛋白质的抗体效价不高的接种减毒活疫苗和灭活疫苗,这是由于这种抗原的急剧下降霍乱弧菌文化(20.]。

TcpB是另一个组成部分毛和附件的帮助吗霍乱弧菌肠道细胞。尽管研究TcpA的免疫原性,只有一些研究TcpB子公司亚基的免疫原性。只有Kiaie等人的研究表明,TcpB抗体存在于霍乱病人以及在动物接种杀死细菌21]。

除了附着力,能动性的霍乱弧菌被认为是细菌致病性的最重要的指标之一。鞭毛发挥关键作用的细菌进入细菌殖民化的位置。证实,突变体是没有鞭毛不能引起感染。根据前研究,鞭毛能增强等致病性基因基因编码的表达霍乱毒素(CT),菌毛基因编码(TCP),和其他基因参与了这种疾病。因此,鞭毛霍乱弧菌免疫学研究是一个合适的主题(22- - - - - -24]。

FlaA是最重要组成部分的鞭毛的外表面。这种蛋白质是公认的正常免疫反应系统,这样身体的第一道防线将对细菌反应。在2008年进行的一项研究中,据透露,重组鞭毛霍乱弧菌能够刺激IL8生产通过toll样受体的激活5 (TLR5)和核转录因子k b .因此,鞭毛的霍乱弧菌被认为是免疫系统的一个主要目标,作为toll样受体的配体,也就是说,TLR5,宿主的免疫细胞。TLR5刺激由各种病原体导致激活先天免疫应答的,反过来,适应性免疫(25]。

在纤毛和鞭毛抗原免疫原性的研究,分别研究了抗原的免疫原性的影响。在目前的研究中,这些抗原的免疫原性进行了研究。接种组和TcpA(包括六组)小鼠接种疫苗,TcpB, FlaA, TcpA + TcpB, TcpA + TcpB + FlaA。免疫的全部课程后,体液免疫和细胞免疫组进行评估。

评价细胞因子反应与重组蛋白质TcpA刺激脾细胞后,TcpB, FlaA展出这些蛋白质的能力产生IFN-gamma和IL5。刺激的生产水平IFN-gamma后刺激小鼠免疫的淋巴细胞蛋白质TcpA TcpB可以观察到。此外,IFN-gamma生产的最低水平与FlaA观察小鼠免疫。然而,在小鼠免疫的三种蛋白质(TcpA + TcpB + FlaA)的水平相比FlaA组IFN-gamma略有增加。

测量免疫小鼠的血清IFN-gamma显示组之间没有明显不同。

IL5产量接种组观察表明,细胞因子生产的最高水平与FlaA蛋白免疫小鼠。IL5水平血清和细胞培养接种疫苗的动物增加。统计结果还表明从FlaA组获得价值小于0.05。IL5在细胞培养和血清的老鼠FlaA超过这个水平的细胞因子治疗组。然而,IL5水平的细胞培养TcpB组低于其他组。此外,IL5水平的血清TcpB和TcpA + TcpB和TcpA + TcpB + FlaA组低于对照组。

因此,根据结果对细胞因子(淋巴细胞文化),它表明,免疫系统在TcpA和FlaA组织体液免疫反应倾向,而TcpB驱动离体液免疫的免疫反应。

IgG1和IgG2a抗体滴度的水平研究组织部分证实细胞因子的结果。IgG1抗体效价增加了所有的研究团体。此外,IgG1效价高的组接受FlaA和TcpA蛋白质,这样IgG1 IgG2a比在这些团体不止一个。增加水平IgG1效价也指出TcpB组。可以观察到抗体效价的提升水平即使在组织收到了几个与TcpB抗原。

高水平的IgG2a效价可以清楚地观察到TcpB组。此外,增加可观测到的组织的抗原注射其他抗原,特别是在TcpA + TcpB组。FlaA + TcpA / B组,这种抗体的水平低于治疗组。

IgG1 IgG2a比研究小组表明,组织接种FlaA和TcpA抗原,这一比例高于1。然而,这个比例还不到一个TcpB组。与其他抗原结合TcpB降低这一比例,与其他组相比。

高水平的IgG2a效价和IFN-gamma观察组与TcpB接种疫苗。因此,推断,TcpB主要在刺激细胞免疫应答过程中发挥作用。

根据研究结果,可以得出结论,向Th2 FlaA和TcpA刺激免疫反应;然而,高水平的TcpB大多直接向Th1这些反应。由于病原体的子单元组成的使用疫苗更有效的使用两个或两个以上的子单元时,使用FlaA和TcpA抗原霍乱弧菌接种疫苗会导致更高的免疫原性。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究进行了医学科学与阿拉克大学的财政援助,伊朗,作者感谢大学的宝贵的贡献。