肿瘤浸润淋巴细胞联合IFN-的疗效观察α在中国III期恶性黑色素瘤切除术中

摘要

背景．本研究旨在探讨肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)联合干扰素-的疗效α(IFN -α)治疗中国恶性黑色素瘤(MM) III期患者。方法．2010年5月至2014年10月，本研究收集了77例接受手术的III期MM患者。这些患者被分为两组:接受TIL + IFN-治疗的患者α±反链连接素激活的细胞因子诱导的杀伤细胞(R-CIK) ( )和干扰素-α±R-CIK在手臂2 ( )作为辅助治疗。主要终点是无病生存(DFS)时间和在1、2和3年时间点测量的DFS率。次要终点为1、2、3和5年时间点的总生存率以及Kaplan-Meier评估的OS。结果．我们的结果显示，Arm 1组的中位DFS和OS明显优于Arm 2组。数据还显示，在所有测量时间点上，Arm 1组的DFS率和OS率均显著优于Arm 2组。结论．接受手术切除的III期MM患者在接受TIL + IFN-治疗时，似乎享受延长DFS和OSα干扰素-相比α一个人。

1.介绍

2014年美国的流行病学数据显示，估计有76100名患者被诊断为黑色素瘤，9710名患者死于该疾病[1］．更糟的是，这种疾病的发病率似乎在迅速上升。从2002年到2006年，黑色素瘤的发病率在男性中增加了33%，在女性中增加了23% [2］．目前，明确的手术切除仍然是候选恶性黑色素瘤患者的主要治疗方法。然而，III期恶性黑色素瘤患者的复发率仍然非常高，即使辅助使用高剂量干扰素-α(IFN -α)[3.］．在众多的临床试验中，IFN-α辅助治疗已被证明可以改善DFS，但不能改善OS [4- - - - - -6］．在转移性疾病的病例中，mOS为6至8个月，5年OS率约为6%，预后异常差[7，8］．最近，许多新的免疫疗法如抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4 (anti-CTLA-4)和程序性死亡1 (anti-PD-1)抗体获得了FDA的批准。而抗pd -1抗体，其客观应答率(ORR)为38%，仅被批准用于晚期恶性黑色素瘤[9］．因此，确定恶性黑色素瘤患者术后新的治疗方法是非常重要的。

很长一段时间以来，TIL疗法对晚期黑色素瘤患者已经显示出了希望，Rosenberg等人的ORR为51%至72% [10- - - - - -14］．随后，越来越多的临床试验将TIL应用于治疗晚期恶性黑色素瘤患者;然而，应用TIL治疗恶性黑色素瘤术后患者的资料尚少。2002年，Labarriere等报道TIL联合白细胞介素-2 (IL-2)可延长III期恶性黑色素瘤患者的DFS，这些患者仅出现一个转移淋巴结[15］．不幸的是，在2007年，同一试验的7年随访数据未能显示TIL联合IL-2治疗延长了整体的RFS或OS。然而，有趣的是，在只有一个阳性淋巴结的患者中，与单独使用IL-2治疗相比，TIL + IL-2治疗的估计DFS和OS显著延长[16］．2014年，同一组研究人员更新了他们的数据，并报告TIL治疗可以提高低肿瘤负担患者的疗效[17］．这些数据表明，在正确的患者群体中应用TIL治疗可以有效地对抗恶性黑色素瘤。然而，TIL联合IFN-治疗的疗效αIII期恶性黑色素瘤的治疗方法尚不清楚。我们目前研究的目的是评估IFN-辅助TIL治疗的疗效αIII期恶性黑色素瘤切除术的患者。

2.方法

2．1．病人

本研究收集2010年5月至2014年10月行手术切除的恶性黑色素瘤III期患者77例。然后是TIL + IFN-α对27例Arm 1和IFN-患者给予±R-CIK治疗α对50例Arm 2患者给予±R-CIK治疗。本研究经郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，所有患者均签署批准同意书。这些程序符合1975年赫尔辛基宣言和良好临床实践指南。虽然两组的样本量不同，但两组的基线比较平衡。77例患者的详细基线见表1．

2．2.回顾性分析与随访

主要终点是DFS, DFS率测量时间点为1年、2年和3年。次要终点为1年、2年、3年、5年OS率，采用Kaplan-Meier分析评估OS，并采用单因素分析和多因素分析潜在预后因素。术后，患者每3个月随访一次，为期两年。在术后2至5年，患者每6个月重新评估一次。超过5年，每年进行随访评估。随访截止日期是2016年12月8日。当随访评估发现转移性疾病时，采用其他治疗方法，包括手术、免疫治疗、化疗和放疗(见表)1)．

2．3.准备到

术后，用新鲜切除的肿瘤组织培养TILs。首先，将切除的肿瘤组织切成约2 ~ 3mm的片状^3.用手术刀切开。其次，用胶原酶、DNase I IV型、透明质酸酶V型(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, usa)在室温下酶解这些组织2 - 3小时，获得单细胞悬液。第三步，过滤单细胞悬液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次，置于浓度为1.0 × 10的12孔板中孵育⁶TIL/ml在X-VIVO培养基(Muenchensteinerstrasse 38 CH-4002 Basel, Switzerland)中加入7000 IU/ml重组人白细胞介素-2 (rhIL-2)。第二天，去除细胞悬液，通过Ficoll梯度进一步纯化。将纯化的TIL培养物保持在1-2 × 10的浓度⁶在含有7000 IU/ml rhIL-2的X-VIVO培养基中培养细胞/ml，直到所有黑色素瘤细胞被清除，细胞数至少为5 × 10⁷获得TIL细胞。这个培养过程大约需要10 ~ 14 d。最后，将培养的TIL细胞立即与抗cd3抗体一起使用(GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, USA;5μg/ml)和1000iu /ml rh -2大规模扩增。通过这个过程，培养物扩大到5 × 10⁹获得TIL细胞。最后，这些细胞被注入病人体内。

2．4．制备R-CIK

用患者外周血单个核细胞(PBMCs)培养R-CIK。R-CIK制备的详细过程与我们公布的数据相同[18］．然后，在输血日，R-CIKs的剂量约为5 × 10⁹细胞。

2．5．表型检测

为了分析输注前TILs的细胞群，使用CD3-FITC、CD4-PE-Cy7-A、CD8-APC-Cy7-A和CD16/CD56-PE抗体进行染色(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)，并使用BD FACSCanto细胞分选仪进行流式细胞术(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)。最后，采用CD3+门控法分析til中CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的比例，采用CD45+门控法分析til中CD3- cd16 + CD56+细胞的比例。

2．6．统计分析

采用Spss17.0软件进行统计学分析。采用Kaplan-Meier法分析DFS和OS。单因素和多因素分析也用于分析预后因素。 被认为具有统计学意义的差异。

3.结果

3．1.表型分析

在患者输注TIL细胞前，我们采用流式细胞术检测CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3- cd16 +CD56+细胞的比例(图)1(一)，1 (b)，1 (c),1 (d))．当CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3- cd16 +CD56+细胞比例达到适当水平时，再将TIL输回患者。将培养的TIL送回患者体内时，输血细胞的组成为:CD3+ 80.8%±3.23%，CD3+CD4+ 34.8%±2.14%，CD3+CD8+ 44.1%±2.56%，CD3- cd16 +CD56+ 3.7%±0.34%。

３．２．治疗结果

我们的数据显示，arm1和arm2的mDFS和mOS分别为23.66个月和9.78个月( ， ,图2)， 43.75个月，而21.86个月( ， ,图3.),分别。然后，我们还分析了1年DFS率和OS率，2年DFS率和OS率，3年DFS率和OS率，5年OS率。数据显示，在所有测量时间点上，Arm 1组的DFS率和OS率均显著优于Arm 2组。具体数据见表2．因此，恶性黑色素瘤III期患者似乎可以受益于TIL + IFN-α治疗。

3．3．TIL + IFN-的预后因素α±R-CIK治疗组1

与Arm 2相比，Arm 1患者的DFS和OS得到了更大的改善。为了观察Arm 1治疗组的潜在预后因素，我们分析了许多因素，如性别、年龄、KPS评分、输血细胞数、培养天数和R-CIK治疗的使用。尽管单因素分析表明KPS评分、输血细胞数和培养持续时间的增加是潜在的预测因素(见表)3.)，基于这些预测因素的多因素分析差异无统计学意义(表)4和5)．

3．4．IFN-的预后因素α±R-CIK治疗组2

在Arm 1中，我们的数据表明，添加R-CIK可能不会改善III期恶性黑色素瘤患者的DFS和OS。为了研究加入R-CIK是否可以改善arm2患者的DFS或/和OS，我们也使用了单因素分析。不幸的是，我们的数据显示，无论是否采用R-CIK治疗，单因素分析均无显著差异(DFS: 9.94个月vs 8.40个月， ；OS: 21.66个月vs 23.83个月， )．因此，看来III期恶性黑色素瘤患者不能受益于基于IFN-的R-CIKα治疗。

3．5.不良事件

在这项回顾性分析中，所有患者都完成了我们的免疫治疗。TIL、IFN-无严重不良反应(3级或4级)α或R-CIK疗法。免疫治疗(1级或2级)的主要副作用为发热、关节痛、恶心、白细胞减少、肝功能障碍、贫血和白癜风6)．

4.讨论

显然，手术仍然是治疗恶性黑色素瘤的首选方法。然而，在高剂量IFN-α作为目前的辅助治疗，III期恶性黑色素瘤患者的复发率仍然非常高[3.］．此前，TIL联合IL-2治疗III期恶性黑色素瘤患者已显示出良好的结果[15- - - - - -17］．不幸的是，这种联合似乎只延长了单阳性淋巴结患者的DFS和OS。

在这些令人鼓舞的结果的基础上，努力改进治疗方法将是一个紧迫的意义。在我们的研究中，使用培养的自体TIL联合IFN-α作为III期恶性黑色素瘤患者的辅助治疗策略。这与IFN-的使用进行了比较α一个人。我们的数据表明TIL联合IFN-α治疗可改善III期恶性黑色素瘤患者的DFS和OS。从1991年至今，CIK细胞疗法作为免疫疗法在许多临床试验中被应用于癌症患者，包括肝癌(HCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)患者[19- - - - - -26］．在郑州大学附属肿瘤医院免疫治疗中心，我们也做了一些工作，证明R-CIK(或CIK)联合化疗或不联合化疗均能延长HCC、RCC、胰腺癌等的mOS [18，27- - - - - -31］．因此，R-CIK治疗常用于Arm 1和Arm 2患者，以提高治疗效果。然而，在我们对Arm 1和Arm 2数据的分析中，有或没有R-CIK的DFS和OS没有差异。到目前为止，许多实验表明CIK或R-CIK被认为是一种非特异性免疫治疗，具有主要的组织相容性- (MHC-)不受限制的细胞毒性作用[26，32］．因此，R-CIK和IL-2都是非特异性免疫治疗方法。两种非特异性免疫治疗(R-CIK和IL-2)的联合可能不能改善恶性黑色素瘤III期患者的预后。

我们都知道，Rosenberg等人对转移性黑色素瘤进行了许多实验，使用TIL联合非清髓化疗，或使用或不使用1200cgy全身照射。客观反应率可达50%以上[33- - - - - -35］．在我们的研究中，我们使用TIL联合IFN-α提示该疗法可延长III期恶性黑色素瘤患者的DFS和OS。因此，我们得出结论，诊断为III期恶性黑色素瘤的患者可以受益于TIL + IFN-α手术后治疗。

探讨影响TIL + IFN-治疗效果的预后因素α我们分析了Arm 1的个体结果，并将其与性别、年龄、KPS评分、输血时的细胞数量、培养持续时间以及R-CIK治疗是否存在相关。尽管单因素分析确定了KPS评分、输血细胞数量和培养天数作为潜在的预测因素，但通过多因素分析这些潜在的预测因素没有显著差异。这使我们得出结论，辅助TIL治疗联合给药IFN-α通常可以延长恶性黑色素瘤III期患者的DFS和OS。然而，添加R-CIK并不能进一步改善III期恶性黑色素瘤患者的DFS和OS。此外，在我们对所有患者的研究中，没有治疗相关的死亡率，其毒性作用可与之前的TIL研究和IFN-相媲美α研究。虽然TIL培养和输血需要很高的实验室专业知识，但培养的TIL的质量是临床使用的关键问题。最重要的是，我们的研究证实了TIL联合IFN-α可能是治疗III期恶性黑色素瘤的好方法。未来，多中心随机噬菌体研究将成为揭示TIL联合IFN-的真实临床贡献的更好方法α用于III期恶性黑色素瘤的治疗。

5.结论

综上所述，辅助过继TIL治疗联合IFN-α治疗可延长手术切除的III期恶性黑色素瘤患者的DFS和OS。毒性和副作用都是可控的。未来还需要开展更多的研究，为辅助TIL联合IFN-的疗效提供更多的数据αIII期恶性黑色素瘤的治疗。

缩写

干扰素-α：	干扰素-α
DFS:	无病生存时间
操作系统:	总生存时间
直到:	肿瘤浸润淋巴细胞
R-CIK:	反链连接素激活的细胞因子诱导的杀伤细胞
或者:	整体反应率
行为:	细胞过继转移
PBMC:	外周血单个核细胞。

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

李伟、高全利和徐林平设计了本研究。李伟和王耀梅分析了数据并撰写了论文。赵玲娣和丹尼尔·b·凯尔纳阅读并编辑了手稿。所有作者都阅读了该报告并提供了评论。所有作者阅读并批准了最终的手稿。李伟、徐林平和王耀梅共同拥有第一作者。

致谢

本研究由河南省科技研究国际合作基金项目(no . 172102410021)资助。作者感谢参与的学院及其工作人员的合作。作者感谢河南省肿瘤医院骨组织科的蔡琪青、高松涛、姚伟涛作为外科医生采集标本进行TIL细胞培养。感谢中国河南省肿瘤医院放射科赵燕医生的统计分析。

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