非cpg寡核苷酸通过增强同源B细胞与t细胞的相互作用发挥辅助作用，导致B细胞激活、分化和同型转换

摘要

天然的和合成的核酸都具有免疫调节特性。值得注意的是，已知核酸通过几种不同的途径和不同的细胞类型来调节免疫功能，因此需要对其作用进行复杂的解释。在本研究中，我们将含有寡核苷酸(ODN)的CpG基序与对照组和抑制性非CpG ODN在同源B细胞- t细胞相互作用中的作用进行了比较。我们使用TCR转基因DO11.10小鼠的脾细胞和TCR识别的卵白蛋白肽作为模型抗原进行抗原提呈。我们通过测量CD69的表达，通过MHC II类表达的晚期激活，细胞分裂和开关亚型和非开关亚型的抗体生产来跟踪早期激活事件。我们发现，两种检测的非cpg ODN均对早期T细胞和晚期B细胞激活事件具有显著的免疫调节作用。重要的是，观察到非cpg效应和T细胞帮助作用于B细胞之间的协同作用，导致同源T细胞-B细胞相互作用后IgG的产生增强。我们认为，当CpG ODN诱导的强抗原独立免疫激活不受欢迎时，非CpG ODN可能会作为较好的佐剂。

1.介绍

病原体相关分子模式(PAMPs)通过模式识别受体(PRRs)激活抗原提呈细胞(APCs)，这一过程是针对病原体的有效免疫反应的发展所必需的。细菌DNA和合成寡核苷酸如CpG寡核苷酸[1是一类通过prr刺激细胞的PAMPS。除了TLR9，还有一些蛋白被描述为寡脱氧核苷酸(ODNs)的候选受体，如CD14 [2，膜结合的清除受体，如CXCL16 [3.]或SR-A和MARCO [4), 12月- 205 (5]，人类cr2 [6，人NK细胞上的KIR3DL2受体[7.]和α 2-巨球蛋白[8.］.还已经提出了具有硫代磷酸酯（PS）骨干不同于天然的磷酸二酯的ODN的摄取主链的ODN和PS ODN结合至许多蛋白质由于非特异性相互作用[9.，10]，没有关于介导细胞进入，对接，并且由这些核苷酸诱导的信号的确切途径达成共识。最近的研究表明，不同的Toll样受体，它们之间TLR9，也可在不同小鼠和人类T细胞亚群表示，并协同刺激作用。与TCR活化组合，TLR9配体已经显示出诱导细胞因子的产生，并促进存活[11，12］.然而，TLR9并不是造成这种现象的唯一原因，因为TLR9或MyD88缺陷小鼠的T细胞也对CpG有反应，有趣的是，甚至对某些非CpG odn，包括抑制性odn也有反应[13］.

因此，了解T细胞和B细胞与非cpg ODN共同刺激如何促进适应性免疫反应的发展是非常重要的。我们的目的是研究非cpg ODN如何在T细胞与提交抗原的B细胞同源相互作用后调节抗体的产生。为此，我们研究了B细胞中导致同型转换的早期和晚期激活事件，这一过程使宿主更有效地防御病原体。

2.材料和方法

2．1.道德声明

本研究中的所有动物（小鼠）的治疗遵循EötvösLoránd大学的机构动物护理和伦理委员会的指导方针，该大学按照中央农业局，匈牙利颁发的22.1 / 828 / 003/2007运营。动物工作得到适当委员会的批准。

２.２.动物与细胞培养

BALB / c小鼠购自Charles River实验室购买;DO11.10小鼠（上的BALB / c背景）购自Jackson实验室的。两种菌株中饲养，并在罗兰大学的动物单元的无特定病原体的条件下维持。小鼠在6-18周龄使用。Spleen or lymph node cell suspensions were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, US) supplemented with 5% heat-inactivated FCS (GIBCO), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US), 100 U/mL penicillin (Sigma-Aldrich), 100 µg/mL链霉素(Sigma-Aldrich)， 50µm2 -巯基乙醇(Sigma-Aldrich)和1mm丙酮酸钠(Reanal, Budapest, HU)。

２.３.寡脱氧核苷酸和卵清蛋白衍生肽

所有寡脱氧核苷酸（ODN）具有核碱基之间的硫代磷酸酯（PS）键（标有大写字母），除了一个最后两个3'碱基（标有小写字母）之前。的CpG（ODN 1668; TCCATGACGTTCCTGATGCt），控制（ODN 1720; TCCATGAGCTTCCTGATGCt）和抑制剂（ODN 2088; TCCTGGCGGGGAAGt）购自Sigma-Aldrich公司购买。卵清蛋白来源的肽（OVA）具有下列序列生物素KISQAVHAAHAEINEAGR由CASLO实验室APS（Lyngby的，丹麦）合成。

2．4．在体外细胞的激活

2 × 10将新鲜分离的脾脏或淋巴结细胞(汇集于髌下、腘窝、右腋窝和副腋窝、腮腺浅淋巴结、下颌骨和坐骨淋巴结)镀到96孔板上⁵细胞密度/好。抑制剂、对照组和CpG ODNs添加量均为低(0.25µM)或高(2.5µm）具有或不具有次优活剂剂量（25nm）的卵肽的浓度。将细胞在37℃下在5％CO中孵育1天₂调湿大气和CD69表达测量或培养2天与添加5-ethynyl-2脱氧尿苷(EdU)的第一天,和分裂细胞的百分比衡量第二天使用“点击”反应试验,根据制造商的协议(点击它EdU流式细胞术测定装备,英杰公司)。分别用流式细胞仪和荧光ELISPOT检测4天培养的MHCII表达和抗体分泌细胞数量。

2．5．流式细胞术

从eBioscience (San Diego, CA, US)获得的荧光标记单克隆抗体如下:抗小鼠CD45R-PerCP-Cy5.5(克隆:RA3-6B2)，大鼠IgG2a-PerCP-Cy5.5同型对照(克隆:eBR2a);BD生物科学(Franklin Lakes, New Jersey, US):抗小鼠CD4-PE(克隆:(L3T4) (RM4-5))，大鼠抗小鼠I-A/I-E-PE(克隆:M5/114.15.2)，大鼠，κ-pe同种型控制;BioLegend（San Diego，CA，US）：抗小鼠CD69-A647（克隆：H1.2F3）。对于细胞表面染色，用MAb的不同组合在冰上温育电池悬浮液20分钟，在FACS缓冲液中稀释（补充有1％热灭活的Fcs和0.1％叠氮化钠的PBS）。在4次稀释中使用热灭活小鼠血清阻断非特异性结合。在用荧光标记的MAB染色后，通过FACSCalibur（BD Biosciences）洗涤细胞并通过FcSexpress（De Novo软件）分析结果。在CD45R.⁺CD4.⁻淋巴细胞大小的细胞被认为是B细胞和CD45R⁻CD4.⁺淋巴细胞大小的细胞被认为是T细胞。根据死细胞的光散射特性将其排除在外。

2.6。荧光灯ELISPOT.

将16垫硝基纤维素覆盖的玻片(UniSart, Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany)放入玻片模块(ProPlate, Grace Bio-Labs, Bend, OR, USA)中，使用前用PBS冲洗5分钟，并涂上2.5过夜µg/mL抗小鼠kappa捕获抗体(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)。PBS冲洗3次，用含10% FCS的rmi -1640培养基在37℃下封闭1小时。为了测量IgG和IgM抗体分泌细胞(ASCs)， 2/3体积用于测量IgG1和IgG2a同型ASCs，将原4天脾脏或淋巴结培养物的1/15体积加到玻片上。孵育12小时后，用PBS冲洗玻片，然后用PBS-吐温冲洗。标记抗体(抗小鼠IgG1-A488 (Invitrogen)、抗小鼠IgG2a-Cy5 (SouthernBiotech)、抗小鼠IgM-A647 (Invitrogen)和抗小鼠IgG-A488 (Invitrogen))在含5% BSA (Sigma-Aldrich)和0.05% Tween 20 (BSA-PBS-Tween)的PBS中稀释5000倍。RT下与标记抗体孵育1 h后，PBS-Tween冲洗玻片，阵列干燥，Axon GenePix 4300A扫描仪扫描，使用ImageJ 1.43 M软件或目视检查分析数据。

2.7。统计分析

流式细胞术数据采用双尾Wilcoxon符号秩和检验进行统计学差异计算，荧光ELISPOT结果采用双尾排列检验。排列检验如下:将待比较两组的值随机重新分配到两组，计算组间均数的差值。5000个随机组的分布被绘制成双尾确定与实际样本赋值相对应的值。50这样的算术平均数值被接受为阿尔法误差的概率。为简单起见，仅说明OVA与OVA + ODN处理的比较结果。

3.结果

3．1.非cpg ODNs增强抗原呈递的早期激活事件

为了延伸早期观察，显示非CPG ODN的T细胞的促成[13]，我们利用转基因表达卵清蛋白特异性T细胞受体的抗原提呈系统。来自DO11.10小鼠株的辅助CD4阳性T细胞识别卵清蛋白肽序列(在这里称为OVA)。在我们的实验中，这个显示在APCs MHCII上的肽作为TCR刺激。我们使用了脾细胞悬液，由于其丰富的B细胞(约占所有脾白细胞的50%)强烈促进APC，特别是当肽被胞饮作用所吸收，不需要进一步处理用作抗原时。OVA浓度设置为25 nM, T细胞活化不理想(图)1(一))，从而使我们能够观察抗原呈递结果的调节。沿着同样的思路，调制odn使用在0.25µM和2.5µM浓度时，发现非CpG ODNs(抑制剂和对照)仅适度激活B细胞，与CpG ODN相比(图1（b））.

在孵育24小时后，约40%的T细胞在OVA存在的情况下表达早期激活标志物CD69(图)1(一)）.该基本活化不仅通过与CpG ODN的辛酸和较高的浓度和更高的浓度，抑制剂ODN而增强，导致50-60％的T细胞被激活（图1(一)）.同样，由于抗原呈递过程中与T细胞的同源相互作用，OVA的存在导致B细胞上CD69表达增加(图)1（b））.而CpG在没有OVA的情况下强烈激活B细胞，诱导CD69的表达增加了10倍以上，但这种作用并没有通过添加抗原进一步增强。相比之下，在OVA存在的情况下，非cpg对照ODN表现出更好的增强效果，这意味着需要T细胞的帮助才能产生这种效果。因此，当T淋巴细胞和B淋巴细胞参与同源相互作用时，非cpg ODNs增强了它们的激活。

３．２．非cpg ODN效应对晚期激活事件的影响

接收后适当的激活刺激淋巴细胞表达各种表面标志物和开始分化和分裂。为了更好地了解施加于T在同源相互作用非CpG ODN的增强效果和B细胞中，我们看到在两个晚激活事件：在B细胞上的MHC II类的表达和新的DNA作为用于细胞分裂的准备的合成B和T细胞。

有趣的是，MHCII的表达并不反映我们对CD69的观察。在没有OVA的情况下(低、高浓度的Control和高浓度的Inhibitor)，非cpg ODN触发了MHCII的增加，但在有OVA的情况下没有影响(图)2（a））.正如预期的那样，T细胞的增殖，以包含核苷类似物EdU的细胞百分比表示，仅在OVA存在的情况下观察到(图)2 (b)）.T细胞和B细胞的增殖反应了早期激活标记物的表达模式(图)2 (c)）.因此，非cpg ODN单独诱导B细胞MHCII表达适度增加，并协同OVA增加B细胞分裂数量。

３．３．非cpg ODN对抗体分泌细胞(ASC)分化的调节

B细胞在适当的刺激下分化为分泌抗体的浆细胞和浆细胞。这种刺激可能包括T细胞的帮助，包括MHCII-TCR相互作用以及共受体的参与，但也可能在没有T细胞的帮助下发生。我们通过测量产生各种同型抗体的细胞数量来检测非cpg ODN对B细胞分化为ASCs的影响。使用相同的实验设置，将有或没有OVA的脾细胞与加入ODN共培养，培养4天后将细胞转移到包被捕获轻链抗体的孔中。

在存在抑制剂或控制ODN的情况下，IgM和IgG产生ASC的数量较高，以及CpG ODN的存在（图3(一个)和3（b））.无论有无OVA都是如此;即当T细胞帮助B细胞时，提示CpG和非CpG ODN都促进了B细胞向ASC的分化。重要的是，有OVA和没有OVA的非CpG和非CpG处理的两两比较显示了相加效应(图)3(一个)和3（b））.

在产生IgG1和IgG2A的细胞的情况下观察到相同的趋势，但差异没有统计学意义（代表性测量显示在图中3（c））.因此，在同源B细胞- t细胞相互作用中，非cpg ODNs增强了抗体的产生和同型转换。

3.4。同源交互所需的T细胞诱导抗体产生的非CpG调制

为了进一步证实非cpg ODN与T细胞来源的刺激协同增强抗体产生和B细胞的同型转换，我们使用野生型(wt)小鼠进行了重复实验。虽然在naïve wt小鼠中可能存在一些OVA特异性T细胞，但它们的数量预计会非常低，以至于可以忽略(1:10000或更低)。的确，CD69阳性T细胞的百分比不受添加OVA的wt小鼠的影响(图)4(一)）.在没有OVA的情况下，B细胞中CD69表达的模式在WT和DO11.10小鼠中相似（图4 (b)）.这里使用的非CpG ODN的浓度较高诱导两个菌株中CD69的适度升高。OVA的存在仅在DO11.10小鼠中进一步增加。以类似的方式，仅在转基因小鼠中存在OVA增强的IgG产生（图4 (c)）.因此，不是OVA本身，而是B细胞在其存在的情况下将肽呈递给T细胞的相互作用，进一步增加了细胞的相互激活，增强了抗体的产生和同型转换。

4.讨论

高效的疫苗接种对免疫学家提出了两个挑战：一种是发现适当的抗原，其将刺激理想的B和T淋巴细胞克隆，以实现病原体识别，中和和去除;另一个是抗原的制剂和施用，以便为这些特定淋巴细胞克隆提供最佳成果。佐剂促进了后一种事件，在过度刺激之间应达到微妙的平衡，导致不可接受的副作用和剖析，导致疫苗接种较差的疫苗响应。免疫刺激性寡脱氧核苷酸是有效的佐剂[14，至少部分通过TLR9通路作用于许多不同类型的细胞[15- - - - - -17］.根据剂量和给药途径的不同，可能会引发不必要的全身效应，因此需要谨慎使用。

由不同的ODN发挥对T细胞共刺激的效果的确切机制尚未完全阐明然而，当存在关于的ODN对TLR9和MyD88的[存在的依赖性报告之间不协调13，18］.因此，如果有其他受体和机制可能对非CPG ODN的共同刺激潜力负责，则尚不清楚。

我们检测中度佐剂效应的非cpg ODN的方法[19，20.]延伸关于此类ODN的T细胞刺激特性的观察结果[13］.Landrigan等人使用了由CD3和CD28触发的人工T细胞刺激系统。相反，我们建立了一个实验系统，在脾和淋巴结的APCs(主要是B细胞)与转基因T细胞的同源抗原(OVA)共存。活化的T细胞然后为B细胞的活化和成熟提供帮助。这种方法的优点是在抗原呈递时更接近T细胞的活化在活的有机体内并且适合于研究对B细胞的影响。缺点是不能区分在B或T细胞上施加的ODN效应。

根据之前的观察，T细胞在单独使用不同的ODN处理时并没有被激活，即使当B细胞被CpG ODN处理时也没有被激活(图)1）.当抗原和ODN联合处理时，从早期激活事件到研究的各个方面都观察到协同作用(图)1)通过后期激活事件(图2)促进B细胞向ASCs分化(图3.）.该效应不是由于寡核苷酸的分离APC-和T细胞激活作用，作为非CpG寡核苷酸与T细胞抗原结合给定只有当进一步提高APC的活化。当重量的细胞所使用的，排除了可能性，即OVA肽本身或肽制剂的污染将负责增强没有观察到的协同作用（图4）.

不激活或仅适度激活B细胞的odn可与抗原联合使用，通过与抗原特异性T细胞同源作用实现B细胞激活、分化和同型转换。从我们的实验中，我们不能确定非cpg ODN是否通过B细胞、T细胞或两者都表现出抗原递呈增强作用。我们使用的非cpg ODN剂量显示出适度的作用于B细胞本身的早期激活，并增强MHCII表达和ASC形成。因此，这种影响对B细胞的贡献应该被考虑在内。Landrigan等人的实验清楚地显示了非cpg ODN对T细胞的共刺激作用[13］.我们的主张是B和T细胞对非CpG寡核苷酸的行为，而当这两种类型的细胞抗原呈递过程参与同源相互作用这种效果尤为显着。由于我们所用的小肽抗原，我们假定抗原溶解潜在地由所有B细胞和并不需要BCR介导的摄取。因此，据推测所有的B细胞克隆呈递的抗原至T细胞和人的共刺激TG T细胞辅助功能的所有伙伴。这还有待检查是否抗原摄取经由BCR将限制在我们的实验系统的那些特异性识别抗原受非CpG治疗B细胞克隆。

小鼠B细胞的类转换遵循细胞分裂数量的功能模式[21.］.我们的实验跟踪划分B细胞（图2 (c))与产生IgG的细胞数有良好的相关性(图3（b）和3（c）)，提示非cpg ODN与T细胞的协同作用通过增殖的增加帮助增强同型转换。

尽管有证据表明在CD4细胞中CpG dna介导的PI-3激酶通过T细胞表达的MyD88激活⁺T细胞依赖性响应在活的有机体内[18]，动作和其他类型的ODN的可能作用的机制尚未阐明。我们的研究主要集中在B细胞反应，在与不同的CpG和非CpG ODN T细胞共刺激，并验证其对T细胞介导的B细胞反应的影响在体外．需要进一步的研究来评估odn-costipulation对t细胞的影响在活的有机体内，优先使用不刺激APC的ODN。研究人类样品也很重要，因为小鼠和人TLR表达谱和某些TLR信号通路显示物种特异性差异。

5.结束语

考虑到CpG ODN诱导细胞活化，无论抗原的共同分子如何，我们都提出了非刺激性的ODN是作为可能的疫苗辅助剂的候选者，因为它们仅响应给予给药抗原的T细胞并提供适当的B细胞克隆呈现抗原，可以提供更限制和聚焦的B小区激活和差异化曲线的特征。

缩写

APC:	抗原呈递细胞
ASC:	Antibody-secreting细胞
CpG:	未甲基化的DNA基序（在本研究：ODN 1668）胞嘧啶含鸟嘌呤二核苷酸
控制：	对照寡核苷酸(本研究中为ODN 1720)
IFA:	不完全弗氏佐剂
抑制剂：	TLR9拮抗剂寡核苷酸(在本研究中:ODN 2088)
LN:	淋巴结
MFI：	平均荧光强度
odn：	寡脱氧核苷酸
ova：	卵清蛋白肽(在本研究中:Biotin-KISQAVHAAHAEINEAGR)
PS：	Phosphorothioate。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢ÁrpádMikesy在动物护理和MártaPásztor和GősiSándorné（Giizike）的技术援助中获得了宝贵的帮助。这些研究由Nkth-otka K109683授予JózsefPrechl资助。欧洲联盟和欧洲社会基金根据“授予协议”为该项目提供了财政支持。támop4.2.1./b-09/1/kmr-2010-0003。匈牙利科学院的财政支持得到了感谢地承认。KrisztiánPapp是匈牙利科学院珍珠博林研究奖学金的支持。该研究得到了匈牙利科学研究基金（OTKA-NK 104846）的支持。

参考

1. A. M. Krieg， "细菌DNA中的CpG基序及其免疫效应"免疫学年度回顾，卷。20，pp。709-760,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
2. C.L.Baumann，I. M. Aspalter，O. Sharif等，“CD14是Toll样受体7和9的团体，”该实验医学杂志第207期12, pp. 2689-2701, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者
3. M. Gursel，I。Gursel，H. S. Mostowski和D. M. Klinman，“CXCL16影响的CpG诱导的免疫活化的性质和特异性，”免疫学杂志第177期3, pp. 1575-1580, 2006。视图:出版商网站|谷歌学者
4. S.Józefowski，T.H.Sulahian，M. Arredouani和L.Kobzik，“清除剂受体Marco在巨噬细胞对CpG寡核苷酸的作用”，“白细胞生物学杂志，第80卷，第2期。4，页870-879,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
5. M. H. Lahoud, F. Ahmet, J. G. Zhang等，“DEC-205是CpG寡核苷酸的细胞表面受体，”美国国家科学院的诉讼程序，卷。109，没有。40，pp。16270-16275,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
6. R. Asokan, N. K. Banda, G. Szakonyi, X. S. Chen, V. M. Holers，“作为DNA受体的人类补体受体2 (CR2/CD21):其在免疫反应和系统性红斑狼疮(SLE)发病机制中的作用的含义”，分子免疫学，第53卷，第53期1-2, pp. 99-110, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
7. S.西沃，M.的Falco，S. Carlomagno等人，“一种新的KIR相关函数：证据了CpG DNA摄取和穿梭到早期内涵体是由介KIR3DL2”。血，卷。116，没有。10，pp。1637-1647，2010。视图:出版商网站|谷歌学者
8. R. B. Anderson, G. J. Cianciolo, M. N. Kennedy, and S. V. Pizzo，“α 2-巨球蛋白结合CpG寡脱氧核苷酸并通过受体依赖机制增强其免疫刺激特性，”白细胞生物学杂志，卷。83，没有。2，pp。381-392,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
9. T. Haas, J. Metzger, F. Schmitz等，“DNA糖骨干2 '脱氧核糖决定toll样受体9的激活”，免疫第28卷第2期3, pp. 315-323, 2008。视图:出版商网站|谷歌学者
10. K. Heeg, A. Dalpke, M. Peter, and S. Zimmermann，“摄取和识别CpG寡核苷酸的结构要求”国际医学微生物学杂志第298卷1-2页，33-38,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
11. R. Kulkarni, S. Behboudi和S. Sharif，“深入了解toll样受体在调节T细胞反应中的作用”，细胞与组织研究，卷。343，没有。1，pp。141-152,2011。视图:出版商网站|谷歌学者
12. J. M. Reynolds和C.董，“Toll样效应T淋巴细胞功能的受体调节，”在免疫学发展趋势第34卷第3期10, pp. 511-519, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
13. A. Landrigan, M. T. Wong，和P. J. Utz，“CpG和非CpG寡脱氧核苷酸直接共同刺激小鼠和人类CD4⁺T细胞通过TLR9和MYD88独立机制，“免疫学杂志，第187卷，第1期。6, pp. 3033-3043, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
14. H. Wagner， " cpg抗原结合的免疫原性"高级药物送货评论第61卷第1期3, pp. 243 - 247,2009。视图:出版商网站|谷歌学者
15. N. Kadowaki, S. Ho, S. Antonenko等人，“人类树突状细胞前体的亚群表达不同的toll样受体，并对不同的微生物抗原作出反应，”该实验医学杂志，卷。194，没有。6，第863-869，2001。视图:出版商网站|谷歌学者
16. H. An, H. Xu, Y. Yu等，“LPS通过激活NF-kappaB, ERK和p38 MAPK信号通路上调小鼠巨噬细胞TLR9基因表达，”免疫学的信，卷。81，没有。3，pp。165-169,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
17. D. Kabelitz，“T淋巴细胞中toll样受体的表达和功能”目前在免疫学中的意见第19卷第2期1，第39-45页，2007。视图:出版商网站|谷歌学者
18. A. E.Gelman，D.R.F.Rasosa，J. Zhang等，“衔接分子MyD88激活CD4中的PI-3激酶信号⁺T细胞并使CPG寡脱氧核苷酸介导的促进刺激，“免疫，第25卷，第2期5，页783-793,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
19. Wang y, A. M. Krieg，“CpG-或非CpG DNA与特异性抗原对B细胞活化的协同作用”，国际免疫学，第15卷，第5期。2，页223-231,2003。视图:出版商网站|谷歌学者
20. Wang Y.， A. M. Krieg .，“HEL与CpG或对照寡脱氧核苷酸联合接种的HEL转基因小鼠产生自身抗体而非自身免疫性疾病的诱导”，疫苗，卷。22，没有。20，第二六四一年至2650年，2004年。视图:出版商网站|谷歌学者
21. P. D. Hodgkin，J。 -李和A. B. Lyons，B细胞分化和同种型交换与分区周期数有关，“该实验医学杂志，第184卷，第2期。1，页277-281,1996。视图:出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2015 MelindaHerbáth等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。