针对收集到的质粒DNA在大型和壮大动物肌肉DNA疫苗接种有和没有电穿孔后4 - 6周

文摘

DNA疫苗接种了在过去的二十年中人类和动物物种是一个有前途的替代传统的疫苗接种。它包括注射,肌肉,例如,质粒DNA编码多肽接种疫苗。电穿孔部队入口处的质粒DNA在细胞注射点被描述为一个强大的和有前途的战略来提高DNA疫苗功效。因为疫苗是由DNA,密切关注的质粒DNA疫苗接种的命运必须考虑,特别是在注入点。进行这样的研究,肌肉注射点必须精确地恢复和收集注射后数周。这是更加困难的大型动物和成长。技术开发定位精确、收集有效增长肌肉注射点的小猪DNA疫苗接种后4 - 6周陪同或不是由电穿孔。电穿孔并没有显著增加的剩余的质粒相比nonelectroporated小猪,和,在所有的情况下,水平低于推荐的限制FDA研究集成质粒DNA进入宿主DNA的事件。

1。介绍

DNA疫苗是广泛研究开发新的疫苗和替代人类和动物。DNA疫苗是环形质粒编码的接种疫苗抗原的DNA分子,这些抗原合成的细胞内注入身体。许多一直努力增加大量潜在的疫苗。例如,质粒编码细胞因子或copresentation分子以及toll样受体受体激动剂成功用作评论佐剂在各种模型(见[1])。其他策略是基于注入的路线,质粒的控释和/或入口的强迫质粒的细胞注射点。策略之间的力质粒的入口,电穿孔有一个有前途的未来2]。电穿孔在应用程序由一个电流两岸的注入点。细胞注射部位从而暂时permeabilized,促进质粒表达的电流进入细胞。这个结果在许多情况下改进的DNA疫苗功效[3- - - - - -6]。尤其是,电穿孔已经证明是一个强大的技术也在大型动物,包括猪(7- - - - - -9]。

DNA疫苗是一般耐受性良好,即使应用电穿孔(9]。没有观察到不良反应和代谢活动的变化在许多动物和人类的临床试验在DNA疫苗接种(10]。组织学损害已经很难观察到,例外,例如,一项研究在大鼠注射后不久,但这是与注入的路线11]。

由于DNA疫苗是由DNA,密切关注的质粒DNA疫苗接种的命运必须考虑。一般来说,大多数质粒仍然在注射部位出现的(回顾[12),在某些情况下,几个月(13]。注射后不久,少量的质粒扩散到全身,发现在遥远的器官(14]。DNA疫苗包括引入少量的质粒DNA进入宿主细胞的细胞核。然后可以想见,有潜在风险的部分或完整的质粒DNA整合到宿主细胞基因组。因此,应该仔细检查这种潜在的风险。此外,这是可以想象的,在技术允许一个入口增加质粒的细胞,是电穿孔的情况下,这些潜在的风险应该更深入考虑。通常,质粒注射组织样本中量化的pcr方法(例如,在15])。这是承认,如果没有检测到质粒,质粒整合事件可能不会发生。明确地描述集成事件,王等人开发的老鼠pcr重复固定集成capture-PCR (RAIC-PCR) [16]。四个集成事件已确定4周后肌内注射DNA疫苗电穿孔紧随其后。

当使用小的动物模型如老鼠时,质粒DNA的命运可以研究在整个注射肌匀浆。应用这些pcr进行大型测试和不断增长的动物模型(如猪),有必要恢复注入点,特别是注射后数周。事实上,肌肉和皮肤表面的动物是大而增长。因此,精确的标准来确定注入点至关重要。在目前的研究中,我们开发了一种策略能够精确定位注射点的肌肉增长小猪至少6周后DNA疫苗接种。与我们的战略,基准不直接坐落在注射点;因此没有干扰的注入点由于这些基准的存在。相比有了这个技术,我们剩下的质粒的浓度单一DNA疫苗接种后4 - 6周的小猪陪着通过电穿孔。这里使用的模型是一个DNA疫苗假狂犬病病毒感染。这里使用的电穿孔条件之前被证明是有效的诱导显著增加由于DNA疫苗的免疫反应。

2。材料和方法

2.1。质粒

内毒素自由pcDNA3质粒编码或不假狂犬病病毒糖蛋白B (PrV-gB-pcDNA3)生产和纯化如前所述9,17]。

2.2。猪的实验

实验动物实验伦理委员会批准的协议是ans /国家兽医学院完成Alfort / Paris-Est大学(法国)(注意10/04/13-05数量)。猪被安置和治疗按照当地兽医部门的要求。四组的四个具体的无菌八周老猪。质粒的注射部位是通过四个点与印度墨水纹身的皮肤了股二头肌肌肉,注射部位是位于两条线的交点经过这些点(图1)。猪都是麻醉的耳静脉注射硫喷妥钠(1 g / 50公斤体重)。第一和第二组注射2.5×10¹⁴在600年的副本PrV-gB-pcDNA3准备μL PBS。第三个收到2.5×10¹⁴份pcDNA3最后一组注射PBS。0.45毫米×12毫米的针头。八十秒后18),电穿孔由5个脉冲的150 V和20 ms 200 ms每次脉冲之间的间隔(7)是应用在不锈钢电极(0.2毫米的电线,长1厘米,10毫米)介绍了两侧的注入点的猪2到4组。电流应用BTX ECM 830脉冲发生器(美国哈佛装置,Holliston, MA)。猪每天观察。测量体温和体重每日和每周,分别。猪是牺牲了六周后注射。肌肉注射部位通过纹点是确定采样使用一次性2厘米长,0.8厘米直径活检打孔(图2),在液态氮冷冻,储存在−80°C到DNA提取。

2.3。的质粒DNA提取和量化定量PCR (qPCR)

DNA提取前,长2厘米的肌肉切除被分成六个相等的样品(从上到下肌肉的一部分)。每一块肌肉分数在PBS缓冲称重和resuspended根据测量质量。然后进行均化使用聚四氟乙烯杵在30 Hz 1分钟或直到所有主要组织团被分散。主机提取DNA进行30毫克的均质组织样本使用QIAamp隔夜蛋白酶后DNA迷你包(试剂盒)消化根据制造商的指示。此后,质粒DNA浓度测定的每一块肌肉样本定量PCR (qPCR)。qPCR的目标是一个92个核苷酸序列位于新霉素基因的质粒。引物、探针和qPCR条件是那些先前描述(19]。测量进行了一式三份。实验数据分析了使用非参数Mann-Whitney测试(20.SYSTAT 9]包括软件(SYSTAT软件公司,里士满,CA,美国)。

3所示。结果与讨论

4分与印度墨水纹身的皮肤了股二头肌肌肉5-week-old小猪(如图1)。小猪老八周时,他们发送即时注入与PrV-gB-pcDNA3跟随或不通过电穿孔,pcDNA3和电穿孔,或PBS和电穿孔。注射部位是位于两条线的交点经过这些点(图1)。动物的平均体重在疫苗接种时间的公斤。没有不良反应,没有发烧,没有延迟的生长猪观察6周期间遵循这些注射。动物的平均重量注射后4 - 6周公斤。这意味着,小猪在整个实验周期(即公斤。,约170%的初始重量)。在我们以前的报告表明,质粒注射加上电穿孔应用完全相同的方式在这里增加了生产特定抗体的减压阀和外周血单核细胞在应对迅速刺激与减压阀糖蛋白(9]。这意味着,这里使用的电穿孔条件是有效的。在注射后第6周,2厘米长肌肉样本收集完全使用点纹在注射部位皮肤(图1)。这个时间点是一样的研究中使用通过RAIC-PCR[描述集成研究的事件16]。此外,这个时间点似乎我们现实的因为我们检测到少量的质粒DNA疫苗注射肌肉21天后,没有电穿孔,用更少的质粒注射,没有确定精确的注射点就像这里所做(14]。在这个时间点,四个纹身点仍然非常明显。这两条线描述注射部位再次被吸引在皮肤上(如图1)。把皮肤和脂肪层,后一部分肌肉注射使用一次性取样2厘米长,0.8厘米直径活检打孔,横向应用肌肉表面(图2),在液态氮冷冻,储存在−80°C到DNA提取。在初步实验中,注射点被发现位于大约中间的肌肉样本(数据未显示)。未发现质粒在猪身上注入了PBS。包含的质粒浓度最高的分数(约3000至14000册/μg的宿主DNA)是位于中间的肌肉样本,分数F2和F5之间,6在分数F3或F4(图8头猪3)。F2-F4浓度较高(1猪在F2 2 F3的猪,猪和1在F4)当应用电穿孔和F4-F5(3头猪在F4和1头猪在F5),也就是说,更深,在其他情况下。当考虑到每个分数的平均值,electropored肌肉内的质粒浓度分数没有显著高于nonelectropored ()(没有显示)。但是这些观察必须谨慎对待,因为我们不应用于装置控制的压力,尽管我们尝试。然而这似乎与事实不一致的扩散质粒和更好的精密注射观察电穿孔(21]。重要的是,最终的分数针仅限于一个小区域,至少在深度,显示精确的标准的有效性。最后所有electropored和nonelectropored肌肉样品有一个质粒DNA的浓度差30000册/μ克宿主DNA。如果我们考虑的建议美国食品和药物管理局(22),没有必要执行额外的集成分析质粒DNA的宿主DNA自集成的概率很低(< 30000份质粒/μ克宿主DNA)。

总之,一个方法来恢复至少在DNA疫苗注射区域6周后注射深度在不断增长的小猪了。接种疫苗的时候,小猪的平均重量公斤,在采样时间公斤。这意味着在这两个跨度为小猪了大约40公斤(+ 140%)。即使电穿孔使免疫反应水平的显著增加9),没有明显增强的质粒观察电穿孔时应用相比nonelectropored小猪。此外,电穿孔由入口的强迫质粒在细胞,必须特别注意的潜在风险整合在宿主DNA质粒DNA。这里描述这种方法将有助于获得进一步研究猪肌肉分数的命运的质粒DNA疫苗在评估他们的整合在宿主DNA如果剩下的质粒的水平高于30.000 /副本μ克宿主DNA(根据美国食品药品管理局推荐)22]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

丹尼尔平底小渔船和文森特·勒Moigne贡献了同样的研究。

确认

诉Le Moigne从安西博士后资助的接受者。这项研究是由欧盟支持网络卓越浅带(合同编号。foodct - 2006 - 016236)。作者感谢弗兰克Boue (ans,南希,法国)提供electroporator设备和无菌猪育种工作人员和测试设施(ans, Ploufragan,法国)的专家处理猪参与这项研究。

引用

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