吸附的toll样受体4受体激动剂Alum-Based破伤风类毒素疫苗抑制了Pro-T助手2活动和增强抗体反应

文摘

铝盐凝胶(明矾)TLR-independent佐剂和被用来提高alum-based疫苗的抗体反应,如白喉、百日咳和破伤风类毒素(DPT)三联疫苗。然而,pro-Th2 alum-based疫苗配方的活动并没有被充分重视。这里我们发现alum-based破伤风类毒素(TT)疫苗是偏向th2剖面如图所示TT-induced气道嗜酸性粒细胞的炎症反应,2型细胞因子的生产和高水平的IgE过敏抗体。被吸附到明矾的TLR4受体激动剂如脂多糖(LPS)来自大肠杆菌一直没有诱导干扰素抑制TT-induced Th2活动γ在肺或Th1-like反应。相反,吸附monophosphoryl脂质(MPLA)提取明尼苏达州沙门氏菌,这是一个TIR-domain-containing adapter-inducing干扰素-β(TRIF)偏见TLR4受体激动剂,有效降低th2反应。重要的是,与抗原竞争情况(卵+ TT), TT-specific IgG1或IgG2a下降而TT敏感。值得注意的是,有限合伙人增加生产IgG1和IgG2a TT-specific抗体。总之,LPS诱导的一种更健壮的IgG1和IgG2a TT-specific抗体生产和与此同时减少Th2-cellular和体液反应,表明潜在使用明矾/ TLR-based疫苗。

1。介绍

佐剂分为两个主要官能团基于他们的免疫活动是否或也不依赖toll样受体(TLR)信号1- - - - - -4]。两组可以被定义为物质加强体液和细胞适应特定抗原的免疫反应。支持的理由使用TLR-based佐剂是他们模仿的能力自然感染期间发布的配体如来自细菌壁(5,6或从内源性核酸。因此,他们诱导效应Th1 / Th17细胞需要保护宿主免受感染(7,8]。TLR-based佐剂的分子机制最终涉及信号彻底MyD88或人数/ IL-1R domain-containing适配器诱导干扰素-β不足(TRIF)适配器分子(7,9]。免疫反应的增强TLR-based疫苗可能是由于刺激树突细胞或B细胞,这是已知的表达通常(10]。相比之下,铝盐(明矾)及其凝胶变化TLR-independent佐剂和经验也被用于促进alum-based疫苗的抗体反应等三重DPT疫苗(白喉、百日咳和破伤风),人类乳头状瘤病毒,肝炎疫苗(11,12]。然而,pro-Th2 alum-based疫苗配方的活动并没有被充分重视。此外,存在争议的有关要求的TLR信号antibody-enhancing佐剂效应(13,14]。

现在看来佐剂免疫反应的早期阶段,激活固有细胞,反过来,释放细胞因子和趋化因子向效应'天真的CD4 + T细胞功能(8]。鼠的研究已经证明,免疫与明矾引发强烈antigen-induced Th2反应,表现为组织/器官嗜酸性炎症和过敏性IgE水平升高(15]。出于这个原因,明矾被认为是pro-Th2佐剂,传统用于卵清蛋白(OVA)哮喘模型(16]。然而,pro-Th2明矾的影响,如促进IgE响应,在人类免疫可能是有害的。事实上,虽然罕见,过敏反应已报告后DPT疫苗(17]。

我们以前所示的小鼠卵子模型吸收细菌脂多糖(LPS),一个被TLR4受体激动剂,明矾抑制发展OVA-induced Th2反应剂量依赖性的方式。这种抑制作用是通过MyD88,但不是TRIF通路,并没有诱发干扰素γ肺部或Th1-like反应(18,19]。因此,结合反对佐剂块极化效应Th2或Th1细胞的出现。这种情况可能是特别重要的发展旨在加强疫苗抗体反应引出的中和抗体。

为了扩展这些观察和作为一个概念验证,我们测试的效果有限合伙人吸收与释放alum-based疫苗破伤风毒素(TT)。因为LPS信号通过MyD88和TIR-domain-containing adapter-inducing干扰素-β(TRIF)通路,我们还测试了monophosphoryl脂的效果(MPLA), TLR4与TRIF-biased相关辅助信号MPLA,展品低毒性,目前授权给人类疫苗(20.,21]。在目前的研究中,用于监控的参数Th2活动是血清水平的IgE过敏抗体和气道过敏性炎症的强度是哮喘的卵子模型所示(18,19]。

2。材料和方法

2.1。老鼠

六到八周大的女性C57BL / 6或BALB / c小鼠在特定无菌繁殖培育单位,生物医学科学研究所(ICB-IV USP),保存在通风制动系统(五个动物/笼),根据动物福利和治疗指南的银行独立委员会(伦理协议081/09),根据国家立法-11.794法律12 h光/暗周期,食物,和水随意。

2.2。敏化和挑战

小鼠致敏与4 0到7天皮下注射μ克卵白蛋白(OVA Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和/或0.25μg破伤风类毒素,请提供的博士曾Cerqueira Cezar雷特(Instituto Butantan SP巴西),两个吸附到1.6毫克的明矾凝胶在0.2毫升的PBS。卵子没有内毒素污染(LPS-free卵子)和明矾准备进行如前所述[18]。通常toll样受体受体激动剂PolyI: C (Polyinosine-polycytidylic酸),信号通过TLR3兴奋剂TIR-domain-containing adapter-inducing干扰素-β(TRIF)和MPLA (monophosphoryl脂质),TLR4受体激动剂TRIF-biased佐剂(7,21从粗糙的应变明尼苏达州沙门氏菌美国圣地亚哥R595 (Invivogen CA);和有限合伙人大肠杆菌055:B5 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),TLR4受体激动剂,被吸附到明矾凝胶。使用的所有TLR配体的标准剂量是10μg。14天、21天,小鼠鼻内挑战与10μ40 g的卵子或TTμPBS的L。敏化和挑战与氯胺酮麻醉(50毫克/公斤)和甲苯噻嗪(20毫克/公斤)。动物被吸入氟烷安乐死后24 h挑战;样本收集,不料编号,解码后分析。

2.3。血清样本和支气管肺泡灌洗(BAL)

通过心脏穿刺收集血液样本,离心机,储存在−血清20°C。BAL收购后肺洗通过气管与PBS 1毫升的冷。总数和微分单元项BAL液体测定血球计和cytospin准备沾Instant-Prov Romanowsky-stain (Newprov、巴西)。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA):血清和落下帷幕

总鼠标IgE由sandwich-ELISA使用工具包OptEIA ELISA组(美国圣地亚哥BD)。OVA-specific IgE决心通过增加血清在多个稀释与IgE板块(SouthernBiotech、伯明翰、AL、美国)。洗后,biotin-labelled卵子和显示添加了avidin-HRP +衬底。样品内部任意指定为1000 U是用作标准(18]。OVA-specific IgG1和IgG2a是衡量涂层板20μ克/毫升的卵子。血清样本添加多个稀释和anti-mouse HRP-IgG1或-IgG2a(美国圣地亚哥表达载体)。纯化小鼠IgG1或IgG2a(英杰公司)作为标准。elisa都表现在96年好maxisorp板块(美国纽约Nunc)。落下帷幕液中细胞因子含量的化验了三明治包ELISA(美国圣地亚哥BD) [22]。

2.5。测量IgE过敏抗体

IgE卵子或TT的过敏性活动评价(PCA)在大鼠被动皮肤过敏反应如前所述[18]。所有决定都是一式三份和PCA滴度表示为最高稀释了的倒数> 5毫米直径的病变。建立了检测阈值技术的在1:5稀释。

2.6。统计分析

统计分析使用Graphpad棱镜(5节;GraphPad软件,美国)。——或双向方差分析后跟Bonferroni检测后进行,是适当的。时被认为是具有统计学意义的差异值≤0.05。数据提出了平均值±标准错误(SE)。

3所示。结果

3.1。TLR 4激动剂比TLR3更有效抑制OVA-Induced Th2-Mediated过敏反应

我们先前已经表明TLR4受体激动剂(LPS)吸附卵子/明矾预防的发展会通过MyD88反应,但不是TRIF通路(18]。为了确定更直接TRIF信号的影响,我们使用了卵子模型比较聚的影响我:C, TLR3合成受体激动剂模拟dsRNA,信号完全彻底TRIF;有限合伙人,TLR4受体激动剂,彻底MyD88和TRIF通路的信号。为此,BALB / c小鼠卵巢中明矾吸附敏化(集团)过敏或缺失存在的受体激动剂TLR3 (Poly-I: c)或TLR4(有限合伙人)。总的来说,通常受体激动剂,当吸附卵子/明矾抑制Th2反应相比,过敏(卵子/明矾)组(图1)。然而,有限合伙人一直比图片更有效降低BAL液中的细胞计数和嗜酸性粒细胞数目(数字1 (b)- - - - - -1 (c))、IL-5和IL-13生产(数字1 (d)- - - - - -1 (e)),IgE水平(图1 (g))。重要的是,干扰素的水平γ落下帷幕的图片或LPS组没有增加,类似于天真或过敏(PBS)组(图1 (f))。关于产生抗体,再有限合伙人是比图片更有效减少IgE(图1 (g))。图片而不是有限合伙人减少OVA-specific IgG1同形像(图1 (h)(图),而有限合伙人IgG2a增加生产1(我))。总之,这些结果表明,有限合伙人是比图片更有效抑制Th2-mediated气道过敏反应。

3.2。有限合伙人比MPLA更有效的抑制Toxoid-Induced Th2-Mediated过敏反应

我们下一个卵巢模型协议适应破伤风类毒素抗原。如图2(一个)明矾,敏感的破伤风类毒素吸附(TT /明矾集团)导致气道过敏性炎症,其次是i.n.挑战所显示的总细胞数的增加炎症细胞在BAL液体,构成了主要的嗜酸性粒细胞相比对照组(数字2 (b)- - - - - -2 (c))。我们还发现在TT /明矾组2型细胞因子水平的增加(IL-5和IL-13) BAL相比对照组(数字2 (d)- - - - - -2 (e))因此,证实气道过敏性炎症的发展。在卵巢模型建立的角色MyD88 TRIF信号预防过敏反应,我们现在测试的影响吸收两种不同制剂的有限合伙人/脂质到破伤风类毒素/明矾。一个准备被获得大肠杆菌055:B5,信号彻底TLR4通过MyD88和TRIF通路和其他指定的MPLA,这是一个TRIF-biased TLR4受体激动剂(21]。如图2破伤风类毒素的有限合伙人,明矾准备显著抑制过敏性气道炎症的发展,就是明证低落下帷幕的总细胞计数和嗜酸性粒细胞数量相比,TT /明矾集团(数字2 (b)- - - - - -2 (c))。还IL-5、但不是IL-13水平落下帷幕在LPS组(数据大大减少2 (d)- - - - - -2 (e))。相比之下,尽管Th2反应MPLA组低于TT /明矾组,这些反应没有达到统计学意义(图2)。我们得出结论破伤风类毒素吸附明矾像过敏原,有限合伙人,但不是MPLA,有效地抑制了明矾pro-Th2活动。为了证实这一点,我们决定系统通过测量血清抗体生产的总IgE水平。如图3、敏感和挑战破伤风类毒素IgE水平与对照组相比增加。但不是MPLA的有限合伙人,明矾显著降低IgE水平(图3(一个))。相反,IgG1抗体破伤风类毒素在PBS相似,有限合伙人,或MPLA组(图3 (b)),而IgG2a特定抗体增加有限合伙人相比PBS组(图3 (c))。这些结果表明,有限合伙人阻止IgE抗体过敏的生产,没有显著影响TT-specific IgG1,和增强TT-specific IgG2a抗体生产。

3.3。有限合伙人加强Anti-Toxoid模型有两个抗原产生抗体

联合疫苗的好处,如白喉、百日咳、破伤风疫苗(DPT)多个包括注射更少和更低的成本。然而,必须采取特别关注个体的免疫原性抗原结合抗原无关,因为它可以受损时,增强或不受影响23,24]。检测抗原结合在我们的模型中,我们使用卵子和TT抗原无关抗原,吸附明矾在有限合伙人的存在与否,如图4(一)。监控Th2活动我们确定OVA-specific反应如气道过敏性炎症和过敏性IgE i.n后血清滴度。卵子的挑战。TT-specific反应测定血清同形像TT年代后产生抗体。c的挑战。关于OVA-specific呼吸道过敏反应,我们发现的LPS抑制细胞和嗜酸性粒细胞总数招募BAL相比(PBS)过敏组(数字4 (b)- - - - - -4 (c))。此外,IL-5,值得注意的是,干扰素γ落下帷幕的水平也降低LPS组比PBS组(数字4 (d)- - - - - -4 (e)),表明有限合伙人不转向OVA-induced肺Th1反应。正如所料,有限合伙人阻塞OVA-specific IgE抗体过敏所揭示的被动皮肤过敏反应浓度(图5(一个)),从而证实的抗过敏药效果有限合伙人在我们的模型中。此外,OVA-specific IgG1和IgG2a抗体增加在LPS组相比,PBS组(数字5 (b)- - - - - -5 (c))。关于TT-specific反应,有限合伙人除了显示类似的效果,获得OVA-specific反应(数字5 (d)- - - - - -5 (f))。值得注意的是,我们发现TT-specific抗体的浓度(IgG1和IgG2a)低(数字5 (e)- - - - - -5 (f))比获得的敏感和挑战时仅用TT(数字3 (b)- - - - - -3 (c)完成),这表明这种现象称为抗原发生(24]。然而,值得注意的是,有限合伙人的卵子/ TT /明矾导致更高的生产IgG1和IgG2a anti-TT抗体相比,TT /卵子/明矾。正如所料,TT-specific IgE滴度较低在LPS组相比,PBS组(图5 (d))。因此,有限合伙人的alum-based疫苗有两个不相关的抗原能够增加IgG1 IgG2a抗体生产和减少过敏性IgE滴度,更可取的概要文件中和抗体。

4所示。讨论

历史上,疫苗开发和用来保护人类或动物传染病(25]。明矾佐剂已经验应用于人类接种明显提高中和毒素(DT疫苗)或病毒抗体(乙肝)[17]。相比之下,通常受体激动剂通常被视为佐剂,支持细胞免疫和Th1或Th17细胞的发展26]。虽然明矾被广泛使用,但其pro-Th2活动,显示在动物模型的过敏,可能会限制其功效在疫苗接种感染病原体。我们曾表明,有限合伙人吸附到明矾抑制Th2反应通过MyD88通路和调制抗体同形像模式通过增加IgG2a (Th1)和减少IgE抗体(Th2) (18]。我们将我们的研究扩展到破伤风类毒素抗原和测试有限合伙人以及MPLA TLR4的佐剂与倾向于TRIF信号(21]。因为TRIF信号导致I型干扰素生产,来产生抑制活动Th2-mediated反应(26- - - - - -28),我们首先调查,在卵巢模型中,使用图片通过TRIF信号通路的影响,一个独特的TLR3受体激动剂仅能通过TRIF通路的信号。事实上,我们发现,通过TRIF信号通路可以抑制一些Th2-mediated反应。然而,有限合伙人,信号通过MyD88和TRIF途径是,到目前为止,比图片更有效抑制所有测试Th2反应有关。即使艰难,我们还是比较感兴趣的MPLA的影响,TRIF-biased辅助授权给人类疫苗接种(21有限合伙人用TT,抗原用于人类接种疫苗。我们发现敏感与TT /明矾,与卵子发生,引发强烈TT-mediated气道过敏性炎症确认pro-Th2明矾的活动,表明TT是一个不错的过敏原。Th2-associated气道过敏反应明显被有限合伙人,但不是MPLA。更重要的是,关于产生抗体,有限合伙人而不是MPLA显著抑制IgE总产量,同时保持的水平IgG1或IgG2a anti-TT。因此,很明显,吸收有限合伙人明矾块其pro-Th2活动不受欢迎的,因为他们可能会减少anti-infectious免疫力。另一个事实强调了在我们的研究中与抗原竞争。我们发现TT的抗体反应是高当小鼠致敏只与TT比敏化与卵子+ TT。实际上,当设计与多个抗原疫苗是很重要的测试组合是否不减少单一组件的免疫原性。这是多价疫苗根腐病的情况下(29日]。同时,灭活脊髓灰质炎病毒疫苗结合白喉和TT和全细胞百日咳疫苗的抗体反应减弱百日咳疫苗(30.]。相反,全细胞百日咳疫苗结合白喉类毒素提高单个组件的免疫反应31日,32]。在我们的模型中,虽然卵子的结合+ TT减少TT-specific抗体抗原指示完成,有限合伙人强化IgG1和IgG2a anti-TT抗体而减少IgE抗体显示LPS刺激anti-infectious抗体的生产。我们相信在致敏阶段有限合伙人行为损害Th2启动。支持这种假设已经表明,TLR配体可以激活树突状细胞释放一个无特征MyD88-dependent负面信号,作用于Th细胞损害Th2细胞发展(33]。也有可能是由树突状细胞抗原表达的效率取决于TLR配体的存在和二代peptide-MHC类复合物是由通常的吞噬体由搅拌器和Medzhitov如图所示34]。

有限合伙人的高毒性排除了其使用在人类身上,但合成TLR4受体激动剂,毒性较低,开发我们证明他们在卵巢模型(抗过敏药效果18]。此外,可以使用其他通常受体激动剂。例如,皮下的明矾疫苗管理ragweed-TLR9受体激动剂临床有效治疗过敏性鼻炎(35]。此外,小说TLR9识别受体激动剂治疗显示,持续性过敏性哮喘临床疗效[36]。

5。结论

工作强调了pro-Th2明矾佐剂的属性可以被吸收的抑制LPS指示在alum-based toll样受体激动剂疫苗的潜在使用多种抗原的抗体生产至关重要的免疫治疗效果和明矾pro-Th2活动是有害的。我们的数据也显示,有可能阻止Th2-mediated反应的发展通常受体激动剂没有偏差Th1分化表型。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

确认

本研究支持由FAPESP(圣保罗研究基金会)Momtchilo Russo必须占州政府。我们应感谢她曾CC雷特博士的建议(研究所Butantan,圣保罗,巴西)。

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