文摘

Mono -特定CD4和多功能⁺和CD8⁺t细胞反应进行评估改善免疫检测活动性结核病(TB)和潜伏性感染(LTBI)。我们应用流式细胞术对细胞因子(IFN -γ肿瘤坏死因子-α和2)的T细胞与结核抗原刺激后28 TB-infected科目(18活动性结核病和10 LTBI)和10个未受感染的控制。由CD4细胞因子的生产⁺T细胞TB-infected学科在单细胞水平高于未受感染的控制。分配到激活CD4⁺T细胞,产生的任何三个细胞因子,截止> 0.45%,可以区分TB-infected(> 0.45%)未受感染的受试者(< 0.45%)。TB-infected科目中,多功能CD4的频率⁺T细胞,同时生产3细胞因子,在活动性结核病是低于LTBI科目。因此,分配triple-positive CD4细胞⁺T细胞截止< 0.182%,TB-infected个人可以分为活动性结核病科目(< 0.182%)或LTBI科目(> 0.182%)。CD8的大小⁺t细胞的反应显示活动性结核病和LTBI之间没有差异。多功能CD4⁺t细胞的反应可以在单个时间点有可能识别对象没有结核感染和患者有积极的或潜在的结核病。

1。介绍

结核分枝杆菌(快艇)感染全世界超过20亿人;90%的快艇来华的人能够抵抗的结核病(TB)感染疾病确定延迟的状态(LTBI) [1]。尽管潜伏性和活动性结核病病可能动态频谱的一部分(2,3),个人LTBI经典被认为是无症状而不是传染性;因此,结核病的准确分类地位至关重要因为治疗和预防的方法是完全不同的。

所有现有LTBI诊断测试,结核菌素皮肤试验(TST)和新移行细胞释放化验(干扰素释放),是可以接受的但仍不完美的测试(4]。他们代表间接的标志快艇接触并提供主机敏感结核抗原的免疫学证据。测试取决于细胞介导免疫性,无论是测试可以准确区分活动性结核病和LTBI,区分复活再感染,或歧视不同阶段的范围内快艇感染(5,6]。因此,需要新的生物标记分类患者在一个单一的时间点有活动性结核病,LTBI,或没有感染。

替代免疫方法近年来被调查(7- - - - - -11]。特别是,多功能T细胞,由他们coexpress两个或两个以上的细胞因子的能力,显示诊断收益率比干扰素释放检测结核感染(12- - - - - -14)和改善活动性结核病之间的歧视和LTBI [7- - - - - -11,15]。

然而,目前没有共识是否多功能T细胞代表保护性免疫的一个标志或疾病活动。在动物模型的研究揭示了多功能Th1细胞与保护性免疫结核病(16),但最近的一些研究人类与多功能Th1细胞保护性免疫对肺病(10,17),而其他人则表明这些细胞可能只是反映了活动性疾病的存在(7,9]。

在目前的研究中,我们应用一个细胞内细胞因子流式细胞术(ICCFC)调查单功能、多功能快艇特殊技能CD4⁺和CD8⁺T细胞在活动性结核病和LTBI成年人。基于我们的研究结果,我们提出一种基于免疫的方法,可以改善单一时间点的识别对象没有结核感染患者有积极的或潜在的结核病。

2。材料和方法

2.1。研究对象

研究人群包括38的受试者中公共卫生和传染病,“Sapienza大学,意大利罗马。受试者首先主要分为2组:结核感染和未感染的科目。结核感染的人随后分为活动性结核病,潜在的结核病。总之,18活动性结核病患者(年龄,26岁- 61岁);10 LTBI患者(年龄范围,41-60年);和10名健康受试者招募(年龄范围,27-43年)。

活动性结核病的诊断是根据临床和放射学结果和被识别确认结核分枝杆菌用微生物方法和/或组织学检查受影响的组织。所有患者肺结节的参与。

我们分为LTBI受试者QFT-GIT和结核菌素阳性。所有科目分为LTBI还以下风险因素之一:胸部x光暗示之前结核感染(顶端胸膜增厚,肺结节,肺上叶支气管扩张,间质肉芽肿性钙化,空化,和淋巴结或心包钙化)和接触的历史的活动性结核病,来自一个地区的结核病感染流行率很高。没有个人的临床、放射和微生物的证据活动性结核病,结核病治疗之前,没有收到。健康受试者未曝光的人没有以前的结核病的历史,不知道结核病接触和测试-测试和QFT-GIT。

干扰素-测量γCD4细胞的干扰素释放和多功能分析水平⁺和CD8⁺T细胞进行相同的血液样本收集的所有病人。

研究了当地伦理委员会的批准(参考号码2669),和知情同意所提供的所有科目。

2.2。结核菌素皮肤试验和QuantiFERON结核病黄金管(QFT-GIT)

抽血液后QFT-GIT化验,结核菌素(Biocine测试产后抑郁症,凯龙星,锡耶纳,意大利)根据结核菌素皮内执行方法同样的有经验的操作人员,考虑硬化≥10毫米是积极的。QFT-GIT测定(Cellestis有限、卡内基、澳大利亚)和解释进行了同样的训练有素的技术人员,按照制造商的指示。运营商都忽视病人的临床状态。

2.3。胞内细胞因子流式细胞术(ICCFC)

流式细胞术对细胞内细胞因子,肝素化周边血液收集,和0.5毫升的全血加入3试管包含分别盐水(负控制),phytohaemagglutinin (PHA)和结核抗原(7.7 ESAT-6、CFP-10和结核病)(18]。试管QFT-GIT提供的。重叠的结核抗原池肽和组合在一起作为一个单一的刺激条件。

全血是costimulated anti-CD28 + anti-CD49d (5μL / mL, BD生物科学、Pharmingen、意大利)的几位作者9,10,19],Brefeldin (10μg / mL) (Sigma-Aldrich)立即被添加到每个管如前所述[20.]。为了避免非特异性的刺激与CD28 / CD49d聚集有关,我们添加了anti-CD28 / CD49d正面和负面的(生理盐水)抗体(PHA)控制管和结核抗原管(7.7 ESAT-6、CFP-10和结核病)和我们进一步减去背景值(- 2,IFN -γ和肿瘤坏死因子-α从结核抗原管)。

总之,经过18小时的潜伏期,细胞表面染色进行以下标记,anti-CD45-VioBlue, anti-CD4 PE-Vio770,和anti-CD8 PerCP (Miltenyi研究,德国),和红细胞溶解1毫升流式细胞仪赖氨酸溶液(BD生物科学)。细胞被permeabilized 0.5毫升流式细胞仪permeabilizing解决方案(BD生物科学)和细胞沾anti-IFN -γFITC anti-TNF -αAPC, anti-IL-2 PE (Miltenyi研究)。细胞被固定在1%多聚甲醛和1小时内使用MACSQuant分析仪分析流式细胞分析仪(Miltenyi研究)后校准和自动补偿。我们获得了至少100000细胞淋巴细胞。7.6.5 FlowJo软件版本被用于执行“盖茨”组合分析。七种不同的人口在CD4细胞被发现⁺和CD8⁺单元门的基础上干扰素-γ2,TNF -α由CD4⁺和CD8⁺T细胞(图1)。背景-细胞因子生产控制(盐水缓冲)减去从每个刺激条件。Intra-assay变异系数和interassay变差系数估计,分别为< 5%,< 10%,。

我们被T细胞产生的任何3细胞因子(IFN -γ或或TNF - - 2α)“激活的T细胞,”那些生产干扰素-γ单独或结合和/或肿瘤坏死因子- 2 -α“总干扰素-γ⁺T细胞,“那些生产单独或结合IFN - - 2γ和/或TNF -α“总- 2⁺T细胞”,那些产生TNF -α单独或结合- 2和/或干扰素-γ“总TNF -α⁺T细胞。”Similarly, we classed polyfunctional T cells (those simultaneously producing all 3 cytokines) as “IFN-γ⁺- 2⁺肿瘤坏死因子-α⁺T细胞。”

2.4。统计分析

GraphPad棱镜使用软件版本5(软件MacKiev)。非参数克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析邓恩的后续测试的比较和非参数Mann-Whitney测试应用比较t细胞频率和百分比cytokine-secreting细胞3或2组患者之间,分别。接受者操作特征(ROC)分析计算最优截止值对CD4激活⁺和多官能的CD4 T细胞⁺T细胞。ROC曲线被绘制生成1−特异性、敏感性和曲线下的面积(AUC)和95%置信区间(CIs) 95%计算。统计分析都是双面的,被认为是重要的值< 0.05。

3所示。结果

3.1。结核菌素和QFT-GIT结果

QFT-GIT是积极的在13/18(72%),负在3/18(17%),和不确定的2/18(11%)的活动性结核病患者。正如所料,QFT-GIF是积极的在所有10个(100%)LTBI患者和健康对照组的。各LTBI结核菌素是积极的和消极的健康对照组,而积极的在11/18(61%)和7/18(39%)的活动性结核病患者。

3.2。流式细胞术分析细胞因子快艇特殊技能CD4⁺在单细胞水平T细胞

CD4的表达⁺T细胞产生的任何3细胞因子(IFN -γ或或TNF - - 2α)评估患者的活动性结核病,LTBI,和健康对照组,后仿真快艇特殊抗原。这些CD4更高的频率⁺T细胞被发现在活动性结核病患者(平均1.197%,范围0.219% - -3.59%)和LTBI患者(1.666%,0.234 - -5.762%)如果比健康对照组(0.246%,0 - 0.423%;由克鲁斯卡尔-沃利斯检验);另一方面,2感染组之间没有显著差异被发现。这个观察后,我们进行了ROC分析(图2(一个))和激活CD4截止> 0.45%⁺T细胞被发现的值允许的最佳组合的敏感性(94.44%,95%置信区间CI: 72.2 - -99.8%)和特异性(100%,95%置信区间CI: 69.15 - -100%;AUC 0.9722;95%置信区间:0.9141 - -1.030%,)来区分快艇来华的病人从健康对照组(活动性结核病和LTBI)。使用这个截止,我们取得了积极的17/18(95%)的活动性结核病患者,9/10(90%)的LTBI患者和健康对照组(图102 (b))。因此,分析快艇特殊技能CD4⁺T细胞之间的歧视快艇来华的和未受感染的患者。

在另一组的分析中,我们比较了“总IFN -频率γ⁺CD4⁺T细胞”、“总- 2⁺CD4⁺T细胞”和“总TNF -α⁺CD4⁺T细胞”(部分中定义2在我们3组的受试者)。“总干扰素的频率γ⁺CD4⁺T细胞”和“总- 2⁺CD4⁺LTBI患者T细胞”高活动性结核病患者和健康对照组相比,尽管这些差异达到统计学意义只之间Mtb -感染(活动性结核病和LTBI)和健康受试者(干扰素-γ;克鲁斯卡尔-沃利斯检验)- 2(数字2 (c)和2 (d))。“TNF -的频率α⁺CD4⁺T细胞”是积极的和潜在的结核病患者高于健康对照组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验;图2 (e))。

因此,细胞因子生产的分析快艇特殊技能CD4⁺T细胞在单细胞水平无法指示结核病状态中研究对象不允许活动性结核病和LTBI之间的区别。

3.3。多功能细胞因子的分析快艇特殊技能CD4⁺T细胞

我们分析了样品的所有可能组合细胞内的表达干扰素-γ2,TNF -α在cytokine-producing CD4⁺T细胞在主题活动和潜在的结核病。“干扰素的频率大大提高γ⁺肿瘤坏死因子-α⁺”和“干扰素-γ⁺- 2⁺肿瘤坏死因子-α⁺“CD4⁺LTBI患者t细胞亚群观察相比,活动性结核病患者(和分别;Mann-Whitney测试)(图3(一个))。相反,其他单或double-cytokine-secreting CD4的频率⁺T细胞这两组之间没有显著差异。

然而,细胞因子(图3 (b))透露,在LTBI病人多官能的CD4的比例⁺T细胞产生3细胞因子同时更比其他double-cytokine-producing CD4 (23%)⁺T细胞(IFN -γ⁺肿瘤坏死因子-α⁺= 4%;- 2⁺肿瘤坏死因子-α⁺= 4%;干扰素-γ⁺- 2⁺= 16%),但是与single-cytokine-producing CD4相似⁺T细胞(TNF -α⁺干扰素- = 27%γ⁺= 18%)。相比之下,主题与活动性结核病显示一个更小的多官能的CD4的比例⁺T细胞(8%)和CD4的优势⁺t细胞分泌TNF -子集α这构成了细胞因子反应总数的46%。

根据这些差异,我们进行了ROC分析(图4(一))和多官能的CD4截止< 0.182%⁺T细胞的最佳组合允许敏感性(77.78%,95%置信区间CI: 52.36 - -93.59)和特异性(70%,95%置信区间CI: 34.75 - -93.33%;AUC 0.8444;95%置信区间:0.7021 - -0.9868%,)来区分活动性结核病和LTBI科目。使用这个截止得分ICCFC反应是积极的还是消极的,我们观察到一个积极的响应(> 0.182%)4的18(22%)活动性结核病患者和7的10 (70%)LTBI病人(图4 (b))。在我们的手中,多官能的CD4的频率⁺同时T细胞产生干扰素-γ2,TNF -α可能是LTBI地位的象征。

3.4。具体CD8⁺t细胞反应快艇抗原在细胞内细胞因子流式细胞术

激活CD8的分析⁺T细胞,产生的任何3细胞因子(IFN -γ或或TNF - - 2α)CD4显示出类似的结果⁺T细胞,揭示CD8明显更大的频率的激活⁺T细胞在两种活动性结核病(平均0.599%,范围0 - 4.55%)和LTBI病人(0.489%,0 - 1.796%)相比,健康对照组(0%,范围0 - 0.249%,克鲁斯卡尔-沃利斯测试),但两组之间没有差异被发现被感染的个体(图5(一个))。同样,“总干扰素的频率γ⁺CD8⁺T细胞”(图5 (b)),“总- 2⁺CD8⁺T细胞”(图5 (c))和“总TNF -α⁺CD8⁺T细胞”(图5 (d))相比,活动性结核病患者明显高于其他两组的病人。这些差异只是活动性结核病主题和健康对照组之间统计学意义(干扰素-γ⁺;- 2;肿瘤坏死因子-α克鲁斯卡尔-沃利斯检验)。

至于细胞因子的概要文件快艇特殊技能CD8⁺T细胞,我们发现活动性结核病和LTBI科目之间无显著差异(为每个CD8⁺t细胞通过Mann-Whitney测试子集;图6(一))。不过,观察饼图(图6 (b))的比例,单、双、或triple-cytokine-secreting CD8⁺t细胞亚群是两组人之间的可比性。

因此,评价的快艇特殊技能CD8⁺t细胞的反应在单功能的和多重的分析不允许活动性结核病和LTBI科目之间的区别。

4所示。讨论

近年来,免疫反应快艇已被广泛研究的目的不仅更好地了解结核病发病机制,同时提高诊断。最近IGRA提供一些改进的TST,展示一个优秀的特异性LTBI诊断和相关风险的大小结核分枝杆菌(21]。然而,他们有几个已知的限制包括减少精度在免疫功能不全的受试者(22- - - - - -24),转换和归复权的结果当连续应用在同一个人(25- - - - - -27),无法区分复活再感染,无法准确区分LTBI和活动性结核病5,6]。

在目前的研究中,使用干扰素释放试验作为结核病检测工具,在普通干扰素-无显著差异γ反应在我们观察结核病和LTBI主题,因为积极的干扰素-类似的百分比γ两组的反应存在。

为了改善活动性结核病和LTBI之间的歧视,我们应用一个细胞内细胞因子流式细胞术(ICCFC)调查单功能、多功能快艇特殊技能CD4⁺和CD8⁺T细胞。

同时多功能T细胞分泌干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,扮演关键角色- 2在慢性细菌和病毒感染的控制28]。细胞因子变化的概要文件可以是一个通用的特点快艇特殊技能结核感染T细胞,但有限的和有争议的数据很难定义结核病(这些细胞的作用29日]。一些研究支持更高比例的triple-positive CD4的概念⁺T细胞与LTBI当比较活跃的结核病和潜在的主题,表明这种T细胞可能是一个子集代理的标志快艇的主动复制控制负载,因此LTBI科目(10,15,17]。相比之下,其他人表明triple-positive CD4的比例更高⁺活动性结核病的T细胞比LTBI科目(7,9),但所使用的方法是不同的,所以是LTBI的定义。

目前的研究提供了一个详细的分析cytokine-producing CD4的频率⁺和CD8⁺T细胞在快艇来华(活动性结核病和LTBI)和未感染的科目。

关于CD4⁺t细胞室,第一个发现是,激活细胞产生的任何分析3细胞因子(IFN -γ或或TNF - - 2α)可能有助于区分快艇来华(活动性结核病和LTBI)和未感染的科目。事实上为激活CD4截止> 0.45%⁺T细胞,我们取得了积极的活动性结核病患者的95%,90%的LTBI患者和健康对照组,明显区分快艇来华的来自健康对照组的患者。有趣的是,活动性结核病患者显示低响应用TST和量子场论(只有61%和72%,分别地。)证实常规免疫测试没有有用的活动性疾病的诊断。我们的数据表明,CD4细胞激活的分析⁺T细胞有很好的敏感性活动性结核病。

CD4细胞的分析⁺T细胞分泌干扰素-γ,2,和TNF -α,揭示了普遍的频率相比,这些T细胞在感染未感染的科目。不过,有趣的是频率略高的“所有干扰素-γ⁺”和“2⁺“CD4⁺LTBI患者T细胞对活动性结核病患者,符合最近的研究表明,CD4细胞⁺T细胞产生干扰素-γ和- 2与保护性免疫结核病(30.,31日]。综上所述,单功能的分析能够区分感染和未感染的科目但无法显示结核病状态不允许明确区分活跃和潜伏性感染。

此外积极寻找差异和潜在的结核病,我们进行了广泛的描述的功能的快艇特殊技能CD4⁺T细胞,以确定所有的组合细胞内的表达干扰素-γ2,TNF -α。这些发现显示,潜伏性感染是两个CD4与频率的增加有关⁺t细胞亚群,这些生产干扰素-γ2,TNF -α同时(triple-positive)以及那些产生IFN -γ结合TNF -α,表明这些细胞保护作用的人口在维护潜在的变形。事实上,我们发现,多功能CD4细胞⁺T细胞,尤其是生产3细胞因子同时提供最好的歧视之间的活跃和潜伏性感染。事实上使用截止triple-positive CD4的0.182%⁺T细胞,大多数LTBI科目(70%)显示一个积极的反应,而大多数的活动性结核病患者(78%)有一个反应低于截止。

综上所述,只有不到0.182%的triple-positive CD4检测⁺T细胞强烈表明活动性结核病的特异性为70%,而这些细胞的频率高于0.182%可以表明LTBI的敏感性为77.7%。

最值得注意的是,与潜伏性感染相比,我们的主题活动性结核患者CD4的优势⁺T细胞分泌TNF单独构成了细胞因子反应总数的46%。这是在协议与以前的研究显示,肿瘤坏死因子免疫反应的生产是一个重要的组成部分快艇抗原在活动性疾病,因此最可靠的诊断结核病的标志(7,10,11,32,33]。TNF的扩张可能负责一个高程度的炎症,这可能与组织损伤和肺损伤而不是保护和控制的病原体。

根据已被认为是一种保护性的CD4的标志⁺各模型的人类病毒感染t细胞反应(28,34,35),我们发现了一个更高比例的多功能干扰素-γ⁺- 2⁺肿瘤坏死因子-α⁺CD4⁺T细胞与LTBI科目,能够控制快艇复制与当前结核病组相比,CD4细胞⁺T细胞分泌TNF独自占据了快艇特殊的反应。

至于CD8⁺t细胞室,Rozot et al。36,37)最近表示,快艇特殊技能CD8⁺t细胞反应可以发现主要在活动性结核病患者相比LTBI主题,暗示CD8之间的相关性⁺抗原t细胞反应和高负担(19,38]。这个假说是由最近的一项研究显示,儿童执行快艇特殊技能CD8⁺T细胞检测活动性结核疾病但不是最近在健康儿童接触快艇,尽管类似频率的CD4细胞⁺T细胞是存在于两组(39]。

此外,人们很少知道大小,质量,和特异性快艇特殊技能CD8⁺在积极和潜伏性感染t细胞反应。在我们的研究中,单功能的分析允许区分感染和未感染的受试者,在CD4遵循相同的趋势⁺T细胞。相反,CD8的多官能的分析⁺t细胞的反应显示活跃和潜伏感染的患者之间没有显著差异。

本研究有一些局限性,如相对较小的患者数量在每个临床组和缺乏前瞻性分析。然而,多功能的ICCFC评估暴徒特殊技能CD4⁺T细胞使我们能够确定结核病感染的不同临床阶段。在这方面我们建议免疫模型(图7),截止CD4 0.45%的激活⁺T细胞,可能最初的歧视快艇来华(活动性结核病和LTBI)患者(> 0.45%)未受感染的受试者(< 0.45%)的特异性为100%。然后,感染者可能分为活动性结核病科目如果他们显示频率的triple-positive T细胞低于0.182%,作为LTBI对象如果triple-positive T细胞的频率高于0.182%的敏感性为77.78%,特异性为70%。

5。结论

多功能特定CD4的流式细胞术分析⁺t细胞的反应可能代表一个简单和快速免疫方法来区分快艇来华的和未感染的科目。更有趣的研究结果是增加数量的活动性结核病患者检测CD4的多功能分析⁺t细胞的反应相比,QTF-GIT或结核菌素。一般作为临床诊断测试来识别活跃与潜在的结核病患者感染,这种免疫方法需要验证在一个更大的前瞻性研究和扩展到其他形式的活动性结核病。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突在出版。

确认

作者欣然承认贡献本研究的研究参与者和人员。