代重组猪细小病毒病毒样颗粒酿酒酵母和特异性单克隆抗体的发展

文摘

猪细小病毒(PPV)是一个广泛的引起严重的生殖疾病传染性病毒的猪和小猪的死亡。基因编码的主要衣壳蛋白VP2 PPV放大使用病毒核酸提取从猪血清和插入酵母酿酒酵母表达质粒。重组PPV VP2蛋白在酵母高效表达,用密度梯度离心法纯化。电子显微镜分析纯化PPV VP2蛋白显示病毒样粒子的自组装(种)。9对PPV重组单克隆抗体(mab) VP2蛋白生成。新生成的马伯的特异性免疫荧光分析证明了PPV-infected细胞。间接免疫球蛋白ELISA基于一种重组PPV-specific抗体的检测猪血清开发和评估。的敏感性和特异性试验被认为是93.4%和97.4%,分别。总之,酵母酿酒酵母代表了一种有前途的表达系统生成重组PPV VP2蛋白的一种诊断的相关性。

1。介绍

猪细小病毒(PPV),第一个孤立从母猪在德国1),发生在全球范围内(发现2- - - - - -4]。PPV的主要病原体是一种综合症或在猪生殖失败。这种综合症的特征是死胎、木乃伊胎儿早期胚胎和胎儿死亡,推迟返回发情,和不孕(缩写为SMEDI)[5,6]。PPV也证明是一个代理能增加猪圆环病毒2型感染的影响断奶多系统消耗综合征的临床过程7),这是一种重大疾病在全球猪生产8]。

五个不同组的猪细小病毒(PPV)已确定:经典PPV (PPV1) PPV2, PPV3(称为猪PARV4, hokovirus或partetravirus),和PPV4猪bocaviruses,都有大量的遗传差异(9- - - - - -12]。最近,一个新的细小病毒暂时建议被称作PPV5被发现在美国(13]。

PPV经典有一个血清型细分为四个临床基因型(生物型)根据其致病性。NADL-8病毒会引起病毒血症和穿过胎盘感染胎儿,导致胎儿死亡(14]。相比之下,非病原的NADL-2应变作为减毒疫苗是目前广泛使用的没有穿过胎盘屏障,引起病毒血症有限在实验感染(15]。其他两组Kresse IAF-A83菌株,分别与皮炎和肠道疾病(16]。

PPV是一种小型,nonenveloped病毒,分配给属细小病毒。这群病毒也会感染啮齿类动物和食肉动物,属于科亚科内(9]。PPV -,单链DNA与不同的发夹末端约5 kb。基因组包含两个主要的开放阅读框(orf),每个在同一帧的互补链。ORF1编码三个非结构蛋白和结构蛋白VP1、VP2、VP3 ORF2编码。VP1和VP2翻译从不同拼接rna,而VP3蛋白水解形成的乳沟VP2 [17,18]。

VP2由一个eight-stranded反平行的β桶与4大主题之间的循环β链。这些循环显示拥有许多b细胞抗原表位,可以容忍插入19,20.PPV)使VP2潜在抗原载体和发挥关键作用在PPV诊断和免疫预防(21]。PPV衣壳的结构组成的重组杆状病毒系统生成VP2在3.5一项决议(1号加入PDB k3v) [22]。

免疫原性主要衣壳蛋白VP2 PPV已经合成的几种表达系统包括细菌(21,23]。PPV VP2蛋白表达利用杆状病毒表达载体系统显示组装成病毒样颗粒(一种)类似的原始病毒粒子的大小和形态。这样的一种显示诱导抗体免疫猪(24和豚鼠25]。产生一种杆状病毒系统表现出积极的免疫反应性PPV和被用在大多数商业ELISA测试(26]。最近,免疫原性PPV VP2蛋白在酵母合成毕赤酵母属pastoris(27]

重组抗原人类细小病毒衣壳蛋白的形成一种酿酒酵母最近证明(28,29日]。关于成本、产量、易于处理、车牌区域生产酵母代表另一种重组杆状病毒表达系统,这是到目前为止的主导来源VP2-derived细小病毒的一种27,28]。

在最近的研究中,我们已经生成了PPV VP2蛋白的一种酿酒酵母表达系统,demonstated结构和病毒衣壳抗原相似性和开发了一种新的基于使用间接免疫球蛋白g ELISA PPV VP2-derived种。此外,我们已经开发出一种面板的PPV VP2蛋白特异性单克隆抗体,并演示了他们的反应与PPV-infected细胞。

2。材料和方法

2.1。血清样本

猪血清样本从农场在立陶宛(一百八十三),罗马尼亚(),和乌克兰(2008年- 2010年)收集和使用。样本储存在测试之前−70°C。

2.2。病毒DNA隔离

病毒核酸(NAs)提取猪肾细胞培养PK-15(写明ATCC CCL-33)感染猪细小病毒毒株NADL-2。NAs提取使用商业QIAamp UltraSens病毒工具包(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)后,制造商的手册和储存在−70°C到使用。

2.3。克隆和表征PPV VP2基因

PPV的VP2基因放大使用高保真酶混合(Fermentas /热费希尔科学,维尔纽斯,立陶宛)直接从提取NAs使用下面的一对引物(IDT,慕尼黑,德国):PPV-vp2-F 5′tctACTAGTACAATGAGTGAAAATGTGGAACAA-3′PPV-vp2-R 5′呕吐ACTAGTCTAGTATAATTTTCTTGGTATAAGT-3′

使用的引物扩增拍我的网站(下划线)subcloning pFX7到酵母向量。热循环条件如下:初始变性3分钟在95°C,紧随其后的是30 94°C的周期为1分钟,1分钟55°C,和72°C 2分钟,然后最后72°C伸长了10分钟。PCR扩增产品消化了拍我和插入XbaI-linearized和脱去磷酸酵母表达质粒pFX7 GAL1-10酵母启动子的控制下(30.)和聚合酶链反应和随后的DNA序列分析证实。放大的核苷酸序列PPV VP2与基因库的使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)。DNA操作都是按照标准的程序执行(31日]利用Fermentas酶和包/热费希尔科学。筛选重组结构大肠杆菌DH5αF′。

2.4。菌株、媒体、酵母转化、培养和纯化的蛋白质

重组构建包含PPV VP2序列筛选大肠杆菌DH5αF′细胞。酿酒酵母单倍体菌株AH22马塔(leu2 his4 pep4PPV)是用于表达VP2蛋白。选择酵母转化株进行抗甲醛的YEPD(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖,Difco,火花,医学博士,美国)琼脂补充了5毫米甲醛。酿酒酵母转化株生长在YEPD中补充了5毫米甲醛或YEPG感应介质(半乳糖蛋白胨酵母提取物1%,2%,2%,Difco)。培养了酵母细胞,表达和纯化的PPV VP2如前所述[执行32,33]。净化后的总蛋白浓度是由布拉德福德化验(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)与牛血清白蛋白(BSA)作为一个标准。

2.5。sds - page及免疫印迹分析

减少样本的样本煮缓冲和凝胶电泳分离SDS-Tris-glycine缓冲区。蛋白质是可视化用考马斯亮蓝染色法(Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。西方墨点法,蛋白质electrotransferred止动剂P膜(美国微孔,贝德福德,MA)作为描述Sambrook和罗素31日]。膜被封锁的5%牛奶在磷酸缓冲盐(PBS) 2 h。阻塞的解决方案被PPV和马伯的墨迹是孵化VP2蛋白(未稀释的杂种细胞上清液)。二次抗体结合辣根过氧化物酶(合)(美国Bio-Rad大力神,CA)是用于检测特定的抗体绑定。屁股沾3,3′,5、5′-tetramethylbenzidine(三甲)现成的显色底物(临床医学产品有限公司,曼斯菲尔德,美国)。

2.6。电子显微镜

净化后由中海超速离心法、悬架的重组PPV VP2蛋白被放在400 -网状碳包覆铜网格(琼脂科学、斯坦斯特德、英国)。蛋白质样品沾2%铀酰乙酸水溶液(Reachim,莫斯科,俄罗斯)和检查morgagni - 268电子显微镜(范,埃因霍温,荷兰)。

2.7。血清样本的描述商业测试

猪血清样本化验anti-PPV抗体的存在使用商业INGEZIM PPV紧凑工具包(Ingenasa,马德里,西班牙)。这是一个基于阻断ELISA酶分析技术为猪细小病毒VP2蛋白,使用马伯特定和杆状病毒表达系统生成的重组衣壳VP2。血清进行测试根据制造商的建议。两个阻塞(BP)百分比值被用于结果解释:样品与英国石油(BP)高于30%被认为是积极的和样品与英国石油(BP)低于25%被认为是负面的。样品与英国石油(BP)在两个值之间视为可疑。

2.8。间接ELISA

聚苯乙烯微量滴定板(Nerbe + Winsen / Luhe,德国)被涂上一层50 ng /重组的PPV VP2蛋白稀释于100年μL 0.05 carbonate-bicarbonate涂层缓冲区(pH值9.6)和孵化一夜之间在4°C。盘子洗了三次PBST(磷酸缓冲盐0.05% (v / v)渐变20日(美国Bio-Rad,里士满,CA)) 150年,然后被添加μ每口井的L阻止缓冲区(1 x Roti-Block,卡尔罗斯GmbH & Co .)和孵化室温1小时。阻塞后,盘子都洗PBST和100年的三倍μL整除的血清标本,稀释1:400年PBST 1% BSA,被添加到井。抗原浓度和血清稀释水平测定滴定测定达到最优条件敏感性和特异性(数据没有显示)。2 h后的孵化37°C,板块与PBST冲洗三次。HRP-conjugated兔子anti-pig免疫球蛋白(美国西雅图Sigma-Aldrich生物科学)稀释1:30 000年PBST,含有1% BSA, 100年被添加到井μL整除和孵化1 h在37°C。盘子洗如上所述。绑定特定的抗体是可视化的100年μ信用证的三甲衬底(临床医学产品有限公司,曼斯菲尔德,美国)。10分钟后孵化的室温,反应停止增加100μ信用证的10%硫酸,光密度(OD)以450海里(参考滤波器620海里)。

2.9。单克隆抗体的生产

PPV马伯,重组VP2生产本质上所描述的科勒和Milstein34]。八周大的雌性BALB / c小鼠(从育种殖民地获得创新中心的医学,维尔纽斯,立陶宛)免疫在天0,28日,56的皮下注射50μ克重组PPV VP2蛋白。一个初始免疫的抗原是乳化完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)。后续免疫进行无佐剂,抗原溶解在PBS。最后注射后三天,小鼠脾细胞与Sp2/0-Ag 14小鼠骨髓瘤细胞融合使用聚乙二醇1500 (PEG / DMSO溶液,Hybri-Max Sigma-Aldrich)。混合细胞生长培养基中选择补充了次黄嘌呤,氨喋呤,胸苷(50×帽子媒体补充,Sigma-Aldrich)。浮在表面的样品从井与可行的克隆筛选的间接ELISA(如上所述)使用山羊anti-mouse免疫球蛋白(Bio-Rad)稀释1:5000年来检测特定抗体PPV VP2。杂种细胞分泌特定抗体PPV VP2蛋白被限制subcloned两次稀释测定。杂种细胞细胞保持完整的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Biochrom,柏林,德国)含15%胎牛血清(Biochrom)和抗生素。抗体在杂种细胞文化上层清液同形像使用鼠标单克隆抗体isotyping工具包(皮尔斯,热科学)按照制造商的协议。

2.10。免疫荧光分析

马伯的反应分析了PPV-infected细胞免疫荧光试验(IFA)使用猪细小病毒FA衬底幻灯片(美国普尔曼VMRD, Inc .)包含固定猪睾丸细胞感染和未感染猪细小病毒毒株KY-11。幻灯片治疗根据制造商的协议,孵化与未稀释的杂种细胞上清液和发达与异硫氰酸荧光素(FITC)标记二次抗体(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。应用幻灯片被荧光显微镜观察奥林巴斯ix - 70(奥林巴斯、东京、日本)。

3所示。结果与讨论

3.1。表达和纯化的PPV VP2在酵母菌种

基因编码PPV VP2源自核酸提取从PPV-infected细胞培养获得。1700个基点序列扩增PCR测序和确认是相同的VP2基因猪细小病毒毒株NADL-2(基因库条目NC001718数量)。基因克隆到酿酒酵母表达载体pFX7 galactose-inducible启动子。sds - page分析诱导酵母生物量的溶解产物显示大约64 kDa(图的主要蛋白带1,巷2)。没有额外的蛋白质带观察原油溶解产物酿酒酵母窝藏空向量pFX7酵母(图1离心后,莱恩1)。溶菌产物通过30%蔗糖垫,嵌重组蛋白颗粒受到CsCl-gradient离心。中海梯度显示重组PPV VP2蛋白(图1巷3)分数的浮力密度1.286 - -1.308 g / mL。

在几个制备过程、纯化重组的收益率PPV VP2蛋白被发现8 - 9毫克每升诱导酵母的文化。没有明显使用新鲜的或冷冻生物质产量差异。中海梯度纯化后,重组VP2蛋白透析对PBS和存储在PBS−20°C包含50%的甘油。

形成一种的PPV VP2蛋白被负染色电镜证实。典型的二十面体结构细小病毒的直径大约有25 - 30 nm观察表明PPV VP2蛋白自组装是一种(图2(一个))。一种生产的PPV酿酒酵母表达系统类似于之前在昆虫细胞生成(35(PPV)或原生粒子17]。治疗25毫米EDTA或10毫米EGTA没有造成一种重组的离解表明组装结构不需要二价离子(数据未显示)。PPV重组,VP2-derived一种被发现是稳定的冻干和存储时−20°C超过一年和一种完好无损时在PBS resolubilized没有五聚物或破坏粒子是由电子显微镜观察(图2 (b))。此外,ELISA结果使用刚做好的和resolubilized PPV VP2抗原被完全整合(数据未显示)。种的稳定性是至关重要的,确保他们成功的运输和可能的应用程序在现阶段的测试中。

VP2蛋白的主要免疫原最细小病毒(36,37]。因此,成功地用于PPV感染的血清学诊断以及流行病学研究(24]。此外,VP2蛋白的主要代理开发疫苗(38]。PPV的需要稳定的一种重组,一些表达系统测试代替杆状病毒表达系统的主要来源的抗原市场(26]。大肠杆菌(23),干酪乳杆菌(21最近,酵母毕赤酵母属pastoris(27)据报道已经成功地用于生产PPV VP2蛋白,但车牌区域形成这些表达系统尚未得到证实。据我们所知,我们的研究提供了第一个证据稳定的重组PPV VP2一种杆状病毒表达系统中不会产生。

酿酒酵母表达系统已被证明是高效生产人类细小病毒抗原的一种诊断相关性(28,29日和猪圆环病毒39]。因此,它代表了一种潜在的系统来满足需要VLP-forming抗原检测和区分新发现的猪。

3.2。间接免疫球蛋白PPV ELISA

PPV VP2 protein-derived一种生成酿酒酵母被用来开发一个PPV-specific IgG抗体的间接ELISA检测猪血清标本。为了测试的抗原性质yeast-derived种,187份血清样本进行了测试使用PPV INGEZIM紧凑的测试作为黄金标准,进一步与新开发的间接免疫球蛋白g PPV ELISA测试。化验都是并行执行每个血清样本以确定新的间接的敏感性和特异性免疫球蛋白PPV ELISA。新的分析计算的截止值的平均OD值39 -血清(确定商业套件)+ 2个标准差()导致95%的信心。平均OD值和SD分别为0.150和0.090,分别。因此,血清与OD值高于0.330被认为是积极的()和OD值低于这个截止被评估为负(在新开发的间接免疫球蛋白g PPV ELISA。

38的39个血清测试与消极负面的商业工具评估间接免疫球蛋白PPV ELISA。137的积极和所有11个怀疑INGEZIM测定的血清样本显示下面的OD值间接免疫球蛋白的截止PPV ELISA和被认为是消极的(表1)。因此,特异性和灵敏度计算的间接免疫球蛋白PPV ELISA 97.4%(38/39)和93.4%(128/137),分别。所有9假阴性样品的新试验弱阳性INGEZIM装备显示阻塞在33 - 45%范围内。以上样品BP等于30%被认为是积极的商业工具。唯一的假阳性样本间接免疫球蛋白PPV ELISA显示OD = 0.354,略高于0.330的截止OD。为了获得更精确的估计新试验的敏感性和特异性,额外的评估和替代血清样本化验必须做更多的工作在未来。另外,测试的精度可以提高使用其他格式的ELISA。总之,目前的研究结果是承诺使用PPV VP2抗原合成的酵母酿酒酵母在诊断包。

3.3。代的单克隆抗体及其特征

纯化重组PPV VP2蛋白用于免疫小鼠和生成PPV VP2-specific马伯。经过筛选和克隆的阳性杂交瘤细胞克隆,9获得了稳定的杂种细胞细胞株产生的抗体免疫球蛋白。六马伯产生的杂种细胞克隆的IgG1亚型,剩下的三个是IgG2a亚型的发现。所有与重组马伯的反应特别PPV VP2蛋白ELISA,不与其他yeast-expressed反应蛋白质作为负控制(表2)。

的本质特征识别的抗原表位马伯,他们在免疫印迹反应性进行了分析。马伯4 f11 16 g11 25 c5, 6 d1, 10 a7公认SDS-denatured PPV VP2蛋白在免疫印迹试验(图3,通道2)。这一结果表明,这些马伯识别SDS-denatured抗原表位的PPV VP2蛋白。其他四个马伯(克隆1 f8, 16 a1, 22 g2,和23 a7)不认识SDS-denatured PPV VP2蛋白免疫印迹试验(数据未显示),这表明这些马伯识别conformation-dependent抗原表位。

马伯的特异性被IFA进一步分析验证马伯的能力认识到本地病毒粒子。为此,商业猪细小病毒控制幻灯片含有病毒感染和未感染细胞固定。没有马伯的反应与未感染细胞,证实了试验的特异性(图4-控制)。两组马伯识别线性或构象与感染细胞抗原表位的反应;然而,只有后者的生产图片与夏普nucleus-shaped模式。相比之下,mab识别线性抗原表位产生信号在核外,但在较小的强度(图4)。这种差异可以解释为PPV的可能性,一种完成他们的组装在细胞核形成构象抗原表位。考虑到三聚物易位模型对于其他细小病毒(40],构象表位可能只有在完整的衣壳而不是配件砖或五聚物形成的VP2蛋白。这种可能性强调的重要性,正确地组装一种诱发强烈的免疫反应在使用重组抗原作为潜在的疫苗。需要做进一步的抗原决定基映射回答如果线性抗原表位保持接近完整的车牌区域表面或结构中是隐藏的。然而,我们马伯代表一个有吸引力的工具生成PPV为研究细胞内感染,衣壳的形成过程。

的PPV VP2-derived一种生成酿酒酵母还没有被测试可能在猪作为疫苗;然而,考虑到结果在小鼠免疫原性的抗原结构和描述在这项研究中,这是一个有吸引力的替代目前使用的PPV重组疫苗。在以前的研究中,PPV VP2-derived一种已经被证明是有效的抗原决定基运营商老鼠引起强烈的免疫反应(41,42]。此外,酵母表达系统不需要额外的污染物消除过程描述为杆状病毒表达系统(35这种重组亚单位疫苗制备。因此,PPV VP2-derived中产生一种酵母酿酒酵母是一种很有前途的新PPV疫苗开发的平台。

4所示。结论

在这项研究中,我们已经表明,酵母酿酒酵母是一个合适的主机的生产重组PPV VP2蛋白作为免疫原性一种稳定。可以使用的重组yeast-derived PPV VP2蛋白的间接ELISA检测PPV-specific猪血清中免疫球蛋白抗体特异性和灵敏度高。马伯提高对PPV yeast-derived VP2一种识别病毒感染细胞和分化构象和线性抗原表位的PPV VP2蛋白。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

本研究支持的立陶宛科学委员会,批准号MIP-060/2011。

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