文摘

暴发的数量增加,H5和H7 LPAI和高致病性禽流感病毒在家禽主要公共和动物健康的影响。这些子类型的持续快速发展和新出现的变异影响的能力进行有效的监测。逆转录病毒pseudotypes轴承流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白是一个灵活的平台,敏感,容易标准化的流感病毒血清学检测。我们描述一个多路复用试验中和抗体,研究都是针对流感H5和H7公顷。此分析允许的测量对两种抗原不同的中和抗体反应在同一血清/血浆样本从而增加血清学数据的数量和质量,可以获得有价值的血清。血清来自鸡与单价H5N2疫苗接种,鸡与二价H7N1 / H5N9疫苗接种,或火鸡自然感染H7N3病毒进行评估在这个试验,结果与HI试验获得的数据相关。我们表明,pseudotypes高度基本冷链储存条件下稳定,在多次冻融。我们建议这个健壮的分析可能有实际效用攷虑serosurveillance和疫苗研究全球资源有限的地区。

1。介绍

增加数量的H5和H7低致病性禽流感的暴发(LPAI)和高致病性禽流感(HPAI)病毒在家禽主要公众和动物健康的影响和重大的经济影响。流感感染的证据或疫苗接种效率的评价在禽类物种通过测量评估对禽流感病毒的免疫反应和血清学检测代表serosurveillance研究的一个重要工具尤其是新爆发的地方。虽然疫苗接种,结合改进的生物已经成功地防止了显著的死亡率和生产损失,持续的病毒的进化需要监测系统的发展,以确保疫苗接种仍是有效的(1]。

A型流感病毒感染家禽分为两组(高致病性禽流感和LPAI)的基础上引起疾病的能力和不同人类和动物健康的影响。证据(2,3)支持的假设高致病性禽流感病毒发生突变的结果后,从野生鸟类病毒已被引入到家禽和因此,相信LPAI病毒是高致病性变异的祖细胞(4]。不仅被认为是重要的控制高致病性禽流感病毒,但也在家禽LPAI菌株(5)尽管目前知识突变的机制从LPAI高致病性禽流感被预测不足,流感病毒会变异成高致病性禽流感变异(6,7]。尽管重大努力投入禽流感疫苗的发展,血清学监测代表的一个主要工具评估禽流感的免疫状态人群特别是对于某些亚型变异的能力(抗原漂移机制)由于他们长期循环接种疫苗人群(8]。血清学代表了一个强大的和敏感的方法检测禽流感抗体的存在人口但抗原漂移的发生和转移时,必须考虑到它可以呈现subtype-specific血清学测试(嗨或中和化验)为新太敏感或出现的流感毒株9]。此外,与抗原血清学的大不同的流感病毒可以发生由于先例疫苗接种或暴露,导致一个更复杂的血清学调查结果的解释。为了解决这些问题,新的化验的总结在附件咨询汇总(2010年5月)的FAO-OIE-WHO禽流感在人类与动物界面联合技术咨询(2008年10月7号到9号,维罗纳,意大利)使建议“开发和验证更敏感和具体测试检测禽流感病毒抗体在禽流感和nonavian物种包括人类”(10]。作为替代率明显高于流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因与内部基因相比,逆转录病毒和慢病毒pseudotypes轴承血凝素和神经氨酸酶病毒包膜糖蛋白下放的理想工具来监控病毒进化的影响对血清学结果正如前面所示(11- - - - - -14]。他们可以作为敏感仪器,low-containment测量抗体反应对高致病性禽流感和流感毒株(LPAI15)和潜在的对所有不同的流感病毒亚型(16,17),因为在小说的可用性病毒RNA / cDNA、公顷/ NA基因测序,欣然克隆或定制合成,并准型慢病毒载体在中和化验准备使用。因此,本试验可以不断更新测量当前疫苗和疗法的疗效以及serosurveillance。同时,使用慢病毒pseudotypes显示额外的优势比其他血清学检测自这个系统可以适应“多路传输格式”,有益的影响,需要进行大规模血清学调查。在这项研究中,流感的灵活性pseudotype系统已经开发利用多元分析研究中和抗体反应针对已经属于流感组1(高致病性禽流感H5N1病毒进化枝1 /越南/ 1194/2004和高致病性禽流感进化枝2.1.3.2 /印尼/ 5/2005)和组2(高致病性禽流感H7N1 /鸡/意大利/ 13474/1999)。整合不同的荧光素酶(Renilla和萤火虫)报告基因的慢病毒基因组两个单独的pseudotypes,每个轴承表面糖蛋白抗原不同的信封,中和抗体的存在两个流感已经评估在一个血清样品在一个试验板。最初,从鸡血清与单价疫苗接种(H5N2)或从火鸡在H7N3自然感染流感疫情被pseudotype测试中和试验(pp-NT)使用“monoplex”格式和血清学试验结果与标准参考嗨测试。随后,H5和H7流感pseudotypes被用于筛查的一组血清收集从鸡接种二价疫苗(H5N9 / H7N1)使用多路传输格式,subtype-specific抗体反应在同一血清样本针对H5和H7 pseudotypes进行评估开发的使用两个不同的记者和提供一个新的分析格式攷虑serosurveillance和疫苗的研究。我们也表明这些pseudotypes高度基本稳定在冷链储存条件−20°C和+ 4°C和多次冻融后使这些化验可能适用于使用攷虑在流行地区我们已经描述了最近对狂犬病和狂犬病毒(18,19]。

2。材料和方法

2.1。血清样本

禽流感血清都是由粮农组织、世界动物卫生组织和国家参考实验室对新城疫和禽流感(史Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie)和由十H5阳性血清收集鸡接种灭活H5N2(/鸡/绅士/ 28159 - 232/1994)疫苗(没有。1 - 10),十血清H7积极的(没有。11日至20日)从火鸡收集在一个意大利爆发造成的LPAI H7N3病毒(/土耳其/意大利/ 2002),收集的十H5和H7血清阳性鸡接种灭活二价疫苗生产LPAI H7N1(/鸡/ 1067/1999),和H5N9(22 /鸡/意大利/ / 1998)压力。40 -血清被包括在研究和从鸡获得测试AI antibody-free通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和琼脂糖凝胶免疫扩散(AGID)分析使用标准协议前面描述的(20.,21]。此外,两个超免疫绵羊血清,SH454提出反对NIBRG-14 (H5N1公顷)和02/294提出反对/鸡/意大利/ 13474/1999 (H7N1公顷),被NIBSC友情提供。

2.2。血细胞凝集抑制(HI)试验

所有禽流感血清研究测试了嗨在粮农组织,世界动物卫生组织,和国家参考实验室对新城疫和禽流感,史Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie不同参考抗原通常用于禽流感监测在意大利,即H5N2(/土耳其/意大利/ 1980),H7N3(/土耳其/意大利/ 9289 / V02), H7N1 (A /非洲燕八哥/英国/ 983/1979),H5N9(22 /鸡/意大利/ / 1998),和H7N1(/鸡/意大利/ 1067/1999)。嗨测试,使用标准协议如前所述[22]。

2.3。萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶H5和H7 Pseudotypes

慢病毒载体(携带荧光素酶报告基因,pCSFLW)准型与HA包膜糖蛋白来源于高致病性禽流感H5N1病毒(进化枝1 /越南/ 1194/2004和进化枝2.1.3.2 /印尼/ 5/2005)和高致病性禽流感H7N1病毒(/鸡/意大利/ 13474/1999)生产(如前所述23,24),除了神经氨酸酶活动提供的同源NA质粒代替外源性细菌NA。同时,使用相同的协议和同一批次的转染HEK 293 t / 17生产商细胞,高致病性禽流感H7 pseudotypes(/鸡/意大利/ 13474/1999)携带Renilla荧光素酶基因(pCRLFW),生成(24]。利用萤火虫荧光素酶标记感染HEK 293 t / 17靶细胞,滴定H5和H7流感pseudotype进行(23)为了计算所需的输入病毒剂量进行pseudotype-based中和化验。流感的滴定度pseudotypes被发光量化表达式,表示为相对发光单元(RLU)衡量光度计(96年GloMAX Promega)。两个控制所需的滴定:消极的控制(细胞)和Δ-envelope糖蛋白(无血凝素和神经氨酸酶)。此外,pCSLZW稳定性研究,表达lacZ基因(18),采用协同进化枝1 /越南/ 1194/2004公顷和外源性细菌NA(1单位/毫升;σ,英国)产生lacZ pseudotype病毒和感染HEK 293 t / 17细胞检测使用半乳糖苷基质如我们之前所述18]。慢病毒pseudotypes轴承狂犬病CVS-11 [25和hiv - 126包膜糖蛋白是用于比较。

2.4。萤火虫荧光素酶(Monoplex) pp-NT化验

血清样本(5μL)是双重的连续稀释培养基(DMEM GlutaMAX补充与青霉素、链霉素的边后卫15%和1%)和混合pseudotype病毒(500000年RLU荧光素酶输入)1:1 v / v比率。孵化后37°C 1小时,1×10⁴HEK 293 t / 17细胞被添加到每个的白色96 -平底细胞培养板。48小时后,pseudotype转导的滴定度获得每一系列稀释点表示为RLU /毫升,和一个算术平均计算。为每个血清样本,rlu规范化并与信号检测在缺乏pseudotype病毒中和(相当于100%)和消极的信号控制中和(相当于0%)。50%的抑制剂量(IC₅₀)测定血清稀释导致减少了50%的倒数的单轮感染(记者基因介导的信号)。

2.5。萤火虫和Renilla pp-NT试验(多路)

允许检测对两种不同的流感病毒中和抗体反应(H5和H7)相同的96 -平底细胞培养板,固定数量(对应500000 rlu估计之前pseudotype滴定)的流感pseudotypes(一个包含萤火虫记者基因和其他Renilla记者)被添加到每个在这双重的连续稀释血清样本(5μL)分发连同细胞培养基(DMEM GlutaMAX补充与青霉素、链霉素的边后卫15%和1%)。48小时后,中和抗体反应对每个亚型检测到使用Dual-Glo试剂(Promega),区分这两个报告基因作为制造商的详细说明,以便中和抗体滴定度为每个流感pseudotype可以同时记录每个血清样本。

2.6。数据分析和序列分析

数据分析是进行使用Excel和GraphPad棱镜(第6版)。抗体滴定度观察H5 (A /越南/ 1194/2004 /印尼/ 5/2005)和H7(/鸡/意大利/ 14374/1999)流感pseudotypes monoplex和多路复用化验使用时被表示为几何平均效价(格林尼治时间)。首先,集成电路₅₀值计算,如上所述,血清稀释导致50%中和活动减少为每个血清样本(重复测试)被转换为对数刻度。随后,重复观测的几何平均数计算。统计分析的数据和相关系数(皮尔森相关分析)进行了使用GraphPad棱镜。径向网格树和哈氨基酸身份与MATLAB构造(MathWorks)。

3所示。结果

3.1。H5和H7慢病毒Pseudotypes建设

我们构建H5N1和H7N1 pseudotypes(/越南/ 1194/2004血凝素和神经氨酸酶,A /印尼/ 5/2005血凝素和神经氨酸酶,和一个/鸡/意大利/ 13474/1999公顷和NA)编码萤火虫荧光素酶报告基因,另外,用于多路检测,H7N1 pseudotype(/鸡/意大利/ 13474/1999公顷和NA)编码Renilla荧光素酶的记者。这些pseudotype血清学抗原之间的系统发育关系(和其他抗原用于这项研究)可以在径向可视化树图1。用萤火虫荧光素酶作为感染的标记HEK 293 t / 17细胞,结果表明:高滴定度功能pseudotypes轴承这三种不同包膜糖蛋白对成功产生(数据没有显示)。基于这些病毒滴定度,决定用500000 RLU作为输入病毒剂量为后续中和化验。

3.2。H5慢病毒Pseudotypes的稳定

冷链的要求和可靠性存储在实验室进行人工智能血清学差异很大,特别是在资源有限的地区。因此,如果这些pseudotype-based化验要采用这些地区在未来,它是假定,主要由于成本原因,lacZ将选择的报告基因,这些实验室可能频繁中断理想pseudotype储存条件(−80°C)或者只是可能没有访问−80°C冰箱。因此,我们进行了一系列的/越南/ 1194/2004公顷pseudotype病毒的储存稳定性调查这种病毒的高温−20°C(标准冰箱),+ 4°C(标准冰箱),室温和通过对pseudotype病毒多个冻融循环。最初的滴定度H5 lacZ pseudotype 4.3×10⁵IFU /毫升和> 80%传染性保持五冻融循环后(图2)。同时,pseudotypes轴承狂犬病CVS-11和hiv - 1包膜糖蛋白受到相同的冻融方案和活动被发现失去约4%和9%,分别每冻融循环(图2)。存储温度变化的关系及其影响pseudotype可行性,人物3表明,H5 /越南/ 1194/2004公顷pseudotypes储存在−20°C维持传染性(> 80%相比,存储在80°C)−至少6个月,使这些化验容易适用于绝大多数的实验室。也显示在图3另外,这些病毒可以被存储在C + 4°长达4周传染性减少(50%)和室温(23°C)为1周(传染性减少50%)。

3.3。Monoplex pp-NT使用高致病性H5和H7流感Pseudotypes化验

三种面板的血清(H5阳性,H7正,40 -血清样本)最初测试使用monoplex pseudotype-based格式。初步进行了初步研究,H5N1超免疫(SH454)和H7N1(02/294)羊血清进行中和流感pseudotypes轴承的能力从H5N1 /越南/ 1194/2004,H7N1 /鸡/意大利/ 13474/1999。H5流感pseudotypes被SH454中和血清(100%抑制pseudotype条目1:1280稀释血清)但不是由02/294血清而H7 pseudotypes中和了02/294(100%的抑制在稀释1:1280)但不是SH454。这种缺乏cross-neutralizing H5和H7亚型之间的抗体反应符合不同的聚类,在组1、组2,HA-subtypes系统发育关系分析的基础上流感亚型。根据这一分析,H5 HA属于组1“集群1”(H1和H2,代替和H7 HA属于组2“集群7”(连同H10和H15) (27]。随后,一组十个血清收集从鸡接种单价灭活疫苗生产与H5N2应变(/鸡/绅士/ 232/1994)运行,以便更全面评价的效用试验在禽流感血清学(测试使用H5N1 /越南/ 1194/2004,H5N1病毒/印尼/ 5/2005,和H7N1 /鸡/ 13474/1999准型粒子)。血清学资料通过pp-NT化验也比你好获得的测试。所有10个血清积极通过嗨测试使用一个H5N2 /鸡/意大利/ 1080参考抗原(滴定度从1:128:2048)被pp-NT试验还证实积极使用H5N1 /越南/ 1194/2004(格林尼治时间范围1:113:2560)和H5N1禽流感A /印尼/ 5/2005(格林尼治时间范围1:60 - 1:2560)(表1)。这个面板测试H7高致病性禽流感pseudotypes时,六个十血清也发现积极的格林尼治时间从1:28日至1:113(表1)。

如图5(一个)通过嗨,滴定度获得相关与滴定度获得使用高致病性禽流感H5 pseudotypes属于两个不同的演化支:进化枝1 /越南/ 1194/2004 (,),进化枝2.1.3.2 /印尼/ 5/2005 (,)尽管已经使用两个血清学检测并不是最佳匹配。氨基酸比例pseudotype抗原之间的身份,嗨抗原和疫苗抗原在图所示4。

它也观察到(图5 (b)),所有10个血清中和H5高致病性禽流感准型病毒但有不同的大小;发现的绝对浓度(表示为平均数±标准差)的H5 /越南/ 1194/2004(222.96)显著低于获得相同的面板测试/印尼/ 5/2005(1206.2)所证实值< 0.0001和当使用学生的分析以及(成对的数据集)(图5)。

接下来,一组十个血清从火鸡自然感染一个H7N3应变(1:32)滴定度从低到高(1:128)所测试的嗨(嗨参考抗原:H7N3 /土耳其/意大利/ 9289 / V02)随后测试使用H7 pseudotypes /鸡/意大利/ 13474/1999,H5 /越南/ 1194/2004。所有十个血清(没有。11没有。20)测试时发现积极H7 pseudotypes与格林尼治时间范围从1:28 > 2560,而只有一个血清样本是积极的(1:28日格林尼治时间)对H5 /越南/ 1194/2004(表2)。

正如前面所示面板的H5阳性血清,血清学方法进行比较,以评估是否pseudotype中和试验反映的结果同你好成对数据集上测试使用回归分析(来自所有51也包括消极的血清样本)和皮尔森的相关测试。这个分析的结果揭示了高度显著相关(两种检测得到的抗体滴度之间)。pp-NT之间的相关系数和嗨H7小组积极为0.72(图6)。

3.4。多路复用分析通过使用高致病性禽流感H5和H7流感Pseudotypes表达萤火虫和Renilla荧光素酶报告基因

从鸡血清收集小组与二价灭活疫苗接种疫苗(BV)生产禽流感疫苗株H7N1 (LPAI /鸡/意大利/ 1067/1999)和H5N9(22 /鸡/意大利/ / 1998年,LPAI), monoplex(如之前所述)和多路复用(利用萤火虫/ Renilla) pp-NT化验都是对H5 /越南/ 1194/2004和H7 pseudotypes /鸡/意大利/ 13474/1999。如表所示3,9/10 monoplex测定血清测试时证实了积极的反对H5 /越南/ 1194/2004与滴定度表示为GMT介于1:28日至1:905;只有一个血清样本(n。H5 + 7 s3),积极通过嗨(1:64),被pp-NT发现负面(格林尼治时间= 10)。中和抗体反应与H5 /印尼/ 5/2005也发现阳性血清(10/10)与格林尼治时间介于1:28岁,1:905和显示,为H5阳性血清的面板(见表1格林尼治时间),总体高于H5N1 pseudotypes属于进化枝1。也是H7N1 pseudotypes GMT镜像可以同H5N1 pseudotypes(格林尼治时间从1:40 - 1:453)与血清样本(n。H5 + 7 s3)负(格林尼治时间= 10)和两个血清提出积极的阈值1:40。

随后,中和抗体滴定度,得到了标准和双H5和H7化验进行时(格林尼治时间报告在表3),显示很强的相关性之间的标准和双pp-NT化验的结果(0.86;;皮尔森相关;图7)。

中和抗体滴定度得到monoplex化验(使用H5 /越南/ 1194/2004携带萤火虫荧光素酶基因)镜像获得相同的血清面板测试时对H5 /越南/ 1194/2004(萤火虫基因)和H7 /鸡/ 13474/1999携带Renilla基因(,)。类似的结果观察抗体反应对H7 monoplex /鸡/ 13474/1999测试和多元分析(,)(图7)。中和抗体反应pp-NT分析观察到的大小反映这些标准获得的嗨测试虽然嗨测试必须执行评估HA-mediated流感抗原抗体反应与两个H5N9(22 /鸡/意大利/ / 1998)和H7N1 (A /鸡/意大利/ 1067/1999)(表3)。

4所示。讨论和结论

自1997年以来,H5和H7家禽中暴发得越来越频繁,它可能是由于一系列复杂的因素,如改进的诊断工具,气候波动和家禽产品(贸易流动的变化28]。一个合乎逻辑的步骤理解和限制的可能传播禽流感病毒对人类和鸟类物种之间控制循环是人工智能的监控病毒在家禽接触最初通过积极感染的识别。然而,由于流感病毒的能力规避免疫通过感染或疫苗接种的进步抗原漂移,血清学监测禽流感样本也是尤为重要的29日,30.]。血清学技术扮演着一个关键角色,流感监测的各个方面,疫苗开发和评估和他们可以用来评估过去感染抗体的存在和响应传播流感病毒或疫苗组件(31日]。从一个兽医的观点来看,血清学和病毒学监督是必要的,不仅是监测系统对禽流感病毒在家禽中传播的物种也作为预防和控制工具对于那些菌株可能大流行潜力(32,33]。

最近的研究提供了动力,禽流感血清学的未来,而不是朝着一个分析方法,是实现策略,包括传统的和新技术结合使用验证和标准测试。比较血清学旨在实现一个更全面的看法的血清学反应和新分析像pseudotype-based中和试验提出了研究是关键(14,23]。我们先前已经表明,逆转录病毒pseudotypes (MLV)基于/越南/ 1194/2004可以用来测量在鸡接种H5N1抗体反应,H5N2, H5N3 H5N7, H5N9禽流感病毒(11]。在当前的研究中,慢病毒pseudotypes曾形成的基础的发展多路记者(萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶)为H5和H7亚型病毒中和试验。pseudotype系统允许测量对两种抗原的中和抗体反应不同的AI HA包膜糖蛋白在同一个禽流感血清样本。的单个组件用于建设pseudotypes用于此多元分析已被选定的可互换的质粒,我们有可供分析的发展。这些是逆转录病毒和慢病毒质粒编码呕吐- - - - - -波尔核心结构蛋白、血凝素和神经氨酸酶表达质粒,和逆转录病毒载体将报告基因。Renilla和萤火虫荧光素酶被在这项研究中,但潜在的广泛的报告基因可用于这些化验(绿色荧光蛋白(GFP),红(RFP) /黄(YFP),胚胎分泌碱性磷酸酶(SEAP)和lac-Z) (18,19,34,35]。为了让pseudotype化验有广泛的适用性和部署潜力在不同实验室在世界范围内,不同的记者系统的可用性是非常可取的。HIV-based GFP报告质粒(pCSGW),我们前面描述的上下文中pseudotype-based中和试验(23),修改了PCR subcloning表达报告基因。这些都是萤火虫荧光素酶(pCSFLW) Renilla荧光素酶(pCSRLW)虫胶- z (pCSLZW) [19,24]。三种类型的基于荧光素酶记者化验也最敏感的和可再生的和最简单的使用时间和下游数据分析的实践。这是他们选择的原因在当前研究中描述的血清学检测。然而,由于成本相对较高的必要的试剂(荧光素酶试验)和必要性专用设备(光度计),荧光素酶化验可能有限的实验室资源匮乏地区的适用性。GFP基础化验不需要任何辅助试剂,但需要专门的设备(荧光显微镜或96孔板流式细胞仪设备)。基本的荧光显微镜的成本不过现在不到5000美元使这项技术适用于中间资源缺乏实验室部署。基于lac-Z化验是最廉价和必要的试剂成本有效可用的和专门的设备不必要的使它们适合在资源匮乏的地区部署serosurveillance在家禽中可能会执行。除了萤火虫/ Renilla(本研究中使用),技术上是可行的多路复用双pseudotype病毒携带绿色荧光蛋白/ RFP和lacZ / SEAP组合资源缺乏实验室使用。Lac-Z因此选为报告基因的选择“攷虑”适用性研究涉及pseudotype病毒的冻融和储存−80°C设施以外的类似的研究是最近与lyssavirus pseudotypes [18]。我们的结果表明他们非常适合等使用他们随着时间的推移,在不同的存储温度稳定,当受到冻融的多个周期。有趣的是pseudotype病毒轴承艾滋病毒包膜糖蛋白是更敏感的冻融过程比轴承流感病毒或狂犬病毒糖蛋白。这是最有可能因为艾滋病毒糖蛋白冻结时相对不稳定。此外,使用双报告基因系统多路检测,interassay变异性可能减少,因为只有一个血清稀释系列需要执行。相同的靶细胞用于制备两种病毒和抗体反应H5亚型病毒可以作为一个内部“serocontrol H7亚型的抗体反应,反之亦然作为两个单独的荧光素酶记者了。

来自pp-NT化验结果显著表现在monoplex和多路复用H5 ()和H7 ()流感毒株的结果monoplex镜像可以同多元分析(图7)。这个系统可以随后精炼的可能性增加多路复用功能(使用更多的记者系统通过检测发光和荧光信号,例如,GFP / RFP萤火虫/ Renilla荧光素酶),它可以轻易地适应高通量如果使用大型血清面板。也有有益的经济影响的使用试验以来,对两种病毒抗体反应不需要高级别控制设备和试剂相对少于嗨和MN测试。这里描述的pp-NT分析既是“血清保留”和“抗原节约”只有≤5μL,特别是对于某些高致病性禽流感毒株,小于10μL(对应于输入10 e6 pseudotype RLU) pseudotypes / 96孔板是必需的。可能与多路复用pp-NT试验测量中和抗体反应对H5和H7流感病毒的大板和漂移变体更快和更准确地比费力microneutralization野生型病毒,从而提供全面的数据在禽流感病毒抗原进化。

此外,嗨的使用试验的主要限制是不实际一般流感显著水平的筛选intralaboratory可变性在人类血清学(36]。它需要一个更大数量的血清亚型之间发生大需要考虑。相反,pseudotype粒子已被证明是特别敏感,可能在流感subclades和检测抗体反应和变化也显示静态显著相关性相比HI试验(表1)(数据5和6)[23]。最近的研究提出的可能性低的HA峰值成慢病毒pseudotypes,野生病毒相比,使pseudotypes更敏感,允许绑定抗原抗体的网站哈头和哈茎(37,38]。基于获得的数据在这项研究中,这项试验是保证未来改进的建议开发新的化验概述FAO-OIE-WHO联合技术咨询文档中(10]。此外,这项研究提供了基础为未来的复合研究合作实验室可以涉及确定的内部和多个实验室的变异水平pp-NT测定低于发现你好或者MN使pp-NT分析成为大规模接受测试,不仅在禽流感和人类流感监测的背景下也为其他综合监测”忽视“流感毒株(循环中马、猪、海豹,和狗。)(39]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

爱莉Molesti和爱德华·赖特同样都贡献给了工作。