TCR分布与克隆性的特征/T细胞亚家族在b细胞非霍奇金淋巴瘤患者中的作用

摘要

受限制的T细胞受体（TCR）V/ V.曲目表达和克隆的扩张在血液恶性恶性肿瘤患者中观察到尤其是推定肿瘤相关抗原的T细胞。进一步表征B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中的T细胞免疫状态，我们调查了TCR v的分布和克隆性/ V.B-NHL患者外周血(PB)、骨髓(BM)和淋巴结(LN)的库。4例新诊断的B-NHL病例，包括3例弥漫大b细胞淋巴瘤(DLBCL)和1例小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。TCR V的限制性表达/ V.具有不同分布模式的亚毛利可以在来自四个患者的所有PB，BM或LN中检测，部分亚家族T细胞显示克隆增殖。至少一个克隆扩展的v亚家族成员在每位患者的PB中发现。但是，TCR V的表达模式和克隆性/ V.在不同的免疫器官发生变化，并在不同的患者中表现出个体特征。无性繁殖的V5，V.6, V8只在PB中检测到，而在BM和LN中检测不到2和V可以在PB和BM / LN中检测到3。总之，结果提供了TCR的分布和克隆性的初步概况B-NHL患者PB、BM和LN中的T细胞亚家族相似无性膨胀VPB和BM中的亚家族T细胞可以与相同的B细胞淋巴瘤相关抗原有关，而不同的反应性克隆膨胀/ V.T细胞可能是由于局部免疫应答。

1.介绍

B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）是源自B淋巴细胞的异质淋巴抑制性疾病，其包含约80-85％的NHL新诊断的病例。虽然目前的治疗策略包括标准化疗，未标记或放射性标记的单克隆抗体，但在自体外周血干细胞移植后的高剂量化疗，或同种异体造血干细胞移植，都显着提高了这种疾病的结果，大多数患者复发或成为耐用于前疗法。因此，越来越多地研究了细胞免疫疗法的新策略[1］．

细胞免疫功能差可涉及致癌过程，并在肿瘤患者中更差。此外，肿瘤的进展可能进一步诱导细胞免疫抑制。近年来，基于TCR原理，T细胞受体（TCR）利用特征的分子分析，，， 和基因重排和缺失重排，已被证明是研究T细胞库分布、TCR亚家族多样性的有效技术[2，3.]， t细胞克隆的抗原特异性扩增，以及最近胸腺输出功能[4，5］．这反过来可以有助于表征宿主T细胞免疫状态的特征和癌症患者的T细胞群，以及造血干细胞移植（HSCT）后的外周免疫力曲目重构。

T细胞具有TCR是人T细胞的一小部分（占所有外周血T细胞的1-10％）。这些细胞与效应函数共享T细胞以及天然杀伤（NK）细胞，特别是与树突细胞（DC）相互作用的能力[6，7］．老鼠缺乏T细胞显示出显着增加的肿瘤发病率，并为这些非常规淋巴细胞的免疫监测功能提供明确的证据[8］．人类V.9 v2 T细胞可以以MHC - 不受限制的方式杀死具有或不减少MHC I类分子表达的广谱肿瘤细胞[9- - - - - -14.］．此外,T细胞可以将浸润淋巴细胞迁移到实体瘤中[9]并且可以识别和消除来自骨髓瘤的培养和消除培养的恶性细胞（原代细胞或细胞系）[10.，11.，非霍奇金淋巴瘤[12.，前列腺癌[13.]、肾细胞癌[14.]结肠癌[15.]和鳞状细胞癌[16.］．很明显,T细胞在免疫监测和抗癌反应中发挥着重要作用，并成为越来越有吸引力的肿瘤细胞治疗策略。然而，我们对此所知甚少B-NHL患者的T细胞免疫状态。Bartkowiak等。据报道，高度限制的TCR V亚家族用法是TCR v的主要用法二世(V9）表征慢性淋巴细胞白血病（CLL）[17.］．

T细胞通过特异性TCR识别特异性配体，其是包含或包含的糖蛋白异二聚体或者链。个体变量(V)、多样性(D)、连接(J)和常数(C)区域的重排导致功能TCR的高变量互补决定区3 (CDR3)的创建，该区域在抗原表位的识别中起着关键作用[18.，19.］．T细胞以类似的方式重组和表达克隆多样的抗原受体T淋巴细胞;然而，在TCR中V, D和J元素库和tcr.LOCI的数量有限。tcr.基因包含至少14个功能变量（TCR V.)片段属于四个亚组(即TCR VI到IV)和TCR基因包含至少8种功能TCR V细分为八个V的部分Subfamilies（即，V.1-V.8）。我们以前的研究表明，限制TCR v和V.曲目表达和克隆的扩张从弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的外周血中观察到T细胞[20.］．进一步表征B-NHL中的T细胞免疫状态，我们调查了TCR V的分布和克隆性和V.B-NHL患者外周血(PB)、骨髓(BM)和淋巴结(LN)的库。

2。材料和方法

2.1。样本

4例符合世界卫生组织(WHO)诊断标准的B-NHL男性患者(编号C1-C4)入选本研究。表中描述了这些患者的临床特征1．经患者同意后，4例患者均获得PB样本，4例患者中3例(C1、C2、C3)获得BM样本，3例患者(C1、C2、C4)诊断活检获得淋巴瘤浸润LN样本。所有程序均按照中国广东省卫生局医学伦理委员会的指导方针进行。

2.2。单核细胞分离，RNA分离和cDNA合成

通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离Pb或BM样品（PBMC或BMMC）的单核细胞。根据制造商的方案（Trizol，Invitrogen，USA），使用RNA提取缓冲液从PBMC，BMMCs或LN匀浆中提取RNA。用溴化乙锭染色的0.8％琼脂糖凝胶分析RNA质量。二利用逆转录酶Superscript II Kit (Gibco, USA)，利用随机六聚体引物逆转录成第一个单链cDNA。通过RT-PCR检测，确定cDNA质量2微球蛋白基因扩增。

2.3。用于TCR V的RT-PCR和TCR V.亚家族放大

三种感觉引物和单个TCR C反向引物或8个TCR V引物和单个TCR C引物用于未标记的PCR以扩增TCR V和V.分别。分别为亚科。随后，用荧光引物在5'末端标记的荧光引物与FAM荧光团（C家人或C-fam）（Tib Molbiol GmbH，柏林，德国）。引物序列列于表中2．PCR方法如前所述[21.］．cDNA的Aliquots (1L)扩增20例L和三个V的混合物之一引物和一个c引物或八个v中的一个引物和一个c底漆。最终反应混合物含有0.5 M的正义性和反义性引物，0.1 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl₂，缓冲液和1.25 U Taq聚合酶(美国Promega)。扩增在DNA热循环仪(BioMetra，德国)中进行，94℃变性3分钟，40个PCR循环。每个周期分别为94°C 1 min, 60°C 1 min，和72°C 1 min，最后在72°C延伸7min。PCR产物保存于4℃，可用于基因扫描分析。

2.4。TCR V的Genescan分析和TCR V.亚家族克隆

未标记的PCR产品等分试样（2 l）与荧光团标记的C进行循环反应循环家人或C分别fam底漆。标记径流PCR产物(2L)在94°C下热变性4分钟，用9.5L甲酰胺(Hi-Di甲酰胺，ABI，美国)和0.5L尺寸标准(Genscan-500-LIZ, Perkin Elmer, ABI)。然后将样品装入3100 POP-4凝胶(性能优化聚合物-4,ABI，美国)，并在3100 DNA测序仪(ABI, Perkin Elmer)中进行电泳分析，使用gene escan软件测定大小和荧光强度[21.］．因为位置和引物是固定的，在PCR中观察到的长度分布产品仅取决于V-J的重新排列的大小（在TCR中）或V-D，D-J（在TCR中)基因片段和随机插入的核苷酸(VN(DN)J)。经过自动测序仪的电泳和随后的计算机分析，不同尺寸的产品可以被分离并表示为不同的峰。

3.结果

3．1.tcrv的分布及克隆扩增和V.来自B-NHL患者的外周血中的T细胞

TCR v的表达和V.通过RT-PCR检测亚属，通过琼脂糖凝胶电泳，NO PCR产物对相应的TCR亚家族进行负量。只有三个tcr v中只有一两个亚家族和8种TCR V中的4到6种可以在PB样品中检测到亚家族。V我,V1, V2在所有样品中表达，而v4个样本中均无II表达。此外,V三世(3/4),V3（2/4），v4（1/4），v5 (1/4), V6（2/4），v7(2/4)和V可以在部分案例中检测到8（2/4）（图1)．

TCR v的克隆性和V.通过基谱分析鉴定亚家族T细胞，其用于鉴定CDR3尺寸并在视觉上评估光谱图案。TCR v的多克隆性和V.亚家族T细胞呈高斯分布或近似高斯分布，由多个峰组成(通常为6-8)，任何偏离高斯分布(歪斜曲目)的情况都表明克隆扩展模式。寡克隆性和双克隆性分别表现为单峰和双峰的偏态谱型。寡克隆趋势介于多克隆和寡克隆之间。PCR产物分析只产生一个峰，这意味着CDR3长度相同，命名为单克隆模式[21.，22.］．对于TCR v和V.亚家族克隆分析，仅扩增V在C2和C4病例的样本中检测到III亚家族，而无性扩增的V亚家族T细胞几乎可以在几乎所有的亚属中识别（V除外）1）在不同的患者中。另外，至少一个克隆扩展的TCR V亚家族成员在每位患者的PB中发现。克隆膨胀的分布PB中的T细胞如图所示1和2．

３．２．TCR V的不同表达模式和V.在外周血、骨髓或淋巴结中

v的表达2 / V4 / V.5 / V.6 / V.7 / V8和V.2 / V5例在BM和LN样本中分别缺失。tcrv的克隆扩增在某些TCR V中可发现保留剧目PB，BM或LN中的亚毛利，在不同患者中显示不同的模式（图3.)．在C1患者中，无性扩张V2、V5，V.6, VPB中有8个T细胞亚家族，而无性扩增的V2可在BM中检测到，且未见TCR克隆扩增亚属植物在ln。在患者C2中，V的克隆性4，V.6, V图8以LN的Pb中的寡核苷酸或寡核苷酸趋势或寡核苷酸趋势改变，而在BM中不存在那些的表达。在患者C3中，克隆地扩张和在PB和BM中分别发现T细胞。在患有SLL的C4患者中，无性繁殖的V3和在Pb和Ln中发现T细胞。有趣的是，oligoclonally扩展的v可以在患者C3和C4和患者C4中的PB中发现3 T细胞。

4.讨论

TCR库的改变分析是一种有效的研究方法，可以帮助理解涉及的免疫异常，并使用该信息为临床应用提供指导[23.，24.］．最近的数据表明，T细胞免疫缺陷是不同血液恶性肿瘤的常见特征，包括没有TCR v和V.胸腺近期输出功能(naïve T细胞)降低，TCR亚家族naïve T细胞频率降低[25.］．除了T细胞，T细胞还在免疫监测和抗癌反应中发挥重要作用。不同的TCR V和V.亚家族表达模式在白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)和免疫性血小板减少性紫癜(ITP)患者中已有报道[3.，17.，26.，27.］．然而，对TCR V的分布和克隆性知之甚少和V.B细胞淋巴瘤中的亚甲。在本研究中，我们分析了TCR V的分布和克隆扩展和V.对4例B-NHL患者T细胞进行检测，比较TCR V的不同表达模式和V.在个体的外周血，骨髓，或淋巴结。与之前报道的健康个体和MDS或ITP患者相比[26.，27.]，没有tcr vII Subfamily在B-NHL患者的所有血液，骨髓和淋巴结样品中发现，这意味着普及受限制的TCR V反对表达模式可以是B-NHL患者的特征。而且，V的分布和V.外周血，骨髓或淋巴结之间的样品中的亚属不相同，这可能是由于分布或扩展然而，不同免疫器官中的T细胞需要进一步调查，以总结大型队列样本中的这一特征，并跟进改变t细胞库对病人预后的影响。

喜欢白血病TCR亚家族克隆性的变化[17.，27.]克隆扩展TCR V来自四种B-NHL患者的外周血中可以发现亚属植物，该患者被认为与肿瘤相关抗原有关[17.，20.，27.］．在这项研究中，我们分析了克隆地扩展的v的分布T细胞不仅存在于外周血中，也存在于骨髓或淋巴结中T细胞克隆，类似的克隆扩展V在2例DLBCL患者的外周血和骨髓标本中均检测到2个T细胞亚家族，并且V在一个壳体中，在SLL的一个外周血和淋巴结中鉴定出3个亚家族T细胞;这些初步数据表明这些vT细胞克隆可能响应相同的B细胞淋巴瘤相关抗原。但是，不同的反应性克隆膨胀v外周血，骨髓和淋巴结之间的T细胞可能是由于局部免疫应答。需要进一步调查以确定这些克隆扩增的T细胞是否与反含水细胞有关。

此外，与无性繁殖扩增的V2、V3和v来自SLL患者淋巴结的4个T细胞(C4)， TCR V无克隆扩增或五在由DLBCL（C1和C2）的两种情况下捐赠的淋巴瘤细胞浸润的淋巴结样品中检测到T细胞，表明克隆膨胀的缺陷淋巴瘤细胞浸润的淋巴结中的T细胞可以是DLBCL中的另一个特征。但是，是否与淋巴结的肿瘤微环境有关仍然是一个开放的问题，需要进一步探索。

结论

在这项研究中，我们的特征在于V的分布和克隆性和V.在B-NHL患者外周血、骨髓和淋巴结中，我们发现TCR V的限制性使用和克隆增殖特征明显不同和V.个体患者以及不同免疫器官的亚科即使我们发现一些相同的克隆展开v外周血和骨髓中有类似的T细胞亚家族，扩增的V外周血和骨髓中的T细胞亚家族可能与相同的b细胞淋巴瘤相关抗原有关，而不同的反应性克隆扩增T细胞可能是由于局部免疫应答。然而，它是否与不同的抗原刺激和肿瘤微环境仍然是一个开放的问题，需要进一步探索。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金的补助金（No.81270604），广东科技项目（2012B050600023），中央大学的基本研究资金（21614308）和医学科学广东省研究基础（第22012195号）。

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