剂量的合并Immunodominant抗原在重组BCG适度影响Th1免疫反应和保护效率结核分枝杆菌在老鼠身上

文摘

改善BCG有效性的一种方法是利用BCG作为车辆开发重组BCG菌株overexpressing (rBCG)结核分枝杆菌(结核病)抗原。还的候选抗原表达水平应该rBCG赋予的最后的T细胞反应的影响。在这项研究中,基于我们之前构造微分表达系统,我们开发了两个overexpressing rBCG菌株m .结核病嵌合抗原Ag856A2(编码一个重组ag85a2份esat-6插入到Acc我的网站ag85a)在微分水平的控制下巧妙地修改furA启动子。这两个rBCG菌株被用来C57BL / 6小鼠接种疫苗和利用剂量rBCG优化结合抗原的免疫反应和保护效率m .结核病挑战在小鼠模型。结果表明,rBCG菌株overexpressing Ag856A2微分水平不同抗原诱导干扰素-γ生产和可比的m .结核病特殊技能CD4 T细胞表达- 2。m .结核病挑战实验表明rBCG菌株提供增强的但比较免疫保护的特点是杆状的负载,减少肺癌病理和炎症。这些结果表明抗原结合的剂量rBCG可以显著影响T细胞免疫反应但没有实施差动保护功效。

1。介绍

肺结核所致结核分枝杆菌(结核病)仍然是一个重要的全球卫生问题,影响全世界数以百万计的人(1,2]。大约95%的结核病例发生在发展中国家(3]。在中国这是一个流行的传染病,每年250000人死于结核病,目前600万活动性结核病患者(4]。全球结核病发病率提高是由于合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)和耐多药(MDR)的出现m .结核病压力(5,6]。据世界卫生组织(世卫组织)的报告,m .结核病将导致2020年全球10亿新病例和3500万人死亡(7]。因此,迫切需要有效的治疗和控制策略,以抵消全球结核病的威胁。

目前的结核病疫苗,牛分枝杆菌Bacilli-Calmette-Guerin (BCG),活减毒疫苗,几十年来在世界各地得到了广泛的应用。BCG保护孩子与粟粒状的高效和脑膜结核,但防护效率对成人肺结核已经发现不同高度从0%到80% (8]。花费了大量精力通过基因工程技术提高BCG功效,是因为其强大的免疫刺激性属性和证明安全对人类使用(9,10]。重组BCG (rBCG)不同immunodominant抗原的表达m .结核病,如分泌抗原(Ag85B、Ag85C ESAT-6,等等)或延迟相关抗原(α晶状体蛋白、Rv2659c Rv3407 Rv1733c等),对结核病和被测试为候选疫苗是展示了一个增强的能力诱导Th1免疫反应和保护m .结核病挑战在动物模型(11,12]。此外,这绝对是毫无疑问,剂量的抗原可以潜移默化地影响宿主免疫反应的大小以及保护功效,无论抗原的形式管理rBCG [13)、蛋白质(14),DNA (15),或RNA (16]。

我们以前报道的建设m .结核病furA基因操作符/促进剂(pfurA)的微分表达系统,它是可行的目标抗原表达的兴趣模块化方式(4]。该系统将促进发展的新型重组BCG疫苗的候选人。m .结核病嵌合抗原Ag856A2,编码的重组ag85a基因与2的副本esat-6基因插入到Acc我的网站ag85a(参见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/196124),显示改善小鼠的免疫原性接种时肌内作为DNA疫苗(17]。在目前的研究中,我们选择两个rBCG菌株overexpressing相同的嵌合抗原Ag856A2最大区别:rBCG186和rBCG486 overexpressing控制融合蛋白的野生型或优化double-mutatedfurA启动子,分别4]。我们测试了其功效C57BL / 6小鼠疫苗,比较免疫反应和保护m .结核病挑战。结果表明,小鼠接种rBCG186或rBCG486一般诱导更高的抗原特异效应和记忆免疫反应,以及保护功效相比,小鼠接种父BCG菌株。但是,两rBCG菌株本身表达了嵌合抗原各级Ag856A2诱导不同抗原干扰素-γ生产和可比的m .结核病特殊技能CD4 T细胞表达- 2。和保护功效常常由两个rBCG菌株显示无显著差异虽然较高水平的保护观察rBCG486接种小鼠比rBCG186接种疫苗的老鼠。

2。材料和方法

2.1。实验动物和道德的声明

女性特定的无菌(SPF) C57BL / 6小鼠年龄在6 - 8周内购自上海SLAC实验动物有限公司有限公司(上海,中国)和防晒系数条件下保持食物和水随意直到挑战。受感染的老鼠被维护在一个生物安全三级(BSL-3) biocontainment动物设施。所有动物实验协议是经中国科学院批准实验室动物保健和使用委员会,根据指导方针进行的实验动物伦理委员会上海市公共卫生临床中心。

2.2。菌株和生长条件

大肠杆菌DH5α在液体或固体LB培养基培养。牛分枝杆菌BCG-Danish从上海生物制品研究所和善的天才。波士顿咨询公司和它的导数重组菌株生长在液体麦德布鲁克7 h9肉汤(美国BD Difco)补充10%十八烯acid-albumin-dextrose-catalase浓缩(美国BD Difco OADC),二层80年0.2%甘油、0.05%。文化在指数期冷冻和储存在−80°C。在需要时,添加了卡那霉素最后50岁或20的浓度μ克/毫升大肠杆菌或分枝杆菌,分别。

2.3。质粒结构和重组BCG菌株准备

两个rBCG菌株overexpressingm .结核病嵌合immunodominant抗原建立了各级Ag856A2如前所述[4]。简而言之,Ag856A2编码基因,重组ag85a基因与2的副本esat-6基因插入的Acc我的网站(17),从质粒模板DNA疫苗HG856A放大,然后克隆到分枝杆菌微分表达式控制向量pMFA11和pMFA41原型和double-mutated(突变:初始密码子改变从GTG 8月和6 bp替换在上游at富集地区)furA分别启动子。由此产生的构造electroporated进BCG-Danish主管细胞和选择与卡那霉素麦德布鲁克7 h11琼脂。的rBCG转化株种植midexponential阶段完成麦德布鲁克7 h9肉汤,然后重组蛋白表达的常规免疫印迹试验验证。

2.4。小鼠免疫和m .结核病挑战

小鼠皮下接种疫苗(南卡罗来纳州。),2×10⁶克隆形成单位(CFU) 100年卡介苗或rBCGsμL盐水。疫苗接种8周后,6组小鼠要么牺牲对脾细胞抗原T细胞反应的评估或暴露于毒性的气溶胶m .结核病H37Rv应变存款100 - 200 CFU /肺吸入剂由吸入暴露系统(美国Glas-Col) [18]。

2.5。体外干扰素-γELISPOT试验

干扰素-γELISPOT试验设备(美国BD生物科学)被用来描述由制造商。盘子被涂上一层anti-IFN -γ马伯一夜之间在4°C,然后阻塞RPMI 1640中含10%胎牛血清(的边后卫)在室温下1 h。脾细胞(2.5×10⁵从免疫小鼠孤立的细胞/),镀,培养10μg / mL产后抑郁症(staten血清研究所、丹麦)或2μg / mL重组Ag85A 6μg / mL重组ESAT-6提供刺激在37°C, 5%的公司₂20 h。在洗盘子PBS-T20 (1×PBS, pH值为7.4,0.05%渐变20),生物素化的anti-IFN -γ在室温下添加2 h。Streptavidin-HRP了45分钟,颜色与3-amino-9-ethylcarbazole发达(AEC)衬底(BD生物科学)。immunospot分析仪(美国蜂窝技术)被用来计算点。

2.6。流仪分析细胞内细胞因子的生产

脾细胞(2×10⁶细胞/镀)在8周后免疫隔离在96 - 10孔板和刺激μg / mL产后抑郁症14 h的1μg / mL anti-CD28 (BD生物科学)和随后孵化一个额外的5 h在37°C以下的0.5μL /毫升莫能菌素/ GolgiStop (BD生物科学)。隔夜孵化后在4°C,流式细胞仪的细胞被洗缓冲区(PBS的边后卫含有叠氮化钠0.1%和1%),随后染色为30分钟在4°C与马伯表面标记表示使用anti-CD3-Pacific蓝色,anti-CD8-FITC, anti-CD44-V500从BD生物科学(所有)。细胞被洗在流式细胞仪缓冲、固定permeabilized使用Cytofix / Cytoperm工具包(BD生物科学)根据制造商的指示和染色细胞在4°C使用anti-IFN - 30分钟γ-APC-Cy7 anti-TNF -α-Percp-Cy5.5, anti-IL-2-APC马伯从BD生物科学(所有)。细胞随后被洗,resuspended流式细胞仪缓冲区,然后分析了多参数流式细胞术使用BD FACSAria流式细胞分析仪(BD生物科学)。对于每一个样品,至少300000事件收集和响应进行了分析使用FlowJo软件(树明星,美国)。

2.7。细菌菌落测定

五周后感染,老鼠牺牲和分枝杆菌负担由镀肺匀浆,扣除postcaval叶,和整个脾脏麦德布鲁克7 h11琼脂板上补充10% OADC浓缩和4-antibiotic混合物(40 U /毫升polymycin B, 4μ50 g / mL两性霉素,μg / mL羧苄青霉素,2μg / mL甲氧苄氨嘧啶),防止污染微生物的增长。盘子在37°C 3周孵化semisealed塑料袋然后CFU计数和表达为日志₁₀CFU /器官。

2.8。组织病理学分析

右边postcaval叶在福尔马林固定石蜡和嵌入。然后,嵌入式肺叶是切割厚度5μm,苏木精和伊红染色(H & E)和拍摄使用奥林巴斯CKX41显微镜(日本奥林巴斯)配备一个奥林巴斯DP20相机连接到电脑。职业形象+项目(美国媒体控制论)是利用客观评估炎症出现在每张图片的水平。炎症区域彩色比noninflamed地区更强烈的紫色。区域发炎是量化的平均百分比平均三到五个肺段的每个不同组的老鼠。

2.9。免疫组织化学

如前所述(执行免疫组织化学肺部分19]。抗体是兔多克隆anti-mouse TNF -α(英国)Abcam兔多克隆干扰素-γ抗体(美国表达载体),兔多克隆anti-mouse伊诺抗体(开曼化学、美国)。所有部分都是由光学显微镜检查,和TNF的表达α干扰素-γ,或者伊诺被积极的信号强度semiquantified使用图像专业+软件。

2.10。统计分析

免疫反应,保护功效和组织病理学染色被单向方差分析测试图基紧随其后的多重比较的测试手段。非参数Mann-Whitney免疫组织化学染色法进行了比较测试。^{∗ ∗∗} ,或^∗∗∗ 。

3所示。结果

3.1。rBCG菌株不同层次的融合蛋白过表达Ag856A2

我们之前已经开发出了一种新颖的分枝杆菌微分表达系统(pMFA系列)的基础上m .结核病furA基因操作符/促进剂(pfurA)或其衍生品。Ag856A2被克隆到两个质粒,pMFA11和pMFA41驱动器低和高基因表达的控制下野生型和修改皮毛启动子,分别4]。BCG的转换,我们得到两个菌株,rBCG186 rBCG486,开相应的低和高表达的抗原嵌合immunodominant Ag856A2(图1,上半部分)。带强度的量化rBCG486大致表达的蛋白质印迹显示>的三倍比rBCG186 Ag856A2(图1较低的面板)。

3.2。高表达Ag856A2 rBCG菌株诱导抗原IFN -高γ响应

有关酶联免疫斑点试验疫苗接种8周后,rBCG486-vaccinated小鼠的脾细胞显示更多的细胞表达Ag85A-specific干扰素-γ相比rBCG186和总量作为分母老鼠(图。这2左面板)。数量也显著升高的脾细胞表达ESAT-6-specific干扰素-γrBCG186——和rBCG486-vaccinated老鼠比总量作为分母老鼠(图。这2中间面板)。此外,ESAT-6-specific干扰素-γrBCG486-vaccinated小鼠诱导在更高水平相比rBCG186组(图2中间面板)。PPD-specific IFN -类似的模式γ反应Ag85A-specific反应也观察到但差异无统计学意义,对于比较rBCG486-vaccinated老鼠和其他免疫组(图2右面板)。

3.3。rBCG接种诱导高IL-2-Producing CD4 T细胞反应

我们使用流式细胞仪测量的能力m .结核病您从接种小鼠的脾脏CD4 T细胞产生细胞因子干扰素-γ肿瘤坏死因子-α刺激后,在单细胞水平- 2在体外产后抑郁症。cytokine-producing CD3的⁺CD4⁺细胞分为基于干扰素的生产——七个亚种群γ肿瘤坏死因子-α,在任何组合(图- 23(a))。

显著增加的频率PPD-specific - 2⁺在rBCG-vaccinated小鼠CD4 T细胞被确定,而干扰素-频率增加γ⁺细胞被发现在总量作为分母老鼠虽然统计这微不足道(图3(a))。饼状图的数据澄清- 2的统治地位⁺在rBCG-vaccinated小鼠CD4 T细胞,而干扰素-γ⁺CD4 T细胞的反应主导的总量作为分母老鼠(图。这3(b))。rBCG和接种卡介苗没有不同的诱导能力m .结核病您其他CD4 T细胞产生的细胞因子组合()。根据外,我们还观察到更高的集成意味着荧光强度(iMFI = %频率×MFI) - 2的IL-2-producing CD4 T细胞,即使它是统计微不足道(图3(c))。

3.4。增强保护授予rBCG接种疫苗

一般来说,rBCG诱导更高的抗原细胞因子反应相比BCG(数字2和3),rBCG486诱导抗原IFN -高γ响应(图2)和类似的频率m .结核病特殊技能CD4 T细胞表达(图- 23)。然后,我们进一步rBCG486的保护功效相比,rBCG186, BCG对m .结核病-激励。如图4(一)挑战,5周后接种小鼠显著降低杆状的负载在肺,相比saline-treated老鼠。接种BCG和rBCG186导致减少可比杆状的负载(图4)。然而,尽管rBCG486接种诱导显著更大保护相比,总量作为分母老鼠,这显示没有区别的保护相比rBCG186-vaccinated老鼠(图4(一))。杆状的加载在脾脏共享类似模式的肺,rBCG486-vaccinated老鼠有更少的杆菌相比saline-treated或总量作为分母老鼠,这可比杆菌相比rBCG186-vaccinated老鼠(图4 (b))。

3.5。减少rBCG疫苗接种后肺部炎症

五周后的挑战,m .结核病saline-treated小鼠感染导致严重的病理变化,大约24.3%的组织显示广泛的多焦点的肉芽肿性渗透,表现为大量泡沫状巨噬细胞炎症细胞(图包围5)。然而,所有的接种组小鼠相比显著降低肺肉芽肿合并(即未接种疫苗的老鼠。,13.42%合并在总量作为分母,这7.24% rBCG186-vaccinated组中,4.87% rBCG486-vaccinated组)。rBCG-vaccinated老鼠显示最温和病理学,所有的老鼠在这两组主要是保存完好的肺泡空间只有几个分散的区域扩散渗透(图5)。

3.6。本地化的肿瘤坏死因子-α干扰素-γ,诱导一氧化氮合酶(间接宾语)m .结核病肺部感染

肺组织的免疫组织化学染色显示肿瘤坏死因子-的存在α干扰素-γ,进气阀打开所有组受感染的老鼠和染色是最强的肉芽肿病变相比,在nongranulomatous地区。然而,染色的程度不同的组中。5周后感染,肿瘤坏死因子-一个非常高的水平α观察肺的saline-treated老鼠(图6(一));肿瘤坏死因子-α染色在坏死广泛领域内先进的接合的肉芽肿。接种BCG导致TNF -的数量α表情,尽管统计无关紧要。相比之下,rBCG-vaccinated老鼠,尤其是rBCG486-vaccinated老鼠,显示只有一个小弱染色TNF -α这是限制主要核心肉芽肿(图6(一))。干扰素-类似的模式γ和伊诺染色也观察到除了相对弱得多染色(r)的肺总量作为分母老鼠相比这saline-treated老鼠(数字6 (b)和6 (c))。肿瘤坏死因子-类似的模式α干扰素-γ,伊诺染色也观察到感染接种小鼠的脾脏,最高的染色在saline-treated老鼠,在总量作为分母老鼠这温和的染色,染色最低的rBCG-vaccinated老鼠(图S2)。

4所示。讨论

在过去的几十年里,巨大的努力已经集中在修改当前的卡介苗开发新抗结核候选疫苗(20.]。一些修改rBCG菌株,如rBCG30 rBCGUreC::他已经证明,收益率提高防范m .结核病实验动物感染模型比现有的卡介苗和进入临床试验。然而,承诺将继续优化BCG保护性免疫,如果两个点被发布。一是最好的结核病immunodominant抗原应该精确定义。另一个原因是,这种抗原的表达水平应该是最优的足以引起有效的免疫反应(21]。在这里,我们构建了两个rBCG菌株overexpressing immunodominant嵌合抗原Ag856A2在不同程度取决于不同的优势furA启动子(4),然后比较了小鼠的细胞免疫反应和保护这两个rBCG菌株引起的。

改善BCG有效性的一种方法是过度表现分枝杆菌immunodominant抗原诱导最佳宿主免疫反应的生命周期内BCG主机(12,19]。这种策略反映出的剂量抗原是关键影响因素之一的保护功效疫苗。Aagaard等人证明了结核病亚单位疫苗的保护效率是高度依赖于抗原剂量(14]。他们接种小鼠不同剂量的融合蛋白Ag85B-TB10.4辅助IC31乳化,和更高的免疫反应和保护效果只观察抗原时适当剂量的减少或增加的抗原剂量将极大地矮的保护功效抗原(14]。在我们的研究中,同源抗原Ag856A2 rBCG186和rBCG486表达启动子的控制下pfurA和p富丽华(图S1) (4]。这两个启动子,就其本质而言,被验证各种推广活动,与pfurA较低和p富丽华更高的一个(4),因此用于开发rBCG菌株overexpressing嵌合抗原Ag856A2在不同水平,较低的表达rBCG186和更高的表达式在rBCG486(图1)。和不同Ag856A2抗原加载rBCGs导致微分宿主免疫反应,与更高的抗原特异效应在rBCG486-vaccinated小鼠免疫反应验证通过在体外干扰素-γELISPOT试验(图2)。然而,我们没有观察到的品质的显著差异m .结核病特殊技能CD4 T细胞coexpressing干扰素-γ肿瘤坏死因子-α(图- 23),还是保护功效和肺部炎症,rBCGs-vaccinated老鼠(两组之间的数据4和5)。有趣的是,巧妙地更高百分比的多官能的CD4 T细胞(IFN -γ⁺- 2⁺肿瘤坏死因子-α⁺)在总量作为分母老鼠这比其他老鼠(图组3(一));然而,BCG接种疫苗引发的保护效果不在于有效rBCGs(图4)。这种矛盾的结果可以解释的干扰素的iMFI值低的事实γ2,TNF -α在总量作为分母老鼠这观察(见图- 2的情况下3(c)为代表)。小额信贷机构提供了一个衡量的免疫反应的质量更积极地产生细胞因子的细胞染色更加明亮22),因此,降低iMFI细胞因子的值反映质量差虽然温和更高频率的多官能的CD4 T细胞被认为在总量作为分母老鼠,这,这进一步强调不仅大小,而且诱发T细胞反应的质量是至关重要的指导开发有效的免疫策略(23]。此外,高- 2分泌,水平的比例和iMFI被认为比BCG rBCG486-vaccinated小鼠组;这些数据支持我们的最近的发现- 2生产后接种小鼠的脾脏免疫接种可以预测疫苗效力(Kang H, et al .免疫学,2014;在出版社)。相同的解释也可能被用来解释,尽管saline-treated老鼠显示大量的细胞产生TNF -α,iMFI是相对的低(数据没有显示)。

T细胞反应的质量有重大影响的建立保护内存(23]。与T细胞的表型异构特性,这些细胞功能绝对是异类。因此,除了专门干扰素-监控γ疫苗接种后反应,研究人员一直在关注coexpression更多的细胞因子在单细胞水平通过流式细胞仪技术24,25]。rBCG186或rBCG486,至少在我们测试的时候,诱导更高频率的2⁺CD4 T细胞对产后抑郁症刺激脾细胞相比saline-treated或总量作为分母小鼠接种疫苗后,这进一步证实了高生产- 2细胞因子浓度测量时iMFI值(图3)。虽然没有直接的效应函数- 2,它有能力扩大效应其他T细胞功能23]。线性模型中CD4细胞的分化⁺Th1细胞,2⁺CD4 T细胞属于记忆细胞,有可能分化成干扰素-γ第细胞相关抗原(召回后23]。因此,rBCG186 rBCG486,因为嵌合抗原Ag856A2整合,提高主机的内存容量m .结核病病原体。然而,我们没有发现任何差异rBCG186-vaccinated之间的CD4 T细胞和rBCG486-vaccinated老鼠。这可能归因于我们选择疫苗接种时间短窗口,或真正的差异在于其他T细胞的功能超出了T细胞功能的范围目前测试和将来可能需要进一步的利用。

有效和协调参与细胞因子促进结核病控制。那些有关Th1细胞因子(例如,TNF -α和干扰素-γ),在更大程度上,通过激活巨噬细胞的功能26]。肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ协同抑制的增长m .结核病通过刺激巨噬细胞活性氮中间体的生产(RNIs) [27,28]。至于RNIs,伊诺是至关重要的酶参与的生产RNIs [29日,30.]。肿瘤坏死因子-α干扰素-γ,进气阀打开给适当的控制m .结核病在早期阶段31日]。在感染后期抑制或杀死m .结核病建立,表达水平会下降到一个合理的价值;否则immune-pathological响应会发生(32]。rBCGs,尤其是rBCG486诱导增强保护m .结核病感染在这项研究中(图4)。符合防护功效,感染肺部的炎症反应极大地缓解rBCGs-vaccinated小鼠感染后(图5)。当测量炎症分子的表达水平,rBCGs-vaccinated老鼠也会显示减少的表达水平按照宽恕的肉芽肿性炎症(数字5和6)。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

回族马和吴康同样这项工作。

确认

这项工作是支持由中国国家传染病大型科技项目(2013 zx10003007 - 003),中国国家科学基金会(81273328,81273328,81273328,81101213),上海新星计划(12 qh1401900),上海卫生局(20114013),上海科委(10411962700和134119 a5200)和上海自然科学基金青年学者(12 zr1448200)。

补充材料

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