文摘

在搜索的外围因素负责偏差在白化牛津对实验性自身免疫性脑脊髓炎(AO)和暗刺(DA)老鼠,我们估计金属硫蛋白的表达I / II (MT),热休克protein-gp96,白介素6 (IL)和转化生长因子(TGF)β在这些动物的肝脏。老鼠和牛脑匀浆免疫(BBH)乳化完全Freund佐剂(CFA)或只有CFA。免疫印迹和免疫组织化学分析进行免疫接种后12天,以及完整的老鼠。数据表明,在第一次攻击prone-DA只实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验性自身免疫性脑脊髓炎老鼠明显调节肝MTs, gp96, il - 6, TGF -β。相比之下,AO老鼠有一个更高的表达太I / II, il - 6, TGF -β在完整的肝脏(),这表明更大的组成型表达的蛋白质导致运算单元的电阻。除此之外,因为之前我们发现AO老鼠免疫反应的早期upregulation TGF -β在几个肝结构(血管内皮,枯氏细胞和肝细胞),数据表明,特定的肝脏微环境可能也有助于更快复苏。这些大鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎

1。介绍

多发性硬化(MS)是一种异质性疾病,不同的机制,如自身免疫攻击,炎症、神经退化,中毒,引起髓鞘脱失,少突细胞和神经元,轴突损伤。触发事件通常是入侵周边地激活myelin-specific Th1和Th17免疫细胞在中枢神经系统,在那里他们与抗原呈递细胞(APC)和小胶质细胞,导致组织损伤的炎性反应和一个放大的初始免疫反应(1- - - - - -3]。因此,潜在机制包括公差分解自身抗原,以及激活的细胞和分子级联事件造成损伤或感染的起始,如生产促炎细胞因子、趋化因子、细胞粘附分子以及新的担保因素的释放,如损害和其分子模式(抑制和pamp)可能加强损伤(4]。结果还取决于当地的激活和系统性cytoprotective和抗炎机制,以及致病性之间的相互作用和调节性T细胞亚群(Treg)调节自身免疫攻击。发病机制是多因素疾病,也依赖神经内分泌和免疫系统之间的相互关系5,6),以及基因的存在确定靶器官免疫功能和自身免疫性疾病的易感性(7]。

关于运算单元的遗传背景,也获得了大量的信息在DA和AO老鼠的菌株,(有不同的敏感性实验性自身免疫性脑脊髓炎8- - - - - -11]。

因此,这种差异被发现免疫细胞数量的移民在中枢神经系统,在生产2、干扰素(IFN)γ,和白介素(IL) -17在IL - 6的分泌,及护,IL - 10在中枢神经系统或引流淋巴结细胞。导致这个领域我们最近表明,这些老鼠菌株在不同金属硫蛋白的激活模式I / II (12),在哺乳动物中枢神经系统执行基本cytoprotective功能,由于金属绑定,抗氧化、抗凋亡和growth-regulatory活动(13- - - - - -16]。在这些数据12),我们已经表明,本构和诱导太我+二世在EAE-resistant和EAE-prone老鼠基因表达不同的器官受损的自身免疫系统攻击(海马和小脑)以及在肝脏,指向高介入的中央和周边MTs-related机制。诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎除此之外,因为在AO老鼠,早期免疫接种后encephalitogen(第七postimmunization天),我们发现明显upregulation鉴定及免疫反应性在几个肝结构,我们假设在肝脏免疫抑制环境也可能造成的感应电阻(对实验性自身免疫性脑脊髓炎12]。

为了扩大这些数据,在DA和AO老鼠,我们做了一个肝MT-I / II的表达蛋白质的定量分析和两个肝细胞因子(il - 6和TGF -β)在急性期反应和参与的创建特定的肝细胞因子微环境管理当地的宽容和免疫之间的平衡(17]。此外,由于新兴证据表明重要的监管机构在神经系统疾病的细胞应激反应(18)以及免疫反应(19- - - - - -21)热休克蛋白(休克),在DA和AO老鼠我们也估计肝的内质网(ER)居民HSP-gp96的表达,根据我们自己的数据可能的发病机制中的基本函数在DA大鼠慢性复发实验性自身免疫性脑脊髓炎22]。

数据表明,只有EAE-prone DA大鼠显著调节肝MTs, gp96, il - 6, TGF -β在第一个临床症状的出现,以及,AO老鼠明显高于太I +二世,il - 6, TGF -β表达完整的肝脏,这表明高组成型表达的这些蛋白质可能导致运算单元的电阻。

2。材料和方法

2.1。实验动物

实验的男性,黑刺(DA)和牛津(AO)白化病老鼠被使用,年龄在2 - 3个月。他们培育和维护根据指南制度动物保健和使用当地伦理委员会的批准。

2.2。运算单元感应

免疫是由牛脑白质匀浆乳液(BBH)完全弗氏佐剂(CFA)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),正如我们先前描述(22- - - - - -24]。每只动物了毫升的乳液,皮下注射,在每个后拦路贼。对照组注射相同剂量的CFA。动物牺牲在接种后12天的出现,大量临床症状实验性自身免疫性脑脊髓炎涉及后腿瘫痪,大小便失禁。的严重性疾病临床评估按照下列标准:0:没有症状;1:faccid瘫痪的尾巴;2:后腿麻痹性痴呆;3:后腿瘫痪,大小便失禁,4:死亡的动物。

2.3。抗体和试剂

鼠单克隆抗体太I / II(克隆E9)获得Dako Cytomation,美国,和稀释1:IHC-P 250 WB和1:50。单克隆抗体鼠IgG2a Grp94 / gp96(克隆9 g10)是来自Stressgen,加拿大,和用于稀释1:IHC-P WB和1 1500:100。鼠标anti-rat抗体从研发系统获得了il - 6,阿宾顿,英国,和用于稀释1:200。兔多克隆抗体免疫球蛋白TGF -1(1:世行的600和100:IHC-P)从Abcam,英国剑桥。马的过氧化物酶(合)山羊anti-mouse免疫球蛋白和HRP-goat anti-rat抗体得到从杰克逊ImmunoResearch实验室,Inc .)、美国。HRP-goat anti-rabbit共轭抗体,ECL '免疫印迹检测试剂,和Hybond ECL硝化纤维膜从通用电气医疗集团,瑞典乌普萨拉。铝合二次抗体被用于稀释1:10 000。山羊anti-mouse肌动蛋白抗体从圣克鲁斯生物技术获得,Inc .)、美国、和用于稀释1:2000。

2.4。免疫印迹分析

等量的冷冻肝组织均质和细胞溶解radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区包含25毫米Tris-HCl pH值7.6,300毫米氯化钠,NP40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 2毫米PMSF和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑从罗氏公司,德国曼海姆。蛋白质分离13%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),然后转移到一个硝基nonreducing条件下膜(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。膜被屏蔽1%阻塞试剂(罗氏诊断GmbH) tris-buffered盐水Tween-20 0.5% (TBST),然后孵化与不同主要Abs,其次是孵化与物种特定HRP-conjugated二级抗体。的β肌动蛋白被用作控制蛋白质的加载。膜清洗三次与TBS缓冲区,孵化与Amersham发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典),并与柯达影像扫描站440年cf(美国柯达,纽黑文,CT)。乐队的强度量化使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。确定分析的相对表达蛋白在肝组织免疫动物和动物的治疗只有CFA,乐队每个肝脏样本密度与乐队相比强度获得完整的动物的肝组织正常化后内部控制(肌动蛋白)。分析在组织样本作为池从3大鼠在三个独立的实验。

2.5。组织石蜡切片做准备

肝脏被迅速删除,缓冲福尔马林溶液固定在10%在24小时。组织被嵌入在石蜡和部分被削减时4μ利用HM 340 e切片机(Microtom,德国)。热诱导抗原决定基检索之前完成染色过程通过加热组织幻灯片在煮柠檬酸缓冲液pH值6.0 4次,每次5分钟,使用微波轮船。

2.6。免疫组织化学

免疫组织化学研究肝脏进行石蜡包埋组织幻灯片使用DAKO想象+系统,过氧化物酶(DAB)设备根据制造商的指示(DAKO公司(美国)。与过氧化物酶阻断短暂,幻灯片被孵化,消除内源性过氧化物酶活性。洗后,抗体被添加到组织样本和孵化一夜之间在4°C在潮湿的环境中,紧随其后的是45分钟孵化与过氧化物酶标记聚合物共轭山羊anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白含有载体蛋白与Fc片段,以防止非特异性结合。免疫反应的产品是通过添加substrate-chromogen可视化(DAB)解决方案。组织与苏木精复染色、脱水槽分级乙醇,安装使用Entelan (Sigma-Aldrich、德国),并与奥林巴斯BX51显微镜检查(奥林巴斯、东京、日本)。证实了反应的特异性替换主要与同形像匹配的无关紧要的免疫球蛋白抗体,在同等条件下使用和稀释主要抗体。

2.7。统计分析

数据表示为±SE。组之间的差异被弗里德曼单向方差分析评估(方差分析),Mann-Whitney测试和两个跟踪学生的以及。是水平的意义。

3所示。结果

正如我们先前描述的,AO老鼠免疫后BBH + CFA没有表现出任何疾病的临床症状,与遗传易感DA大鼠相比,开发一个典型chronic-relapsing (CR-EAE)形式的实验性自身免疫性脑脊髓炎。在这项研究中,两个组动物免疫接种后12天,牺牲生命,第一次攻击的出现时DA大鼠的疾病。蛋白质含量的I / II, gp96和细胞因子在肝组织样本分析获得免疫DA和AO老鼠,从老鼠CFA处理,从未经处理的老鼠。

3.1。肝脏MT的表达我+二世在EAE-Resistant蛋白质和EAE-Prone老鼠

数据表明,EAE-prone DA大鼠免疫反应与BBH + CFA显著增加肝脏MT I / II蛋白质比EAE-resistant AO老鼠(数字1(一)和1 (b);)。然而,MTs的内容完整的肝脏AO的老鼠在DA大鼠3倍,指着高这些金属结合蛋白的组成型表达。通过免疫组织化学(图所示1 (c)),免疫DA表示更高的细胞质和核太I / II比AO大鼠肝细胞的免疫反应性。

3.2。肝的表达糖蛋白gp96 EAE-Resistant EAE-Prone老鼠

的表达ER-resident HSP-gp96蛋白质只在DA大鼠明显起来,免疫与BBH + CFA(数字2(一个)和2 (b))。值明显更大,这些发现与CFA DA大鼠治疗,以及比相同对待AO老鼠。gp96蛋白质的组成型表达完整的DA和AO老鼠的肝脏,然而,类似的强度(图2 (b))。高肝upregulation gp96蛋白质的DA大鼠也证实了免疫组织化学,表现突出的细胞质gp96免疫反应性在众多肝细胞(图2 (c))。

3.3。肝的表达il - 6在EAE-Resistant和EAE-Prone老鼠

同样,在EAE-prone DA大鼠的肝脏中我们发现肝il - 6蛋白的高upregulation疾病的第一次袭击。其价值观的肝脏免疫DA大鼠显著高于DA大鼠被CFA,以及比EAE-resistant AO老鼠(数字3(一个)和3 (b);)。然而,类似的结果太I / II,完整的肝脏AO大鼠il - 6的表达是四倍,在完整的DA大鼠。

3.4。肝的TGF -β在EAE-Resistant EAE-Prone老鼠

肝的TGF -β发现类似的I / II和il - 6。其价值观成为显著的调节在第一次攻击疾病只在DA大鼠(数字4(一)和4 (b);)。此外,TGF -的组成型表达β肝脏的完整AO老鼠在DA大鼠2倍(图4 (b))。

4所示。讨论

使用一个动物模型,在DA大鼠诱发疾病的临床症状复发缓和的女士,像人类一样,我们这里显示肝il - 6, TGF -β、MTs和ER-resident HSP-gp96有很高的监管影响和干扰免疫炎症机制,发生在一种自身免疫性反应。此外,数据可能意味着对实验性自身免疫性脑脊髓炎的组成型表达与肝太I / II,这是必要的cytoprotective蛋白质参与的规定不同类型的损伤。的细胞和分子机制仍有待阐明,但是著名的假说是一致的功能控制肝脏的急性期反应(25和免疫和宽容17,26,27]。在这种情况下,它一再表明,肝脏的特征是一个特定的肝脏微环境,由糖皮质激素(gc),局部细胞因子(5),和独特的肝APC的人群,结果抗原诱导的外围宽容而不是在诱导t细胞免疫(17,21]。此外,众所周知,在免疫反应中,各种介质,包括细胞因子、生长因子、激素,必须控制也随之而来的肝损伤,炎症,修复激活不同人群的肝细胞(肝细胞、星状细胞、枯氏细胞,正弦内皮细胞和淋巴细胞)和各种下游信号通路。响应取决于各种介质的相互作用,在个别Janus激酶(激酶)的激活信号传感器和转录激活(STAT)通路,STAT1和STAT3激活,之间的相互作用和随后的激活的细胞因子诱导的负反馈循环终止JAK-STAT信号激活的抑制细胞因子信号,SH2-containing磷酸酶,和蛋白质抑制剂活性数据。由于这,激活各种统计数据可能会反或促炎的信号,根据统计激活,在数据被激活的细胞类型,以及肝脏疾病或肝脏损伤的类型,研究了(看过的28])。

在这方面,它已经表明,il - 22生成时,il - 6、il - 6和家族细胞因子在肝细胞和骨髓细胞STAT3激活,它充当一个抗炎信号抑制肝脏炎症。相比之下,STAT3的激活T细胞甚至可能促进肝脏炎症,因为它导致的upregulation RORγt和RORα转录因子促进T细胞对Th17表型分化,导致了IL-17生产。此外,后者深受il - 6和TGF -平衡β,因为il - 6可能抑制TGF -β诱导分化的免疫抑制Treg和诱导,结合TGF -β的发展促炎Th17细胞naıve T细胞(29日]。这个问题是由优秀的评论在这个领域(30.- - - - - -33),我们的研究表明细胞因子估计可能有很高的对自我耐受性和发展自身免疫的影响。

符合这个提议在我们目前的研究表明,il - 6和TGF -β只有EAE-prone DA大鼠的肝脏出现在第一次攻击(数据的实验性自身免疫性脑脊髓炎3和4)这意味着肝il - 6和TGF -β导致抗原激进的TH17或TH1细胞的生成。然而,在这些考虑应该考虑事件的时间进程,因为il - 6参与也在逮捕过程感染的炎症反应和组织损伤,确保一个好的恢复受影响的区域。从这个意义上说,这是表明,il - 6刺激从先天后天免疫(34),作为一个因素限制中性粒细胞进入受灾地区和细胞凋亡的消除和因素刺激单核细胞的条目,使T细胞的生存控制几种趋化因子和细胞因子的表达和血管内皮的粘附分子(看过的(35])。此外,肝脏合成的诱导II型急性期蛋白(纤维蛋白原,结合珠蛋白(人类),α1-antichymotrypsin,α1-antitrypsin,α2-macroglobulin) il - 6可能限制蛋白水解和/或纤维发生的活动和组织损伤(25,36]。此外,il - 6和其他促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子α,il - 1αIL-1ß,可能会导致肾上腺(HPA)轴的激活反馈电路,从而增加内源性糖皮质激素(gc)的水平,这个途径的免疫抑制最终产品(5,6]。此外,应该强调,il - 6是一种重要的细胞因子,导致转录的I / II在肝脏(37- - - - - -39在大脑中]和[35,40),最终导致cytoprotective标志和神经保护的结果,因为它已被证明在不同生理条件下(16,41[]和实验性自身免疫性脑脊髓炎42),女士,43和其他类型的脑损伤13,44,45]。因此,il - 6缺乏可能增加氧化应激在中枢神经系统炎症(40]。然而,由于生产过剩的il - 6和il - 6信号转导异常可能在一些自身免疫性疾病,病因因素的il - 6封锁可能是一个有效的方法治疗(看过的33])。符合这个证据,表明anti-IL-6R抗体,免疫小鼠后立即接种与髓少突细胞糖蛋白(MOG)肽,能够抑制运算单元的发生,从而消除Th17细胞在淋巴结和脊髓(46]。

支持当前知识金属硫蛋白的重要的监管职能和其他类型的脑损伤的发病机理实验性自身免疫性脑脊髓炎(35,45,47),我们此前报道称,金属硫蛋白I / II可能诱导表达EAE-prone和EAE-resistant应变的老鼠,甚至在发生前症状的阶段CR-EAE(第七postimmunization天)在细胞形成血脑和blood-cerebrospinal液障碍,在小脑实质和海马齿状回,在大鼠的肝脏12]。然而,12日postimmunization天,肝il - 6的水平,及护,MTs, DA的gp96明显更大比AO老鼠,暗示AO老鼠可能会更好地控制自身免疫反应(12]。此外,由于在AO老鼠,我们注意到的早期upregulation TGF -β在几个肝结构(血管内皮,枯氏细胞和肝细胞),我们推测特定肝脏微环境可能导致更快的恢复(这些大鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎12]。新的数据从当前研究中,还透露,AO老鼠有更大的基底的TGF -水平β、il - 6和MT I / II(数字4,3,1),这意味着AO的易感性和DA大鼠可能不仅取决于MHC单体型,但也在一些表观遗传特征可能对免疫调节(负责48]。

我们的数据不允许在这个方向上进一步讨论以来是一个多基因性状,对实验性自身免疫性脑脊髓炎的小差异不同基因产物的表达或活动相结合来确定疾病的起始(1- - - - - -3]。在大多数菌株是由MHC II级的响应基因产物和t细胞受体(TCR),认识到主导encephalitogenic抗原决定基,但敏感性可能也取决于遗传性状负责个人间的差异代谢和对各种病原体和内生因素的敏感性。此外,它常常与主导1型(细胞)或2型(体液或抗体介入)毒株的免疫力,这是高度受到神经免疫相互作用和信号在肾上腺轴(49),以及监管机制,包括细胞和细胞因子的产生与抑制的活动和激活凋亡通路,确保的消除autoaggressive t细胞克隆(5,6]。

作为复杂网络的一个小段,我们这里显示的监管也参与对实验性自身免疫性脑脊髓炎肝MTs,由于其重要的功能在金属离子体内平衡和氧化还原控制和防止重金属,DNA损害,压力,和炎症(16,41,50,51]。此外,由于他们的能力来控制Zn-dependent转录因子、蛋白质合成、细胞能量,和新陈代谢水平,他们也极度参与细胞生长和增殖37,52),以及在维护神经免疫内稳态和细胞凋亡的过程51]。因此,我们可以推测,高本构MT表达AO老鼠和高诱导肝MTs DA大鼠贡献和降低对实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制自身免疫和炎症反应。强调机制很可能是不同的在静止和受伤的肝组织,但目前仍然是难以捉摸的。然而,反映太I / II的抗氧化活性,在实验性自身免疫性脑脊髓炎我们之前报道,在DA大鼠组织游离锌离子含量增加网站的MTs感应(24),在第二次攻击的CR-EAE(22日postimmunization天)的肝脏表达太I / II是伴随着高锌和铜的积累在肝脏23]。此外,线性回归分析在目前的研究显示,完整的肝脏的AO老鼠MTs的组织水平与组织il - 6水平高的正相关关系。87年。相比之下,在两株免疫大鼠肝il - 6(发现在接种后12天BBH + CFA)是在一个高与肝gp96负相关。然而,这些初步的数据需要确认(没有显示)。

此外,在本研究中我们也明显变化表明在实验性自身免疫性脑脊髓炎的肝脏表达ER-resident HSP-gp96(图2),确认内源性抑制信号的贡献在自体免疫反应的发展4,19]。由于其监护人的角色展开的蛋白质反应(UPR) [53- - - - - -55)和ER-associated退化(ERAD) (56)有可能参与了肝gp96在实验性自身免疫性脑脊髓炎的流程规范的正确折叠和组装新合成分泌和膜蛋白在那些防止展开和不完全折叠蛋白质的聚合ER。此外,由于其积极的能力陪伴MHC类I-restricted抗原表位cross-presentation通路的专职抗原递呈细胞(APC)和诱导这些细胞的激活和成熟19,57),我们也可以推测gp96积极促成了诱导抗原免疫接种后BBH-CFA。,许多报道都证实了假说是指向高upregulation HSP在中枢神经系统细胞的接触各种各样的压力和感染(58,59(女士),以及60[],实验性自身免疫性脑脊髓炎61年),和其他神经系统疾病(18),通常被称为“chaperonopathies。”

也证实了直接影响的gp96实验性自身免疫性脑脊髓炎发现免疫小鼠HSP +肽复合物可能引起CD8 +及CD4 + t细胞反应特定于HSP-chaperoned抗原肽(19)以及与高剂量的免疫gp96可能防止髓磷脂碱性蛋白或蛋白脂protein-induced SJL小鼠自身免疫性脑脊髓炎的感应抑制CD4 +人口,表明gp96可能诱导细胞免疫反应的抗原激活或抑制(62年]。

确认gp96可能参与proteostasis和相关的几种途径,与中枢神经系统的修复过程,我们最近报道,在DA大鼠本构gp96表达式,发现在几个神经元和神经胶质细胞在完整的动物的大脑和脊髓,显著减少CR-EAE以及攻击中,gp96 CR-EAE疾病的调节在缓解阶段少突胶质细胞、神经元的海马区,和腰椎脊髓运动神经元的22]。找到指向gp96免疫机制的作用显示gp96可能刺激Treg细胞以剂量依赖的方式(63年)以及gp96可能调节耐受性的一代髓(64年),参与维护公差在多发性硬化(65年]。

我们希望也强调,在其它动物模型的扰动morphostasis(肝再生、压力、同源的怀孕,与肽聚糖治疗,和自身免疫性糖尿病)(66年,67年]肝gp96超表达通常与高积累的自然杀伤细胞(NKT),以及upregulation costimulatory分子在肝脏和APC和代Treg胸腺,指着ER说法的一般作用在维护免疫内稳态和morphostasis [66年,67年]。基于这些证据和当前的知识gp96的免疫功能20.因此,)我们可以推测,可能会影响肝gp96在实验性自身免疫性脑脊髓炎当地树突状细胞的成熟和耐受性和细胞因子诱导的潜力,以及肝NKT细胞的功能,认识到守恒self-structures感,而不是变量外国抗原(68年]。然而,尽管这是表明liver-confined不变NKT细胞激活后alphaGalCer可能抑制Th1-cytokine生产和促进分泌的il - 10 MOG35-55-specific T细胞(69年),我们的数据需要进一步的实验在这个方向。

结束,我们想强调表达谱的MTs和gp96 DA大鼠免疫BBH + CFA显示大量时间和地区差异(23),强调他们的交互与多个控制途径。在我们的实验太I / II表达相关临床症状的山峰,gp96相比,在缓解阶段发现,表明ER陪伴可能诱发改善错误折叠蛋白质的积累在中枢神经系统和保护神经细胞免受自身免疫攻击。时间进程的重要性评价的数据也强调了在目前的研究中,这意味着EAE-resistant老鼠可以更有效地抑制自身免疫反应,由于更大的肝脏MT I / II和组成型表达il - 6(数字1和3),由于早期upregulation TGF -β在肝脏12]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项工作是支持由克罗地亚科技部(项目62 - 06213411337和06213411337)。