自体免疫性肝炎诱导抗核抗体调节大鼠肝移植的同种免疫反应

抽象的

刀豆蛋白A (Con A)是一种源自杰克豆的凝集素，以其刺激T细胞和诱发自身免疫性肝炎的能力而闻名。我们先前证实了在Con a诱导的短暂自身免疫性肝炎过程中诱导免疫抑制的抗核自身抗体。本研究旨在阐明Con a诱导的肝炎对同种异体肝移植排斥和接受的影响。在这项研究中，我们观察到一个独特的现象，即在原位肝移植(OLT)后，注射Con A诱导的一过性新生自身免疫性肝炎(transient de novo immunity hepatitis)在没有任何免疫抑制药物的情况下矛盾地克服了排斥反应，并显著延长了生存期。在Con a注射的受体中，针对组蛋白H1和高迁移率组蛋白1 (HMGB1)的抗核抗体滴度显著增加，供体特异性同种异体抗体应答降低。在接受Con a注射的受者的OLT肝脏中诱导Foxp3和IL-10表明调节性T细胞参与了这一独特的现象。我们目前的数据表明，针对核组蛋白H1和HMGB1的自身免疫反应在竞争异体免疫反应中具有重要意义，从而导致在实验性肝移植中接受同种异体肝移植。

1.介绍

肝脏永久地暴露于肠道衍生的抗原，包括病原体，毒素和无害食物抗原，对来自肠道的膳食或细菌抗原的免疫应答是不寻常的[1那2］.然而，当肝脏患有有害病原体如乙型肝炎和C病毒时，应激活免疫系统以防止肝损伤。的mechanisms for balancing tolerance and immunity in the liver have not been fully elucidated, but the unique repertories of nonparenchymal cells including liver antigen-presenting cells (e.g., dendritic cells (DCs), Kupffer cells, and liver sinusoidal endothelial cells) and unconventional lymphoid cells (e.g., NK cells, B-1 cells, andγδT细胞)很少出现在血液中，这可以解释肝脏的免疫特权[3.］.此外，众所周知，肝脏并不总是遵守移植排斥的正常规则(Medawar’s rule of transplantation) [4.］.

在大鼠原位肝移植（OLT）模型中，PaTBald Virol Glaxo（PVG）（MHC单倍型;收件人自发接受捐赠者黑暗agouti（da）（)，而其他同种异体器官在这种组合中迅速被排斥[5.-7.］.相比之下，获奖者刘易斯(LEW) (）大鼠通常在OLT后14天内拒绝供体DA大鼠肝脏[8.-10］.在我们以前的研究中，我们已经比较了这些OLT模型中的血清蛋白质分析（耐受性DA-PVG与拒绝DA-Lew），并证明了自身抗体（Auto-AB）对核组蛋白H1和高移动组箱1的自发诱导DA-PVG自然耐受模型中的蛋白质（HMGB1）[11-14］.进一步的研究表明，随着DA-LeW排斥组合中的抗组蛋白H1 AB滴度的升高，心脏同种异体移植到组蛋白H1-免疫大鼠中的生存将延长延长[15那16］.除了在肝移植耐受性中参与抗核组蛋白H1的Ab反应[17研究发现，在刀豆蛋白A (Con A-)诱导的短暂性肝损伤恢复阶段，抗组蛋白H1 Ab在血清中自发表达，表明抗组蛋白H1 Ab作为一种调节抗体(abeg)对自身免疫性肝炎的保护和恢复具有重要意义[18］.

自身免疫性肝炎的特征是血清自身抗体(如抗核抗体、平滑肌抗体和肝-肾微粒体抗体)升高的慢性炎症性疾病，伴高γ球蛋白血症，肝脏病理显示坏死性炎症和纤维化[19那20.］.目前，自身免疫性肝炎唯一可行的治疗方法是应用免疫抑制剂和肝移植。此外，自1998年以来，在肝移植后出现了新生成(de novo)自身免疫性肝炎的报道[21］.新发自身免疫性肝炎患者对标准抗排斥方案没有令人满意的反应，但他们对自身免疫性肝炎的标准治疗(类固醇和硫唑嘌呤)联合低剂量钙调磷酸酶抑制剂有反应[22］.然而，关于肝移植肝移植肝移植的肝脏同种异体肝炎免疫方面，对De Novo自身免疫性肝炎的免疫方面知之甚少。

在本研究中，我们在排斥联合(DA-LEW)中进行肝移植，然后在肝移植3天后注射Con A诱导一过性从头免疫肝炎，以评估一过性从头免疫肝炎对移植肝存活和免疫应答的影响。

2.材料和方法

２.１.动物

男da（)及卢(）分别从日本SLC（Hamamatsu，Japan）和国家实验室动物养殖和研究中心（台北，台湾）获得4周的大鼠。所有动物均受提供的水和商业鼠食品的特殊病原体动物设施维持随意．

我们的实验设计被制度的动物护理和使用委员会审查并批准，委员会认识到，拟议的动物实验遵循了农业，执行元，台湾委员会和指导指南的动物保护法，如指南所示美国国家研究委员会，美国实验室动物资源研究所颁布的实验室动物的护理和使用。

２.２.原位肝移植(OLT)与新生自身免疫性肝炎的诱导

OLT是按照Kamada和Calne之前描述的技术进行的[23在DA-LEW (DA-LEW)组合中，这被称为急性排斥模型。所有血清样本保存在−80°C直到分析。

为了诱导Novo自身免疫性肝炎，静脉内通过阴茎静脉静脉内施用20mg / kg肝炎，20mg / kg溶解在pbs中的Con A（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ，USA）[18那24]植入受体LEW大鼠或naïve LEW大鼠。对照组与Con A组按相同时间注射PBS。

2.3。组织学评估

术后第7天(排斥期)取DA-LEW OLT大鼠肝组织，切片前用PBS或Con A注射，甲醛固定，石蜡包埋。此外，对DA-LEW OLT大鼠进行Con A注射，在OLT后200天>摘取长存活大鼠肝脏组织。取naïve DA大鼠肝组织作为对照。石蜡切片(3μm厚)在56°C下加热15分钟，脱脂，再水合，并根据制造商的方案用苏木精(Merck KGaA, Darmstadt，德国)和伊红(Sigma, St. Louis, MO, USA)染色。使用光学显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)检查所有切片。

２.４.核组蛋白H1和HMGB1的循环水平

如前所述，用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清组蛋白H1和HMGB1水平[25］.组蛋白H1的定量测定，0.1μg抗组蛋白H1多克隆AB（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）在100毫米Nahco_3.（将pH9.3）涂覆在96孔微量滴定板上（Naalge Nunc International，Roskilde，丹麦），在4℃下孵育过夜。然后用超级块T20（PBS）阻塞缓冲液（Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，USA）和血清样品（50 μL、×25稀释10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.9% (w/v) NaCl、0.5% (w/v) Tween 20。以犊牛胸腺组蛋白H1(美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔北部)为标准。将混合物在室温下孵育1小时。抗组蛋白H1单克隆抗体(×500稀释;加入Abcam, Cambridge, MA, USA)，室温孵育1小时。过氧化物酶偶联抗小鼠IgG (×2,000稀释;然后加入Santa Cruz Biotechnology)，混合物在室温下孵育1小时，然后加入1- step Ultra TMB substrate solution (Thermo Fisher Scientific Inc.)。根据生产商的方案，使用大鼠HMGB1酶联免疫吸附测定试剂盒(MyBioSource Inc.， San Diego, CA, USA)定量测定HMGB1。然后使用Victor X4多标记平板阅读器(PerkinElmer, Shelton, CT, USA)测量吸光度(450 nm)。

2.5。ELISA测量抗组蛋白H1和HMGB1 AB滴度

如前所述，我们使用ELISA评估抗组蛋白H1和HMGB1抗体滴度[11-14稍作修改。评价抗组蛋白H1和HMGB1抗体滴度μg/mL的牛胸腺组蛋白H1(上州)或重组人HMGB1(西格玛)在100mm NaHCO_3.(pH 9.3)涂于96孔微量滴定板(Nalge Nunc International)，室温孵育1小时。然后用SuperBlock T20 (PBS)阻断缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.)和血清样品(50μL，×100稀释10mM Tris-HCl（pH8.0），0.9％（w / v）NaCl，0.9％（w / v）吐温20）从受体或非植入的Lew大鼠与Con注入后的引用大鼠被添加到井中。将混合物在室温下孵育1小时。然后加入二级过氧化物酶 - 缀合的抗大鼠IgG（×2000稀释; Biosource International，Camarillo，Ca，USA），并将混合物在室温下温育1小时，然后加入ABTS底物溶液（Sigma）。然后使用Victor X4 MultiBel读数器（PerkinElmer）测量吸光度（405nm）。

2.6。OLT后供体特异性同种异体抗体(DSA)反应的测定

用流式细胞术检测DA大鼠脾细胞的单细胞悬液中的DSA反应，如前所述[26稍作修改。评估OLT后DSA反应，50μ等价物的L为5 × 10^5.脾细胞用50μL稀释naïve或olt后血清，4℃保存45分钟。用50μL特异于大鼠IgG（×100稀释）的Fc部分的FITC缀合的山羊AB的混合物和特定的PE - 缀合的山羊ABμ大鼠IgM链（×100稀释）（杰克逊免疫研究实验室，西尔维福，帕，美国）含有1％BSA和0.02％NaN的PBS_3.．染色后，细胞被清洗、固定，并使用LSRII流式细胞仪进行分析(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)。

2.7。RNA分离和实时PCR

在排斥反应阶段(术后第7天:)或在Con a注射后第4天使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)根据制造商说明提取非移植肝脏。总RNA (2μg)用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)逆转录为cDNA。大鼠特异性PCR引物分别为:GAPDH (sense)， 5 ' -CCATGGAGAAGGCTGGGG-3 '和(反义)，5 ' -CAAAGTTGTCATGGATGACC-3 ';Foxp3(意义)，5 ' -CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3 '和(反义)，5 ' -CTGCTTGGCAGTGCTTGAGAA-3 ';IL-10(意义)，5 ' -CAGACCCACATGCTCCGAGA-3 '和(反义)，5 ' -CAAGGCTTGGCAACCCAAGTA-3 '。采用7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems Inc.， Foster, CA, USA)对GAPDH、Foxp3和IL-10进行定量PCR。用GAPDH内参基因对数据进行归一化。的与GAPDH相比，对应于每个基因表达的值，以及，对应于实验组与对照组各基因的表达比。

2.8。SDS-PAGE和Western Blot分析

为了检测肝脏中Foxp3的蛋白表达，naïve DA肝脏和移植肝在排斥(术后第7天)或接受(>200天)时使用T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Fisher Scientific Inc.)补充蛋白酶抑制剂完成(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)手动均质。离心后，肝提取物(100μg)在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上，使用微型凝胶设备(Bio-Rad, Burlington, MA, USA)，将分离的蛋白质通过电子转移到聚偏氟乙烯转移膜上(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)。用5%脱脂牛奶在室温下封闭细胞膜1小时，并用抗Foxp3的小鼠单克隆抗体免疫检测(×2000;Santa Cruz生物技术)，然后用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (×10000;圣克鲁斯生物技术)。使用ECL Plus Western Blotting检测系统(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)对信号进行可视化，使用G:BOX Image Station iChemi XL设备(Syngene, Cambridge, UK)对相关条带进行密度定量。

2.9。统计分析

未配对的双尾学生T.- 最低用于确定两组中正常分布的价值手段之间的差异的重要性。每次测试每个样品，结果表示为平均值±SD。

使用Kaplan-Meier乘积极限估计法计算实际同种异体肝移植存活率。采用log-rank检验(Mantel-Cox)检验移植物存活曲线的相等性。

3.结果

３.１.诱导新生自身免疫性肝炎延长同种异体移植物存活

Con a诱导的急性肝损伤被认为是自身免疫性肝炎的模型，肝脏炎症的高峰时间是在注射Con a后24小时。cona注射瞬时提高抗组蛋白H1的抗核Abreg后，肝脏炎症在3至7天后自行恢复[18］.为了评估这种短暂诱导新生自身免疫性肝炎对同种异体肝移植存活的影响，我们在排斥联合(DA-LEW)中进行了移植肝移植，并在移植肝移植后3天注射Con A诱导了短暂的新生自身免疫性肝炎。如图所示1（a），肝脏同种异体移植存活率通过CON注射显着延长。肝脏组织学展示了在对照PBS和CON组中的排斥阶段（第7天）期间含有免疫细胞的大规模渗透和对肝实质的损伤，而在肝同种异体移植物中确认了轻度炎症但不严重的肝损伤长期存在的大鼠（OLT后的200天）（图1（b））.

３．２．Con A注射液对循环核组蛋白H1和HMGB1的抑制作用

核抗原释放到血液中与几种疾病的进展有关，我们之前的研究表明，在OLT后的排斥期(第7天)，核组蛋白H1和HMGB1升高[25］.如图所示2， OLT后注射Con A可显著抑制循环中的核组蛋白H1和HMGB1水平。

３．3.Con A注射后抗核抗体的诱导

抗组蛋白H1和HMGB1抗体被称为免疫Abreg，用于克服排斥反应和随后的肝移植接受[13那14］.为了研究抗核抗体对延长同种异体肝移植存活的影响，我们接下来评估了抗核抗体对核组蛋白H1和HMGB1的反应。如图所示3(一个)，大多数(4/5)Con a注射受体在OLT后7天表达了更高的抗组蛋白H1 Ab滴度，与基线(第0天)相比，仍保持在较高的水平，而在未接受Con A治疗的OLT (DA-LEW)或在Con A诱导的自身免疫性肝炎过程中短暂诱导的血清中未检测到抗组蛋白H1 Ab(图)3 (c))[13那14那18］.另一方面，在接受Con a注射的受者中，3/5的抗hmgb1抗体在OLT后第14天上调，并保持在较高水平，与抗组蛋白H1抗体相似(图)3 (b)）.在对照组中没有观察到这种抗HMGB1AB的升高（没有CON治疗的DA-LEW）（数据未显示）。值得注意的是，长存受体（2/5;> 200天）显示出在OLT过程中抗组蛋白H1和HMGB1 AB的最高滴度。这些结果表明AB反应对核组蛋白H1和HMGB1的重要性，以通过CON注射延长同种异体移植物存活。

3．4．康A注射液对同种抗体应答的抑制作用

接下来评估抗核核ABREG的诱导是否会影响抑制阶段（第7天）在抑制阶段（第7天）期间的供体特异性Alloantibody（DSA）反应。如图所示4.，DSA（IgG和IgM）在没有CON的OLT的血清中识别的DA脾细胞的百分比高但通过CON注射显着降低。这些结果表明AB对组蛋白H1和HMGB1的响应的诱导可以减少在OLT之后与抑制响应相关的DSA响应。

3．5．诱导Foxp3⁺Con A注射液在OLT肝脏中的调节性T细胞

为了探索调节性T细胞(Tregs)在Con a注射受体移植肝移植延长中的作用，我们接下来评估了肝移植后排斥期Foxp3和抑制性细胞因子IL-10的肝脏水平。如图所示5.，我们已经证实，在移植后第7天(即注射Con A后第4天)，同种异体肝移植中Foxp3和IL-10均升高，而Con A注射本身没有这些因素的升高。在长时间存活的同种异体肝移植中，肝脏中Foxp3蛋白水平也升高(图)5 (c)）.这些结果表明，自身免疫性肝炎和急性细胞排斥在肝同种异体移植物中的协同作用参与Treg介导的免疫调节，导致肝同种异体移植物在CON注入受者中的长期接受。

4.讨论

核抗原的释放及其被中和抗体抑制在免疫反应的启动和调节中是重要的。Wang等首次报道HMGB1在小鼠和脓毒症患者内毒素致死率中的促炎作用[27］.此后，越来越多的证据表明HMGB1在先天免疫和适应性免疫中的重要性，以及作为免疫调节的治疗靶点[28］.最近也证实了HMGB1在Con a诱导的急性肝损伤发病机制中的关键作用[29］.另一方面，与HMGB1相比，对组蛋白在免疫应答中的作用知之甚少，而我们之前的研究强烈提示，针对组蛋白H1的Ab反应对克服排斥反应的重要性[11-17]及保护Con a诱发的急性肝损伤[18］.我们随后的研究表明，组蛋白H1从细胞核转位到细胞质，并释放自身的组蛋白H1，对于DCs的成熟和T细胞的激活是必要的[30.］.此功能也类似于HMGB1在DC成熟中的作用[31］.最近的工作明确证明了通过TLR2和TLR4在急性肾损伤中诱导细胞外组蛋白的炎症反应诱导[32］.总之，这些结果表明，Abreg对核抗原的诱导如组蛋白H1和HMGB1，必须是废除炎症反应的稳态现象之一，并且可能与任何临床表现无关。

自身免疫性肝炎的复发或新生自身免疫性肝炎的特征是自身抗体的诱导[19那20.，但自身抗体在自身免疫性肝炎临床表现中的确切作用尚不明确。大多数研究者推测，由于排斥反应和炎症反应的协同作用，诱发新生自身免疫性肝炎会加速排斥反应。然而，在这项研究中，我们观察到一种独特的现象，即注射Con A能暂时诱导新生自身免疫性肝炎，但却能克服OLT后的排斥反应。然而,尽管长期生存OLT (DA-LEW)反对注入,肝脏组织学证明大量免疫细胞渗透到肝移植后7天OLT (DA-LEW)反对注射,这是类似于肝移植的OLT (DA-LEW)不反对注入。这些结果表明，OLT后cona注射早期炎性反应的排斥反应可能在免疫调节中发挥重要作用。与我们的研究类似，Li等最近报道了肝泡棘球蚴病感染大鼠OLT后急性排斥反应减弱的独特现象，提示寄生虫感染与排斥反应之间存在干扰[33］.我们最近证实，DA-PVG自然耐受模型的肝脏组织学也显示出与OLT后第7天DA-LEW联合排斥反应相似的排斥模式[34]，表明抑制抑制和炎症反应的累积是必要的，以克服排斥并随后诱导耐受性没有免疫抑制药物的耐受性。

此外，OLT后注射Con A可能导致宿主免疫系统达到耐受性状态，不仅抑制DSA反应，而且诱导对核组蛋白H1和HMGB1的Abreg。正如我们在最近的评论文章中提到的[25]，诱导抗核抗体的最初机制是核抗原的释放，核抗原的主要来源是移植周缺血/再灌注损伤、移植后排斥反应和Con a诱导的自身免疫性肝炎引起的肝细胞损伤。包括组蛋白H1和HMGB1在内的核抗原可能作为“核武器”诱导先天性和适应性免疫反应。在这种情况下，诱导相应的自身抗体可以中和这些核抗原，从而改善炎症和排斥反应。因此，我们推测自身免疫和同种异体免疫之间的竞争平衡对同种异体移植存活的延长是重要的。另一种接受同种异体肝移植的可能性是通过凝集素激活调节细胞以抑制其他细胞的增殖[35那36］.通过促进植物凝集素，扁豆凝集素，扁豆凝集素和CON A的促进后延长的同种异体移植物存活后肾脏，皮肤，胰腺和狗的心脏移植，大鼠和狗（狗）[37，但尚未在肝移植中进行探索。然而，在Con a诱导的自身免疫性肝炎小鼠模型中，提到了treg介导的肝炎症耐受诱导机制[1那38那39］.凝集素诱导的同种异体移植接受的推定机制不完全验证;但是，我们可以通过凝集素通过诱导核组蛋白H1和HMGB1来解释可能的免疫抑制机制，其负调节与Treg部分合作的有害T细胞反应负调节有害T细胞反应[40]，从而诱导异体移植接受。

CD4的诱导⁺CD25⁺Foxp3⁺主要产生IL-10的treg被认为是Con a注射后保护和恢复肝损伤的可能机制[1］.此外，Fujii等报道了在Con a诱导的肝损伤过程中诱导产生自身抗体的B细胞(即B-1细胞)[41］.自然发生的IgM自身抗体在预防自身免疫性糖尿病和促进同种异体移植物存活方面的治疗潜力最近已被报道[42］.B-1细胞也能产生抗炎细胞因子IL-10 [43］.将这些结果一起服用，在OLT后进行注射可以诱导产生IL-10产生的Tregs和B-1细胞，用于保护和恢复免受急性排斥和自身免疫性肝炎。然而，在这项研究中，我们只证实了肝脏水平的肝脏水平的升高。因此，应进行包括肝和循环水平的L-10产生的Tregs和B-1细胞的进一步研究，以阐明Tregs和B-1细胞在肝同种异体移植接受中的基本机制。

综上所述，我们目前的数据表明，OLT后注射Con A可短暂诱导新生自身免疫性肝炎，可能调节自身免疫和同种免疫的平衡，以克服排斥反应，并随后诱导移植肝接受。尽管本研究揭示了延长同种异体肝移植存活的独特现象，但本研究仍存在一些局限性，包括注射Con A可短暂诱发新生自身免疫性肝炎，这可能不能完全模拟新生自身免疫性肝炎的临床表现。此外，还需要做大量的工作来了解通过abeg参与对Treg上核组蛋白H1和HMGB1的免疫调节机制。我们需要明确自身免疫与异体免疫的平衡，以及肝移植后患者对感染性疾病和肝脏炎症的反应，以评价肝移植排斥和接受。

缩写

Abreg:	监管抗体
Auto-Ab:	自身抗体
骗子：	Concanavalin A.
达：	黑暗agouti.
DCs:	树突细胞
DSA:	供体特异性偶然杀虫剂
ELISA:	酶联免疫吸附试验
HMGB1:	高流动性组盒
卢:	刘易斯
MIP:	巨噬细胞炎性蛋白
肝移植:	原位肝移植
PVG：	花斑的微生物学报葛兰素史克
tregs：	调节性T细胞。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Toshiaki Nakano, Shigeru Goto，和Chia-Yun Lai都为这项工作做出了贡献。

致谢

这项工作得到了台湾长工纪念医院(CMRPD8A0701和CMRPD8B0291给Toshiaki Nakano)和国家科学委员会(NSC101-2320-B-182-037-MY3给Toshiaki Nakano)的部分资助。我们感谢高雄长庚纪念医院干细胞核心实验室使用流式细胞仪。

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