文摘
人类巨细胞病毒()血巨细胞病毒感染导致重大的发病率和死亡率在造血干细胞移植(HSCT)。在这项工作中,我们的表型特征和移行细胞(INF -)生产HCMV-specific T细胞使用QuantiFERON-HCMV试验在26个病人HSCT后6个月。我们分析了这两个参数是否与临床相关的变量。我们的研究结果表明,患者接受干细胞捐赠者≥40岁是12倍HCMV-specific CD8 + T细胞分化表型”(CD45RA + CCR7 +≤6.7%和CD28 +≤30%)比患者移植捐赠者< 40岁(;)。此外,检测干扰素-在应对生产肽血巨细胞病毒(截止0.2国际单位/毫升IFN -;“活性”QuantiFERON-HCMV测试)是统计与移植后复制血巨细胞病毒(;),收件人≥40与< 40岁(;),并使用外周血与骨髓干细胞来源(;)。总之,供体年龄是唯一因素显著相关的存在“分化表型”HCMV-specific CD8 + T细胞,而移植后复制血巨细胞病毒、接受者的年龄,和干细胞来源是干扰素的与生产相关的因素抗原表位血巨细胞病毒。
1。介绍
人类巨细胞病毒()血巨细胞病毒感染发病率和死亡率的主要原因在受试者接受同种异体干细胞移植(HSCT)由于长期的免疫缺陷后SCT (1- - - - - -3]。HCMV-specific HSCT后免疫重建中扮演着一个关键的角色在预防感染和血巨细胞病毒疾病。缺乏这个t细胞HCMV-specific族群与感染血巨细胞病毒的风险更高,因为据报道HCMV-seropositive患者接受HSCT HCMV-seronegative捐助者(4- - - - - -8]。的大小HCMV-specific CD8 + t细胞复苏预测的风险逐步感染血巨细胞病毒(8,9),但复制HSCT后还取决于血巨细胞病毒的存在失调HCMV-specific CD8 + T细胞的绝对数字而不是HCMV-specific T细胞(10,11]。
遇到后,血巨细胞病毒幼稚T细胞增殖并成为效应记忆HCMV-specific CD8 + T细胞,产生效应函数在外围组织和表现出分化表型。的差别在此过程中,对这些costimulatory表面分子(如CD28或CD27)和移行细胞的增加(IFN -)生产报告12- - - - - -15]。因此,幼稚T细胞的比例减少,增加并行的百分比差异化效应记忆T细胞(主要是CD28−)后观察到感染血巨细胞病毒。此外,这些表型变化HCMV-specific CD8 + T细胞也已与免疫衰老,这表明加速过程的与年龄有关的免疫功能障碍[血巨细胞病毒16- - - - - -19]。HSCT的设置,绝对数量之间的相关性的CD8 + T细胞HCMV-specific接受者和感染已经证明血巨细胞病毒的风险8]。此外,HCMV-specific less-differentiated CD8 + T细胞的数量的捐赠与血巨细胞病毒保护感染有关。这些供体淋巴细胞获得差异化的形象和限制函数HSCT后的收件人(10,11]。因此,评估的成熟状态和功能循环HCMV-specific HSCT后T淋巴细胞,临床因素的影响在HCMV-specific免疫恢复是至关重要的改善我们管理这些病人感染血巨细胞病毒。
在这项工作中,我们研究了干扰素-在应对生产和肽血巨细胞病毒HCMV-specific CD8 + T细胞的表型在一群HSCT患者6个月后同种异体移植。在这个横断面研究,我们分析这两个参数是否与移植后复制血巨细胞病毒以及其他相关临床变量如捐赠者和接受者的年龄,捐赠者和接受者serostatus,干细胞来源。我们的结果表明,HCMV-specific CD8 + T细胞的分化表型只有增加供体的年龄有关,而干扰素-生产反应肽与血巨细胞病毒复制,血巨细胞病毒和接受者的年龄和干细胞来源。
2。材料和方法
2.1。研究人群
26抗原* 0201接受同种异体HSCT患者招募和外周血样本的平均HSCT后950天(范围240 - 2436)。病人接受HSCT的血液学的雷纳索非亚大学医院(科尔多瓦、西班牙)。
2.2。监测血巨细胞病毒和先发制人的治疗
经常原生质的病毒载量是血巨细胞病毒筛查使用Cobas Amplicor监测血巨细胞病毒(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士),商用定量聚合酶链反应(PCR)检测的检出限600份HCMVDNA /毫升。潜在monitorization协议包括两个决定每周第一个月或直到放电期间,每周一个决心,直到天+ 100或+ 180患者移植物抗宿主病需要大剂量类固醇。复制被定义为任何的存在血巨细胞病毒在血浆病毒载量血巨细胞病毒检测极限(> 600拷贝/毫升)。
先发制人的缬(瑞士巴塞尔罗氏公司)管理:(i)的时候第一个积极的高危患者的病毒载量血巨细胞病毒(无关供者移植,类固醇治疗)或负载血巨细胞病毒患者10.000拷贝/毫升在单个样本;(2)第二个阳性样品的时候一个星期后。缬是口服药物的剂量900毫克b.i.d。2周(诱导剂量)其次是900 mg qd直到negativization复制血巨细胞病毒在连续2周(维持剂量)。肌酐清除率的剂量调整后标准的建议。缬暂时停止或取代磷甲酸如果需要患者中性粒细胞计数0.5×109 / L尽管g - csf的管理。
2.3。移植协议
空调方案的骨髓或降低强度调节协议(RIC)患者年龄50年或并发症。骨髓调节方案包括hyperfractionated全身辐照(13.2 Gy 8分数)+环磷酰胺(60毫克/公斤/天连续2天),Busulphan(0.8毫克/公斤注射。×16剂量)+环磷酰胺(60毫克/公斤/天2天)或ATG(兔子,2.5毫克/公斤/天×4天)+环磷酰胺(50毫克/公斤/天×4天)。降低强度协议由氟达拉滨(30毫克/米2×5天)+ Busulphan(0.8毫克/公斤注射。×10剂)或加美法仑(70毫克/米2×2剂量)。急性GVHD预防不同根据捐赠类型和强度调节方案:收件人的匹配相关的移植骨髓调节后收到了环孢菌素+短疗程的甲氨蝶呤,收件人收到的强度来调节环孢霉素+霉酚酸酯。此外,接受者的无关供者移植缓解HSCT的时候收到兔子ATG (Genzyme Thymoglobulin,弗雷明汉,妈,美国)6毫克/公斤−−4几天2。
2.4。表现型HCMV-Specific CD8 + t细胞的数量
收集血液样本在ACD管和外周血单核细胞(PBMCs)获得的聚蔗糖- hypaque - 1077梯度(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。人口研究HCMV-specific CD8 + t细胞,一个抗原* 0201五聚物绑定到一个immunodominant抗原决定基血巨细胞病毒(pp65 NLVPMVATV) APC-labeled (Proimmune,牛津大学,英国)使用。PBMCs (106每管)与单克隆抗体染色(mab)共轭与适当的荧光染料在4°C为30分钟根据标准程序。细胞也孵化马伯anti-CD8 (PerCP) anti-CD45RA (FITC) anti-CCR7 (PE), anti-CD28 (PE),或anti-CD27 (PE)(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。的频率A2 / HCMVpp65 pentamer-positive细胞CD8 + t细胞数量。表达不同的标记指A2 / HCMVpp65 pentamer-positive细胞。对于每一个样本,105事件是后天习得的。样品采集和数据分析进行使用FACSCalibur血细胞计数器(becton dickinson)和FlowJo软件(树星Inc . v 7.2.1、亚什兰,美国)。
2.5。正,生产使用QuantiFERON-HCMV化验
QuantiFERON-HCMV测试执行根据制造商的指示(澳大利亚墨尔本Cellestis有限公司)。简短的分析包括两个步骤:一晚血培养与CD8 + t细胞血巨细胞病毒合成肽抗原表位与随之而来的量化的正-生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)。最初,1毫升整除肝素化全血收集三个QuantiFERON-HCMV采血试管被大力,持续5秒。管中(我)的21个人类巨细胞病毒()血巨细胞病毒抗原表位肽从各种各样的蛋白质包括pp65血巨细胞病毒,IE-1, IE-2 pp50和gB (1μ克/毫升的21个不同的肽),(2)抗原,只有无菌磷酸盐缓冲盐水(负控制),或(3)植物凝集素(PHA;积极的有丝分裂原控制)。~ 24 h管被孵化的37°C。孵化后,上层的收获和IFN-g水平测量(国际单位/毫升)使用标准ELISA按照制造商的指示。结果计算分析软件(Cellestis有限公司)1.51 v。反应性血巨细胞病毒的截断值是0.2国际单位/毫升。
2.6。统计分析
使用SPSS软件统计分析了Windows v.18.0和EPIDAT 3.1软件。HCMV-specific CD8 + T细胞表达的人口占总人口的比例的CD8 + T细胞。的测试或Fisher精确检验被用于评估独立和相关的变量之间的关系。一个价值0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。病人的特点
26抗原* 0201的血液恶性肿瘤患者接受同种异体HSCT雷纳索非亚大学医院进行了研究。淋巴细胞复苏后获得的样本(1.000/109/ L) HSCT后至少6个月(平均950天;范围240 - 2436天)。的特点,总结了研究中的被试在桌子上1。收件人中值年龄42岁(范围16 - 68)和供体的年龄中值为40年(11 - 64)。百分之五十的病人接受了“是非”调节方案。14个(53.8%)患者外周血干细胞从骨髓干细胞和12 (46%)。十四HSCTs捐赠(D)和接受者(R) HCMV-seropositive R (D + / +), 10 D−/ R +, 2 D R−−/。百分之六十九的病人接受HSCT后糖皮质激素。11个病人(42.3%)有经验的移植物抗宿主病(GVHD)和15 (57.7%)HSCT后复制血巨细胞病毒但没人接受了疾病血巨细胞病毒。百分之六十九的捐助者是匹配的相关匹配无关的23%,只有7%的不匹配。
3.2。分类的病人根据HCMV-Specific CD8 + T细胞的表型
我们使用于* 0201 (pp65)五聚物研究HCMV-specific族群的频率和CCR7表达,CD45RA和CD28 HSCT患者在这个子集。我们的研究结果表明,CD8 + T细胞的比例和HCMV-specific百分比除以总CD8 + T细胞。的表型分析表明,平均百分比HCMV-specific CD8 + T细胞与天真的表现型(CD45RA + CCR7 +)以及这些细胞CD28的平均百分比表达。
考虑这些值,患者分为两组:有一个“分化表型”如果HCMV-specific CD8 + T细胞的价值观CD45RA CCR7 + +幼稚细胞≤6.7%,CD28 +细胞≤30%,拥有一个“nondifferentiated表型”,如果他们不满足这些标准。一个代表性的例子是图所示1。
3.3。HCMV-Specific CD8 + T细胞的分化表型的接受者与供体年龄相关
如表所示2,供体年龄是唯一因素显著相关的存在“分化表型”HCMV-specific CD8 + T细胞受体(;),而接受者的年龄,干细胞源或其他HCMV-related因素未达到统计上的显著水平。因此,接受干细胞捐赠者HSCT患者年龄超过40年是12倍HCMV-specific CD8 + T细胞分化表型患者比嫁接从捐赠者40岁以下。
3.4。正,生产反应肽与Post-HSCT血巨细胞病毒复制,血巨细胞病毒者年龄、干细胞来源
根据正患者分为两组生产在特定的肽血巨细胞病毒使用QuantiFERON-HCMV试验:病人谁正——“无功”生产高于0.2国际单位/毫升和中程核导弹的病人——“不反应的”产量低。结果见表3展示一个显著关联与移植后复制血巨细胞病毒(;)、接受者的年龄(;干细胞源(),;)。因此,受者经历HSCT后复制血巨细胞病毒,那些年龄超过40岁嫁接与外周血循环效应更容易港口HCMV-specific CD8 + T细胞产生正-。我们并没有发现任何显著差异虽然与捐赠者血清学接近血巨细胞病毒统计学意义()。虽然多变量分析将有助于更好地理解这些联系,排除了这样做的相对比较小的样本大小。
4所示。讨论
在这项工作中,我们研究了临床因素对t细胞表型的影响和反应的横断面研究26血巨细胞病毒抗原* 0201 HSCT受者。我们的研究结果表明,“分化表型”(水平HCMV-specific CCR7 + CD45RA + CD8 + T细胞≤6.7%和CD28 +≤30%)统计相关只有供体年龄超过40岁。一项研究[20.)已经表明,HCMV-specific HSCT后T细胞主要对应的扩张HCMV-specific从捐助者的T细胞。这些细胞的命运,在HSCT过继转移,是由捐赠者的特征,而不是其他因素与移植或病毒再活化有关。此外,作者表明,HCMV-specific T细胞的分化表型(CD27−CD57 +)在供体倾向于增加受体而不区分记忆细胞(CD27 + CD45RO + CD57−)倾向于减少。在这项研究中,作者并没有分析因素与天真的百分比或记忆细胞供体或接收者。然而,我们和其他人已经表明,年龄的一个主要因素决定的百分比HCMV-specific CD8 + T细胞及其表型(21在健康的个体。因此,“分化表型”之间的关联和捐助者的年龄系列观察可能反映了过继转移供者细胞的表型。这个观察是感兴趣的,因为它已经表明HCMV-specific HSCT后T细胞免疫在很大程度上取决于的频率和表型HCMV-specific捐助者的T细胞(20.,22),受老化影响(17,21,23- - - - - -25]。
此外,我们研究了干扰素-在应对生产肽血巨细胞病毒在这些病人。我们的结果表明,干扰素-生产(“活性”QuantiFERON-HCMV分析)与复制,血巨细胞病毒者年龄、干细胞来源。
HSCT后重新激活血巨细胞病毒患者的高水平较低的HCMV-specific T细胞终末分化表型(CD45RO−CD62L−)移植物在[22]。防止活化有关血巨细胞病毒扩散HCMV-specific T细胞(1),特别是高水平的HCMV-specific CD8 + T细胞分泌正-(26]。在肾移植受体,艾格力等。27干扰素-]显示差异反应HCMV-pp72和HCMV-pp65。后者似乎更适合审问CD4和CD8 t细胞室的ROC分析,和相关的更高pp65-specific CD4 t细胞反应和保护巨细胞病毒复制。此外,防止复制血巨细胞病毒相关联的HCMV-specific T细胞与生产能力的一些细胞因子反应肽血巨细胞病毒(IL2 /干扰素-双重职能或多官能的)而存在的T细胞产生干扰素-被认为是一种功能性疲惫的迹象T细胞不能有效控制复制血巨细胞病毒(28]。
我们的结果显示血巨细胞病毒协会与干扰素-复制在应对生产使用QuantiFERON-HCMV肽测定血巨细胞病毒可以认为干扰素-生产不足以控制复制HSCT后血巨细胞病毒所显示Krol et al。28),尽管它不能被丢弃,干扰素生产是干扰素的扩张和分化的结果在应对生产HCMV-specific T细胞复制血巨细胞病毒。
我们还表明,接受者的年龄与干扰素-相关联在应对肽生产。病人的年龄有深远的意义在复制血巨细胞病毒患者年龄超过40复制血巨细胞病毒有更高的概率比年轻病人,即使他们有类似的百分比HCMV-specific T细胞分泌干扰素-(26]。
几项研究已经分析了免疫重建的差异通过比较不同的干细胞来源。骨髓和外周血含有不同比例的天真和effector-memory t细胞亚群(29日- - - - - -31日),这就可以解释感染人数较低的接受者与外周血干细胞移植(32]。HSCT用外周血干细胞表现出更好的复苏HCMV-specific CD8 + t细胞功能移植后3个月相比,患者接受骨髓干细胞(10),从而支持,正的差异生产的t细胞亚群,可以导致不同的感染率血巨细胞病毒。相比之下,最近的一项研究[33]报道发生率较高的感染和血巨细胞病毒疾病一个月后外周血干细胞移植与HCMV-specific T细胞的功能能力越低,尤其是HCMV-specific CD8 T细胞的比例增加,产生一个单一的细胞因子和多官能的细胞比例较低。然而,3个月后HCMV-specific接受者之间的反应类似骨髓或外周血干细胞来源。我们的研究结果显示,使用外周血同事干扰素-增加的情况生产反应肽强烈建议外周血血巨细胞病毒包含更高比例的HCMV-specific释放IFN - T细胞的能力以响应比骨髓血巨细胞病毒。然而,如上所示,干扰素-生产控制复制血巨细胞病毒是不够的。这个控制的能力可能是由于血巨细胞病毒的存在在这些患者HCMV-specific功能只疲惫的T细胞产生干扰素-为了应对所显示血巨细胞病毒Krol et al。28]。
5。结论
总之,我们的结果表明,而HSCT后HCMV-specific CD8 + T细胞的表型与供体年龄有关,干扰素-生产针对肽associates血巨细胞病毒复制血巨细胞病毒发作,接受者的年龄,和使用外周血干细胞来源。干扰素-的协会生产反应肽血巨细胞病毒复制集血巨细胞病毒和外周血干细胞支持的来源,复制血巨细胞病毒产生干扰素的扩张——具有重要的意义生产HCMV-specific捐赠者的外周血T细胞存在,导致血巨细胞病毒控制感染。然而,它不能排除在体外干扰素-生产不足以控制和复制HSCT后血巨细胞病毒,这可能反映了“单功能的筋疲力尽的存在而不是“多重的”effector-memory特异性T细胞(28]。它可以开发其他感兴趣的测试容易执行,经济和可靠的immunomonitor多重的HCMV-specific T细胞,这可能会更好地保护血巨细胞病毒相对应。此外,由于这里的观察报告来自一个横断面研究样本量相对较小,这些研究结果不能推广基于这项研究。因此,这将是重要的确认和扩展这些发现的前瞻性研究,包括分析HCMV-specific HSCT前T细胞和其他额外的时间点。这样的研究将帮助临床医生评估的风险感染血巨细胞病毒以及免疫治疗策略的调整HCMV-specific t细胞免疫和随后HSCT后血巨细胞病毒控制感染。
确认
这项工作是支持的西班牙科技部创新,学院祝您健康卡洛斯三世(赠款FIS 09/00723 r . j . Torre-Cisneros索拉纳和FIS 08/0336)和欧洲区域发展基金共同投资的方式来达到欧洲ERDF和西班牙网络研究传染病(REIPI RD06/0008)。j . Torre-Cisneros。和美国Cantisan收到罗氏制药的无限制的研究资助。