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免疫学研究期刊》的研究
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免疫学研究期刊》的研究/2013年/文章
特殊的问题

细胞介导免疫和疫苗

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2013年 |文章的ID 283649年 | https://doi.org/10.1155/2013/283649

Kai瑙曼瑞韦娜,Anett南部,克里斯蒂的作品,雅克Rohayem马克•施密茨, ”激活树突状细胞的小说toll样受体3受体激动剂RGC100”,免疫学研究期刊》的研究, 卷。2013年, 文章的ID283649年, 11 页面, 2013年。 https://doi.org/10.1155/2013/283649

激活树突状细胞的小说toll样受体3受体激动剂RGC100

Kai瑙曼,1 瑞韦娜,2 Anett南部,2 克里斯蒂的作品,1 马克•施密茨,2 和 雅克Rohayem1,3

1拉德博伊尔Riboxx GmbH,迈斯纳Straße 191、01445距离最长的德国

2医学免疫学研究所教授卡尔·古斯塔夫词Carus德累斯顿技术大学Fetscherstraße 74年,德国德累斯顿01307

3医学病毒学研究所教授卡尔·古斯塔夫词Carus德累斯顿技术大学Fetscherstraße 74年,德国德累斯顿01307

学术编辑器:Subhasis将挑战
收到了 2013年7月11日
修改后的 2013年9月10日
接受 2013年10月29日
发表 2013年12月02

文摘

toll样受体(TLR) 3受体激动剂成为有吸引力的候选人对肿瘤疫苗接种战略和病原体。这种受体激动剂的一个重要的作用机制是基于TLR3-expressing树突状细胞(dc)的激活,它显示一个独特的诱发和刺激t细胞反应的能力。在这种情况下,它已经表明,针对双链RNA的TLR3如保利(我:C)导致DCs的有力激活。保利(我:C)的主要缺点包括其定义化学结构和非常贫穷的同质性,与随后的不可预知的药物动力学和高毒性。在目前的研究中,我们评估了小说的理化性质和生物活性TLR3兴奋剂RGC100。RGC100定义了化学结构,定义的长度(100个基点)和分子量(64.9 KDa)和良好的溶解性。RGC100稳定在血清和激活骨髓DCs通过TLR3定位,基因沉默的实验就证明了这一点。激活的老鼠和人类骨髓CD1c+DCs RGC100导致多种促炎细胞因子的分泌。此外,RGC100改善CD1c的能力+DCs来刺激t细胞增殖。由于其物理化学性质及其免疫刺激性属性,RGC100可能代表一个有前途的佐剂对预防和治疗性疫苗接种策略。

1。介绍

在感染的初始阶段,先天免疫系统生成一个迅速和有效的炎症反应。这个响应旨在阻止传染病的传播,随后激活的T细胞和B细胞对病原体的获得性免疫反应(山1]。识别pathogen-related组件通过免疫细胞发生病原体识别受体(PRR)。PRRs存在于细胞表面的核内体,或胞质。toll样受体(TLR)代表一个重要的繁殖与呼吸障碍综合症(俗称家庭2,3]。他们表示不同子集的免疫细胞,如树突状细胞(dc) [4]。DCs是专业发挥重要作用的抗原递呈细胞的诱导和维护先天和适应性免疫反应(5,6]。由于其突出的toll样受体的表达和功能性质的甲壳低聚糖,DCs代表有前途的候选人TLR agonist-based肿瘤疫苗接种策略和病原体(7,8]。

在BDCA1 TLR3表达已经证明+骨髓DCs (mdc), human-monocyte-derived DCs (MoDCs)但不是在血浆DCs (9- - - - - -13]。双链RNA(极)是一种配体TLR3 [14]。它被公认为其分子模式(PAMP时),引发先天免疫应答通过互动TLR3表达的DCs (15- - - - - -17]。值得注意的是,各种各样的癌症细胞表达TLR3已报告。在触发TLR3在肿瘤细胞中,细胞凋亡和/或antitumoral效应发生(18- - - - - -21]。

Polyinosinic-polycytidylic酸聚(我:C)是一种有效的激活先天免疫(14,22]。保利(我:C)激活DCs通过组合定位的各种先天免疫途径,包括TLR3。保利(我:C)的主要缺点包括其定义化学结构和非常贫穷的同质性,造成其制造过程(23]。保利(我:C)由单链和双链RNA分子从约1.5到8 kb (22),不完全退火dsRNA或单链RNA。这主要是由于有限的溶解度和困难的重建保利(我:C),需要加热(50 - 60°C)和慢速冷却在许多小时达到再次退火聚(I)和聚(C)链。因此,聚(我:C)有一个报道毒性在临床试验中,从敏感到凝血障碍,肾功能衰竭,或系统性心血管衰竭(24]。dsRNA化合物的进一步问题,如聚(我:C)是他们的体液通过rna的快速降解,半衰期报道的几分钟(25,26)和随后的不可预知的降解产物的药物动力学。优化的物理化学性质的聚(我:C)导致代衍生品增加了稳定体液(如polyICLC), (27)或减少毒性通过减少稳定体液(如聚(我:C12U) (28,29日]。保利(我:C)及其衍生物生产GMP条件下静脉各临床试验管理和测试(28- - - - - -30.]。

在目前的研究中,结构,分析小说的概况和生物活性TLR3兴奋剂RGC100。RGC100显示一个良好定义的化学结构、长度和分子量,良好的溶解性和血清稳定性,能够激活DCs剂量依赖性的方式通过专门针对endosomal TLR3。

2。材料和方法

2.1。理化分析

分析RGC100长度和完整性进行12%本地页面。DNA标记(Fermentas、德国)是用来说明RNA分子大小分布和染色是通过使用染料(美国阿尔法蛇丘)。分析聚(我:C)进行1%琼脂糖凝胶电泳。两个不同的聚(我:C)化合物使用:保利(我:C)与低分子量(美国Invivogen流明瓦,0.2 1 kb),聚(我:C)和高分子量(美国Invivogen高分子量1.5 8 kb)。RNA标记(Promega、德国)是用来说明分子大小分布。

RGC100在解决方案的物理特性是由凝胶排阻色谱(SEC)与紫外线折射指数(RI),直角光散射(、)检测在Viscotek TDAmax(英国莫尔文)。样本容量为125μL (~ 100μg RGC100)注入Superdex 200 10/300列(美国通用电气医疗集团)和证券交易委员会是由使用磷酸缓冲盐。

2.2。Immunomagnetic隔离CD1c+DCs和CD3+T淋巴细胞

血液样本获得知情同意与健康的捐赠者。这项研究是大学医院的机构审查委员会批准的德累斯顿(没有。EK 27022006)。外周血单核细胞(PBMCs)通过Ficoll-Hypaque (Biochrom、德国)密度离心。随后,人类CD1c+直流被孤立于刚做好的PBMCs immunomagnetic负损耗和积极的选择根据生产指令(Miltenyi研究,德国)。CD3+T细胞是隔绝PBMCs负损耗使用immunomagnetic分离根据制造商的指示(Miltenyi研究,德国)。分析细胞制剂的纯度,CD1c+DCs是沾PE-conjugated anti-CD1c+和FITC-conjugated anti-CD19和CD3抗体+T细胞与PE-conjugated anti-CD2和FITC-conjugated anti-CD3抗体。纯度是由流式细胞仪分析,进行一个FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学、海德堡、德国)。

2.3。淋巴细胞增殖试验

CD1c+DCs (1×104/)与自体CD3 cocultured+T细胞(1×105细胞/ 50)的存在与否μ克/毫升RGC100或聚(我:C)在圆底96 -孔板。coculture之前,t细胞是沾染了1μ670细胞增殖染料eFluor (eBioscience,德国)。细胞培养8天,收获和T细胞增殖通过流式细胞仪分析,这是进行一个FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)。

2.4。细胞和细胞因子分析

大白鲨2细胞系来自美国类型文化协会(美国写明ATCC)。下巴II是一种不灭的不成熟骨髓直流线来自C57BL / 6小鼠,显示一个类似表型形象休息从DCs (BMDCs) [31日]。细胞被镀在圆底96 -孔板5×104在DMEM / 10%胎牛血清(FCS)和1%青霉素和链霉素(100 U /毫升)。细胞被孵化与RGC100 (Riboxx、德国)不同浓度有或没有预孵化与氯喹(美国Invivogen)。16 h后,收集上清液和细胞因子和趋化因子的浓度是由ELISA根据制造商的指示(试剂盒,德国)。

评估小干扰rna在下巴II DCs的毒性,进行细胞增殖试验如前所述[32]。短暂,下巴II DCs被播种到5×10的96孔板4细胞/。核的连续稀释浓度从200纳米到12.5纳米添加到细胞。24小时后,100年μL MTS的解决方案(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)被添加到每个。2 h后,解决方案的吸光度为490 nm和CC50值确定。

人类CD1c+DCs在圆底镀96 -孔板为2.5×104/在RPMI 1640人类AB血清中含有10% (CCPRO、德国),2毫米谷酰胺,不必要的氨基酸1%,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(Biochrom,德国)。然后,细胞被刺激与RGC100或聚(我:C)在不同浓度(Sigma-Aldrich,德国)。24小时后,上层清液被收集和il - 1的浓度β、il - 6和TNF -α按照制造商的指示是由ELISA (BD生物科学)。

2.5。基因沉默的TLR3

基因沉默是使用小干扰rna (Riboxx、德国)IBONI执行针对TLR3 (5′-CTCGGCCTTAATGAAATTGAA-3′)和一个不属预定目标的核(Riboxx,德国)。因此,大白鲨2细胞被镀在圆底96 -孔板5×104/好,37°C(5%孵化有限公司2)16 h。然后,小干扰rna (Riboxx IBONI。德国)是混合riboxxFECT转染试剂(Riboxx、德国)根据制造商的指示和混合的浓度添加到井20海里。在转染后6 h, RGC100添加和细胞孵化16 h。随后,细胞和上层的收获。RNA从细胞中提取使用RNeasy工具包(试剂盒、德国)和用于随后的存在。上层清液用于细胞因子测量按照制造商的指示与ELISA试剂盒,德国。执行中存在使用QuantiTect LightCycler底漆化验(试剂盒、德国)鼠标TLR3和鼠标β肌动蛋白和QuantiTect SYBR绿色rt - pcr试剂盒(试剂盒、德国)根据制造商的指示。

2.6。血清稳定性分析

RGC100 (1.6μ米)在80% FCS孵化,小鼠血清或人血清37°C从1 h - 7天。FCS,购买了小鼠血清英杰公司(德国)和Sigma-Aldrich分别(德国)。人类从献血者血清收集。RGC100完整性评估通过分析本土12%的页面。作为一个指示器,RGC100不使用血清中孵化。作为有效的控制极的血清核酸酶降解,dsRNA (1.6μ米)的25个基点在FCS孵化,小鼠血清或人血清5 h和分析本土12%的页面。

2.7。熔点分析

分析RGC100 (3μ米)上执行一个LightCycler(瑞士罗氏公司)使用riboxx式灯具(riboxx、德国)根据制造商的指示。

2.8。统计分析

学生的 执行以及评估结果的重要性。的值 ,被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

3.1。RGC100定义化学结构和良好的溶解性

RGC100设计了基于知识TLR3受体激动剂的结构和生物学特性。晶体结构与其dsRNA TLR3 ectodomain的配体(33]表明dsRNA ~ 45 bp的长度是足够激活TLR3 [34]。最重要的是,交互的TLR3 ectodomains只发生核糖骨干,表明触发TLR3不是RNA序列的特定(33]。因此,长度的主要决定因素是dsRNA TLR3触发(35]。

RGC100序列组成的选择是基于以前的研究在生物活性在活的有机体内polyguanidinic-polycytidinic化合物(聚(G: C))。保利(G: C)据报道有相同的interferon-inducing和抗病毒活性聚(我:C) (36]。重要的是,保利(G: C)显示一个LD高12.7倍50保利(我:C)相比,当管理静脉注射到小鼠(200毫克/公斤和15.8毫克/公斤,职责。)(36]。兔子,LD50保利(G: C)管理静脉注射比聚高到4.5折(我:C)(1毫克/公斤和0.22毫克/公斤,resp。) (36]。

这些实验观测长度和序列组成考虑,我们设计了RGC100熊100个基点的长度,,由100 rC - 100 rG配对。分析本地页面和SEC与紫外线、RI和LS检测表明,RGC100显示一个定义的物理化学结构。RGC100有观察64.6 kDa的分子量(MWcalc= 64.9 kDa)较低的多分散性(数字1(一)和1 (c))。RGC100的熔点为91.6°C。

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图1
决心RGC100的物理化学性质。(一)分析RGC100 12%本地页面。RGC100显示100个基点的长度表示。它由100个rC基地配对100 rG基地,在双链完全退火。作为参考,100 mer homopolymeric组成的胞嘧啶核苷。(b)分析保利(我:C) 1%琼脂糖凝胶电泳。p (I: C)流明瓦:保利(我:C)与低分子量。p (I: C)高分子量:保利(我:C)与高分子量。(c)分析RGC100通过与紫外凝胶排阻色谱(SEC),国际扶轮和文化、检测。数据分析提供的信息分子大小和多分散性(Mw / Mn = 1.015)。

定义的化学结构和良好的溶解度RGC100的重要性减少TLR3受体激动剂的潜在毒性。作为保利(我:C),观察到的同质性化合物毒性的《创世纪》中扮演着重要的角色。保利(我:C)是一种多分散的和异构化合物(图1 (b))由于其聚合物大分子结构,单一的聚(rI)和聚(rC)以及dsrna保利(我:C)不同的长度。这么高的化学异质性导致不可预知的药物动力学(35)转化为严重有毒副作用在临床试验中观察到,如凝血病、过敏性反应,肾功能衰竭,甚至导缆器(24]。异质性的化学结构的聚(我:C)导致不可控和组合的至少三个先天免疫信号通路,即TLR3, rig - I和/或mda - 5 (22]。实际上,信号的触发TLR3 dsRNA超过50个基点的长度(34,35),而信号的刺激下,rig - i dsRNA长度为300 - 1000个基点(22,37,信号激活mda - 5的dsRNA超过1000个基点(22,37,38]。此外,存在ssRNA混合物中造成不完全退火触发TLR7 [33]。综上所述,保利(我:C)的毒性主要涉及其异质成分和未定义的化学结构,后续不可预知的药物动力学和生物活性(35]。

使用TLR3受体激动剂如RGC100的优点显示定义的物理化学性质如溶解性、同质性、以及精确的化学结构、长度和分子量已经强调了由其他人(35]。RGC100的另一个重要优点是免疫细胞激活的力量进行微调,通过改变dsRNA复合的长度。先前报道(35),TLR3通路的激活在活的有机体内主要取决于dsRNA的长度,而不是核苷酸序列。因此,RGC100提供除了化学结构定义的高度,可能优化选择性指数为一个特定的免疫效力和毒性的迹象。显然这些理化和功能属性区分RGC100保利(我:C)(表形式1)。
长度 分子量 化学结构 Biostability一个 受体激动剂的
RGC100 100个基点 64.6 KDa 极 7天 TLR3
保利(我:C) ~ 1500 - 8000个基点 ~ 1020 - 5440 KDa dsRNA±ssRNA < 5分钟 TLR3, RLRsb
一个Biostability测量血清抵抗核酸酶;bRLR: RIG-I-like受体。
表1
RGC100的理化和功能特性的比较和聚(我:C)。
3.2。在血清RGC100是稳定的

稳定RGC100在血清检查。RGC100与FCS孵化,小鼠血清和人血清,其完整性评估本地页面上。如数据所示2(一)2(f),在FCS RGC100是稳定的,老鼠和人类血清7天。相比之下,25个基点的dsRNA用作控制在5 h(数据是退化2(g)2(我))和聚(我:C)孵化与FCS完全退化在不到5分钟(见附加图S1)网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/283649。这并不奇怪,因为据其他人,极是通常在几分钟内血清退化25,26]。退化是由于血清rna(核酸酶活性25,26]。血清中RGC100稳定性的增加可以解释GC含量的100%。实验数据表明,GC丰富序列叠加显示紧基地dsRNA结构(39),后续增加双稳定(39]。越来越稳定的双工已经被证明可以提高血清中dsRNA半衰期。例如,锁核酸增加稳定的双工带来阻力dsRNA血清核酸酶(40]。此外,化学修改核糖(即支柱。,2′-O-Methyl) that increase duplex stability improves its resistance to serum nucleases [25]。我们的研究表明,RGC100显示物理性质使它适合在活的有机体内应用程序。


图2
μ 评估的稳定性RGC100 FCS,小鼠血清或人血清。RGC100 (1.6M)孵化在37°C和80%血清样本分析12%本地页面上显示时间点(h,小时和d,天)。显示相应的未经处理的dsRNA (0 h)作为参考。(一)孵化的RGC100 FCS 5 h。(b)孵化的RGC100小鼠血清5 h。(c)孵化RGC100的人类血清5 h。(d)孵化的RGC100 FCS 7天。(e)孵化的RGC100小鼠血清7天。人类血清(f)孵化RGC100 7天。(g)的孵化dsRNA(25个基点)作为控制在FCS 5小时。(e)孵化dsRNA(25个基点)作为控制在小鼠血清5小时。 (f) Incubation of dsRNA (25 bp) used as a control in human serum for 5 hours.
3.3。RGC100激活小鼠骨髓DCs

DCs显示一个非凡的诱导和扩大CD8的能力+细胞毒性T淋巴细胞(ctl)和CD4细胞+T细胞(8,41]。CD8+ctl有效摧毁肿瘤细胞,而CD4细胞+T细胞促进dc的抗原递呈能力,激活和CD8扩散提供帮助+ctl。除了其独特的诱发和刺激t细胞反应的能力,DCs有效改善自然杀伤细胞的免疫调节和细胞毒性潜能,这有助于消除病毒感染和肿瘤细胞(42]。由于各种免疫刺激性属性,DCs发展有前途的候选人为肿瘤疫苗接种策略和病原体(7,43]。

在目前的研究中,我们调查的影响上RGC100 TLR3-expressing小鼠下巴II细胞,代表成熟骨髓DCs,已被用于研究专注于抗肿瘤和pathogen-specific免疫(31日]。大白鲨2细胞株后立即扩大接待从供应商和冷冻整除。细胞被维护在文化不超过4周。这些步骤是为了确保没有完成表型发生漂移,由他人推荐(44]。如图3(一个)第二,孵化的下巴DCs与RGC100导致分泌各种细胞因子和趋化因子。高水平的肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 1β观察,如预期DCs的激活。然而,下巴II RGC100细胞的刺激后,I型干扰素的分泌没有检测到。再进一步,剂量反应的RGC100检查。如图3 (b)第二,有效激活下巴DCs实现一系列的浓度从50到500μ克/毫升。

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图3
μ 激活的下巴II DCs RGC100剂量依赖性的方式。(一)、细胞因子和趋化因子的下巴II DCs RGC100激活。RGC100孵化了下巴II DCs 16 h浓度达到250克/毫升。分泌的细胞因子被ELISA测定。负控制由上层的细胞没有RGC100孵化。值负控制已经减去的值在图上表示。显示值均值±SEM的两个独立的措施。(b),剂量依赖性激活下巴II RGC100 DCs。RGC100是孵化与细胞16 h浓度表示。il - 6的分泌由ELISA测定。显示值均值±SEM的两个独立的措施。负控制由上层的细胞没有RGC100孵化。 Values of negative control have been subtracted from the values represented on the graph.
3.4。RGC100的配体Endosomal TLR3

探索的作用机制RGC100, TLR3击倒的下巴II DCs进行。为了防止核的脱靶效应产生的细胞毒性,CC50核的细胞增殖试验评估。CC50核> 200海里。因此,浓度用于击倒TLR3 (20 nM)被选为10倍低于CC50。此外,本试验中使用的核显示一个特定的设计,防止脱靶效应,如前所报道(45]。如图4TLR3表达的沉默下巴II DCs RGC100抑制激活,表明TLR3 RGC100的配体。

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图4
β 抑制活化的下巴II DCs RGC100用siRNA TLR3目标。细胞治疗可以阻止针对TLR3,然后孵化与RGC100浓度表示。RNA提取,上层的收获。(a)相对TLR3 mRNA的表达在细胞治疗可以阻止针对TLR3或不属预定目标的核(数控siRNA)。信使rna水平正常化肌动蛋白mRNA。再保险公司相对表达式。(b) il - 6的分泌由ELISA测定。显示值均值±SEM的两个独立的措施。负控制由上层的细胞没有RGC100孵化和核。值负控制已经减去的值在图上表示。

再进一步,我们检查是否endosomal酸化对激活RGC100下巴II DCs的至关重要。为此,细胞治疗氯喹孵化与RGC100紧随其后。如图5(一个),抑制endosomal酸化氯喹刺激受损的下巴II RGC100 DCs的剂量依赖性的方式(图5 (b)),这表明endosomal吸收RGC100激活的至关重要。

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图5
μ μ 抑制活化的RGC100下巴II DCs通过氯喹。(一)细胞第一次用氯喹治疗(治疗,100米)(本地),然后孵化与RGC100浓度表示。(b)细胞第一次用氯喹治疗浓度表示,然后用RGC100孵化(50g / mL)。il - 6的分泌由ELISA以浮层。显示值均值±SEM的两个独立的措施。负控制由上层的细胞没有RGC100孵化。值负控制已经减去的值在图上表示。
3.5。RGC100人类骨髓树突状细胞激活

让小说的见解RGC100的影响人类DCs TLR3-expressing本机的免疫刺激性性质,我们调查是否由CD1c RGC100促进促炎细胞因子的释放+DCs相比,聚(我:C)。因此,CD1c+DCs和CD3+T细胞从血液健康的捐赠者immunomagnetically孤立的存在与否和维护RGC100和聚(我:C)。孤立CD1c的纯洁性+直流和CD3+T细胞> 90%作为评估流仪分析(补充图S2)。如图6,无论是TLR-3受体激动剂有效地刺激il - 1的生产β由CD1c和il - 6+DCs。有趣的是,与保利(我:C)相比,RGC100显著增强能力,促进il - 1β由CD1c和il - 6+DCs,而刺激肿瘤坏死因子——的能力α分泌物是TLR-3受体激动剂(图之间的可比性6)。在进一步的实验中,我们评估的影响RGC100 CD1c的能力+DCs来刺激T细胞的增殖。如图7RGC100和聚(我:C)增强CD1c显示类似的潜力+DC-mediated T细胞增殖。这些结果表明,小说TLR3兴奋剂RGC100有效刺激释放肿瘤坏死因子-α,il - 1β由CD1c和il - 6+DCs和提高他们的能力,促进T细胞增殖。

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图6
+ + β α 人类骨髓CD1c的激活DCs RGC100和聚(我:C)。新孤立CD1cDCs的存在与否是培养RGC100或聚(我:C)。24小时后,上层的收获和il - 1的浓度、il - 6和TNF -是由ELISA。结果一个代表捐赠的三个执行类似的结果。值代表一式三份样本的均值±SEM和星号指示一个统计上的显著差异()。
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图7
+ + μ 影响RGC100 CD1c和保利(我:C)DC-mediated t细胞增殖。CD1cDCs与自体cocultured 50 T细胞的存在与否克/毫升RGC100或聚(我:C)。coculture之前,T细胞与细胞增殖染料染色eFluor 670。细胞培养8天,收获和T细胞增殖是由流式细胞术。(a)一个捐赠的三个代表执行的结果与类似的结果进行描述。(b)提出了三种不同的捐赠者的结果意味着±SEM。星号表示一个统计上的显著差异(*)。

4所示。结论

在目前的研究中,实验数据的物理化学性质和生物活性的小说TLR3兴奋剂RGC100。RGC100最佳的物理化学性质,如血清中定义的化学结构和稳定性。RGC100激活小鼠骨髓DCs通过针对endosomal TLR3,导致剂量依赖性的方式促炎细胞因子的分泌。此外,RGC100有效增强促炎细胞因子的分泌人类CD1c本机+DCs和提高他们的能力,促进t细胞增殖。基于这些属性,RGC100可能代表一种很有前途的候选人为预防性和治疗性肿瘤疫苗接种策略和病原体。

信息披露

Kai瑙曼,克里斯蒂的作品和雅克Rohayem Riboxx GmbH的雇员,Radebeul,德国。RGC100覆盖着两个PCT专利家庭(待定)。

确认

作者要感谢凯特琳Jager的优秀的技术工作,康斯坦丝Grunau,两种玻姆,和多萝西娅·克莱默,以及有触须的•。

补充材料

补充无花果1。评估的稳定性聚在FCS(我:C):

保利(我:C)(2µg)孵化在37°C和80%血清样本1%琼脂糖凝胶上进行了分析和可视化的紫外线透照法染色后GelRed表示时间点(min)。

补充无花果2。纯洁的immunomagnetically CD1c孤立+DCs和CD3+T细胞:

人类CD1c+直流和CD3+T细胞是孤立的从刚做好的健康的捐赠者PBMCs immunomagnetic分离。(一)CD1c的纯洁性+DCs或(B) CD3+健康供者T细胞从一个代表六(A)或(B)执行显示了类似的结果。

  1. 补充材料
  2. 补充材料

引用

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