文摘

toll样受体(通常),一个家庭的模式识别受体识别病原体,表达的分子通常表达的免疫细胞。然而,最近的一些研究显示功能TLR表达在肿瘤细胞。肿瘤细胞的表达是一把双刃剑。不仅描述肿瘤促进TLR配体的影响,也直接oncopathic和免疫刺激性影响。澄清通常的角色在结直肠癌(CRC),我们测试了TLR配体LPS的影响,聚我:C, R848,和紫杉醇主要人类CRC细胞系(HROC40、HROC60 HROC69)在体外和在活的有机体内(CT26)。紫杉醇,不仅有力tumor-apoptosis-inducing,而且TLR4-activating化疗化合物,抑制生长和生存能力的细胞系,而剩下的TLR配体只有边际效应(R848 >有限合伙人>聚我:C)。这里的物质没有改善的组合的结果,而antitumoral效果显著提高当人类淋巴细胞被添加。这里,TLR结合配体通常减少antitumoral效果。在活的有机体内,最好的肿瘤生长控制通过紫杉醇和R848的结合。然而,当结合有限合伙人,紫杉醇加速肿瘤的生长。这些数据通常证明TLR配体的潜在控制肿瘤的生长并激活免疫细胞,但他们也证明的重要性,选择正确的组合。

1。介绍

癌症研究的最后几十年以来,许多方法已经开始针对激活细胞毒性抗肿瘤免疫反应。除了针对适应性免疫系统,刺激器的先天免疫系统得到了太多的关注。在这种背景下,造成强烈的免疫刺激能力,toll样受体的配体(通常)进行了广泛的研究。通常是一个家庭的模式识别受体。他们有一个关键位置的一线防御病原体识别特定分子模式,其守恒的结构表达的病原体。此外,他们结合内源性分子模式有关。这些分子被释放的压力或垂死的细胞(1]。在配体结合,TLR-signaling导致炎症和抗菌反应,因此启动自适应免疫反应(2]。除了组件直接来自细菌或病毒,合成物质如聚我:C (TLR3配体)或Resiquimod (TLR7/8 R848,配体)广泛研究作为单一的物质在实验癌症模型或作为疫苗佐剂在临床试验3- - - - - -5]。

通常主要是属于先天免疫系统的细胞表达的手臂,树突状细胞(dc)和单核细胞。表达的观察,通常在功能上是几种类型的肿瘤,然而,向另一个提示肿瘤促进作用[6]。最近的证据表明,他们在肿瘤发生是把双刃剑。

更多,一些研究显示不良反应通常在致癌作用。茶室等人描述LPS-induced恶性转化的良性前列腺上皮细胞(7]。Schmaußer集团发现,通常对恶性胃癌细胞启用与病原体和随后增强细胞增殖(8]。一些额外的研究证实肿瘤生长和malignancy-promoting通常过表达对肿瘤细胞的影响。这些包括就业由乳腺癌和结直肠癌细胞TLR4信号(9,10),以及flagellin-induced激活TLR5对胃癌细胞(11]。

另一方面,至少在许多研究显示antitumoral TLR配体的影响通过诱导肿瘤细胞凋亡/坏死或激活免疫细胞。直接oncopathic影响在不同肿瘤实体描述了保利我:C (TLR3受体激动剂)和咪喹莫特(TLR7受体激动剂)12- - - - - -14]。因此,类似于我们对免疫系统作为一个整体,通常都能够抑制和促进癌症。

尽管TLR表达模式及其对免疫细胞的影响是很好理解,在肿瘤发生和产生的免疫功能相关性变化仍有待阐明。还需要进一步的研究来阐明其功能在肿瘤生物学和评估他们的治疗潜力,最终将有助于建立有效的治疗计划。因此,我们这里测试TLR配体治疗大肠癌癌(CRC)在体外和在活的有机体内。实验显示溶瘤细胞的作用最强的免疫系统的功能。因此,这些发现强调的理由使用TLR配体在癌症immunotherapy-either单独或组合;最好是与常规化疗。

2。材料和方法

2.1。肿瘤细胞系和TLR配体的治疗

CRC细胞系HROC40、HROC60 HROC69(所有三个微卫星稳定)在我们的实验室建立了病人后续操作和分析段落25 - 35。细胞保持完整的媒介:与10%胎牛血清的DMEM / HamsF12补充谷氨酰胺(2更易/ L)和抗生素(媒介购买的PAA和补品,Colbe,德国)。细胞被播种在适当的密度为每个细胞株96 -好或24-well板块和孵化24小时之前TLR配体治疗。对所有在体外实验中,下面的TLR配体浓度及其组合用于0.01,0.1,1,10μM:紫杉醇,R848(德国)勒拉赫市的恩佐生命科学,有限合伙人(Sigma-Aldrich,汉堡,德国)和聚我:C (InvivoGen、圣地亚哥、钙、美国)。所有物质都应用一次。Antitumoral效果检查后24、48和72 h的孵化。

2.2。RNA隔离,互补脱氧核糖核酸合成、和定量实时PCR

从肿瘤细胞总RNA是孤立与试剂盒试剂根据制造商的指示。RNA是reverse-transcribed cDNA从2μ使用高容量cDNA g RNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。目标互补脱氧核糖核酸水平的人类细胞系被使用TaqMan普遍PCR定量实时PCR分析混合和预先设计大师TaqMan基因表达分析,Hs00152933_m1 (TLR3) Hs00152939_m1 (TLR4) Hs00152971_m1 (TLR7) Hs00152972_m1 (TLR8) Hs00152973_m1 (TLR9识别),和Hs99999905_m1 (GAPDH,管家基因控制)在7000年ABI棱镜序列检测系统(应用生物系统公司)。PCR条件如下:95°C 10分钟,40 15秒的周期在95°C,和1分钟60°C。TLR表达的小鼠CRC细胞系CT26分析使用SibirRoxHot大师混合(Bioron,路德维希港,德国)。目标基因的mRNA水平GAPDH规范化。引物对用于实时PCR是以下:TLR3 5′-GGTCCCCAGCCTTCAAAGAC-3′, 5′-ACGAAGAGGGCGGAAAGGT-3′, 5′TLR4 -ACCTGGCTGGTTTACACGTC-3′, 5′-CTGCCAGAGACATTGCAGAA-3′, 5′TLR7 -CCACAGGCTCACCCATACTTC-3′, 5′-GGGATGTCCTAGGTGGTGACA-3′, 5′GAPDH -CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′, 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3′。反应进行了一式三份井。每个样本的一般表达水平被认为是通过计算)。表达模式划分为强,温和,低或缺席相比正常的免疫细胞(即。树突细胞,人类和小鼠巨噬细胞)。这些细胞在每个存在作为标准和质量控制。

2.3。MTS和流量仪细胞生存能力分析

实验在96 -孔板进行了一式三份和复制至少三次。MTS (Promega,曼海姆,德国)和经前综合症(Sigma-Aldrich)和20μL这个混合添加到每个。孵化后的细胞在37°C至少1 h,吸光度测量在492 nm LP400 ELISA读者(Anthos Mikrosysteme, Krefeld,德国)。toll样受体——配基直接影响肿瘤细胞生存能力是另外流式细胞术的特征。细胞治疗如上所述。所有细胞(浮在表面的附着+细胞)收获和沾2μM Calcein-AM(西格玛奥德里奇)。荧光微球珠(1.4×10⁵珠子/毫升,Polysciences,德国)被添加到样品在200年最后一卷μl一套门在FSC / SSC珠子,和所有活细胞(Calcein-AM积极)每5.000珠子被数。实验在24-well板块进行复制和复制至少四次。细胞增殖/可行的百分比和总数量的计算与未经处理的控制细胞相比,也就是说,没有TLR配体应用程序。分析了样品在FACSCalibur血细胞计数器(BD Pharmingen)。数据分析使用CellQuest软件(BD Pharmingen)。

2.4。淋巴细胞和Coculture实验做准备

外周血淋巴细胞(PBL)是获得健康的志愿者后聚蔗糖密度梯度离心分离。免疫细胞的细胞毒性由TLR ligand-stimulated了CRC细胞系直接coculture实验。肿瘤细胞被播种在重复24-well板块(1×10⁴一夜之间/)和孵化。介质被包含人外周血和新鲜培养基(1×10⁶PBL /好,比1:100)有或没有TLR配体是补充道。后48 h或72 h潜伏期,人外周血被删除,而肿瘤细胞被胰蛋白酶化收获。流式细胞仪分析之前,荧光微球珠(1.4×10⁵珠子/毫升,Polysciences,德国)被添加到样品在200年最后一卷μl .一门放置在肿瘤细胞在FSC / SSC排除淋巴细胞。第二个门是FSC / SSC珠子,每5.000珠子和所有活着的肿瘤细胞。一个代表性的情节在图给出4 (c)。数据给出X-fold数量与人外周血肿瘤细胞比未经处理的控制。另一个控制由肿瘤细胞没有PBL之外。

2.5。流仪PBL的表现型

人类人外周血的表型分析,像之前描述的那样TLR配体刺激后细胞收获(72 h)。控制在完全培养基没有任何TLR配体孵化。细胞被洗了,直接沾FITC - PE -,或APC-labeled马伯CD3, CD4, CD8, CD16/56, CD25、CD62L CD69、CD71(每个1μ德国g, ImmunoTools, Friesoythe) 30分钟在4°C。然后,细胞被洗两次,200年resuspendedμL PBS。负控制沾适当的同形像。细胞流式细胞仪分析了如上所述。对于每一个样本,测量20.000事件。为了克服单一捐赠者个人间差异,数据未经处理的控制人外周血被设置为1,数据TLR配体刺激细胞作为X-fold增加。

2.6。在活的有机体内肿瘤模型和治疗方案

实验进行女性8-10-week-old Balb / c小鼠称重18 - 20 g。老鼠繁殖在大学指定的无菌条件下动物设施和维护。所有的动物喂养标准实验室食物和免费的水。实验按照德国动物保护立法和指导护理和使用实验动物(研究所实验动物资源,国家研究委员会;国家卫生研究院的指导,25卷,不。28,1996)。肿瘤的挑战是由皮下注射(南)的5×10⁶CT26细胞进入右后腿。肿瘤的生长总是控制至少每周两次和肿瘤体积估计根据公式:。建立肿瘤后,实验组小鼠分为(每组)每个处理以下物质/组合之一:紫杉醇(20毫克/公斤体重),R848(60毫克/公斤体重),有限合伙人(2毫克/公斤体重),伊立替康(20毫克/公斤体重),紫杉醇+ R848,紫杉醇+ LPS, R848 +有限合伙人。治疗进行每周两次总共三个星期。控制,tumor-carrying老鼠收到等价的PBS(生理盐水,)。Tumor-carrying老鼠(治疗、控制)是牺牲在天21或当他们变得奄奄一息的肿瘤体积达到2.000毫米³。血液采集标本10天的治疗。在每个实验,血液样本,肿瘤物质,脾脏和肠系膜淋巴结清除所有动物进行进一步分析。

2.7。流式细胞术的血和脾细胞

流式细胞术进行治疗期间及之后与外周血白细胞使用以下异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白——(PE)共轭鼠anti-mouse单克隆抗体(mab): CD3εFITC CD62L PE (1μg, ImmunoTools), CD11b FITC, CD11c FITC, CD19 FITC, CD4 PE、CD8 PE、Gr1一起PE (1μBergisch-Gladbach g, Miltenyi研究,德国),存在体育(1μg eBiosciences,法兰克福,德国)其次是溶解的红细胞(流式细胞仪赖氨酸溶液,BD Pharmingen)。消极的控制由淋巴细胞染色与适当的同形像(BD Pharmingen)。样本分析如上所述。

2.8。统计分析

所有值表示为均值±SE在体外数据和均值±SEM对肿瘤的生长数据。证明的假设常态后,控制和实验样本之间的差异取决于使用未配对的学生的t以及。如果正常失败,非参数Mann-Whitney以及应用。执行的测试是通过使用Sigma-Stat 3.0 (Jandel公司,圣拉斐尔、钙、美国)。意义被设定的标准。

3所示。结果

3.1。TLR表情CRC细胞系

作为起点在这项研究中,分析了通常的表达qPCR一组ultra-low-passage CRC细胞系建立在我们的实验室。据TLR配体为随后的功能分析,选择TLR3(多聚肌苷酸),TLR4(有限合伙人,紫杉醇)TLR7, TLR8 (R848)(检查表1)。TLR8并不表示,TLR7是在低水平表达的细胞株;TLR4显示,HROC40温和的表情,HROC60, HROC69细胞相比,DCs的表达模式。同样,TLR3表达不同的细胞之间。

3.2。直接影响CRC TLR配体的细胞

TLR的评价直接影响配体R848,有限合伙人,保利我:C和紫杉醇CRC细胞,三个主要的肿瘤细胞系HROC40, HROC60,和HROC69处理浓度增加,从0.01μ米到10μ执行m .读出后24、48和72小时使用一个标准的MTS试验。在每个实验,在每一个给定的时间点,未经处理的细胞作为控制。

TLR7/8配体(R848), TLR4(有限合伙人),TLR3(多聚肌苷酸)对没有明显的抗增殖作用(数据没有显示和模范R848 72小时后的结果图1(一))。紫杉醇是唯一的细胞生长抑制药物(图1 (b));然而,HROC40 HROC69显示近完整阻力但最高剂量(10μ米),紫杉醇抑制HROC60细胞> 50%的增长。代谢活动是由一个MTS试验,通常倾向于减少时间和剂量依赖性的方式(图1 (c))。

为了证明这些数据,数量和CRC细胞的可行性进行了分析TLR配体治疗后流仪测定。原则上,这个测试中的MTS数据证实紫杉醇是唯一TLR配体测试直接antitumoral潜力。再一次,一个明确的时间和剂量依赖观察相比,未经处理的控制细胞(图1 (d))。Antitumoral效果更明显相比MTS化验的结果。这里,紫杉醇不仅对HROC60施加影响,而且对所有三种细胞系(图进行测试1 (e))。

分析如果任何合作的TLR配体直接antitumoral影响可以观察到,所有可能的组合物质测试的最低浓度(0.01μ米)。读出再次由流式细胞术测定活细胞的比例相比,未经处理的控制。紫杉醇的antitumoral效应对HROC69和HROC60略增加任何额外的物质(数字2(一个)和2 (b))。但是,没有增加可以观察到的细胞系HROC40(图2 (c))。孵化与三个或四个物质没有显示出这种效果(图的进一步增强2)。类似于单代理,结果没有一个组合没有紫杉醇施加任何antitumoral影响肿瘤细胞系(图2)。

3.3。免疫刺激TLR配体

TLR配体起到直接的免疫刺激作用。进一步阐明他们对人外周血的影响在我们的设置中,我们进行了一系列在体外实验。人外周血要么是刺激与单一物质(浓度)或其组合(每个0.01μ米)。正如所料,TLR配体直接刺激免疫细胞。在细节,效果观察R848最为显著。这种物质激活免疫细胞在剂量依赖性的方式(图3(一个),上半部分)。CD25的数量⁺和CD69⁺激活细胞增加TLR刺激(图3(一个))。同样,CD16的比例⁺CD56⁺是升高(图3 (b))。因此,NK细胞被确定为主要反应的细胞群。多聚肌苷酸和紫杉醇施加较弱但仍刺激效果,然而,只有在浓度较低的情况下。相比之下,对人外周血LPS-mediated影响可能很大程度上被忽视了。在分析TLR配体组合,没有观察免疫刺激的进一步推动。

3.4。增强TLR配体介导的在体外由淋巴细胞的影响

上述结果证明没有TLR配体R848的影响,有限合伙人和保利我:C,但强烈的紫杉醇对CRC细胞的影响。自主要antitumoral TLR配体的影响可能会基于免疫刺激,我们接下来分析TLR-stimulated免疫细胞对CRC细胞株的影响。后者与PBL coincubated(肿瘤细胞比100:1,PBL)从五个健康志愿者的TLR配体(0.01μM−10μ米)。肿瘤细胞单独和与PBL作为控制。

48和72 h孵化后,肿瘤细胞生存的数字使用流式细胞仪测定。的两个捐赠者的PBL显示强烈反应的CRC细胞株即使没有通常必须视为alloreactivity。因此,这些被排除在进一步分析。此外,实验的结果没有PBL除了给出简化可比性(图4)。

活化的免疫细胞对HROC69 R848导致强烈的细胞毒性(76% - -93%杀死与控制(肿瘤细胞+ PBL);图4(一))。在这种背景下,一个强大的剂量依赖性与有利的影响可以观察到更高的浓度(数据未显示)。CRC细胞系HROC60适度受到R848而HROC40没有显示出对免疫介导antitumoral效果。TLR配体LPS施加不影响肿瘤细胞在这个coculture实验。多聚肌苷酸治疗导致细胞数量减少与PBL和HROC69孵化时(与控制:肿瘤细胞+ PBL)。有趣的是,除了所学化学治疗剂的存在肿瘤细胞紫杉醇介导强劲oncopathic效果(图4(一))。幸存的肿瘤细胞的数量下降到5%相比控制(肿瘤细胞+ PBL),因此这coculture设置甚至增强了强烈的细胞毒性作用通过单一疗法(相比之下,请见图1 (d))。

综上所述,这些数据显示高架antitumoral TLR配体由于免疫细胞的刺激作用。然而,tumor-cell-specific脆弱性差异对免疫介导的细胞溶解是事情。紫杉醇是唯一的物质导致明显的水平所有细胞系的细胞数量减少。

接下来,TLR配体的组合被添加到肿瘤和免疫细胞。识别潜在的协同效应,所有可能的TLR配体组合被认为(每个TLR配体浓度:0.01μ米)。模范结果图4 (b)。在此设置,大部分紫杉醇/聚我后取得了明显效果:C治疗,然而,与紫杉醇单药治疗。因此,TLR-combinations没有增强免疫介导性瘤细胞溶解。相比之下,一些组合甚至倾向于抑制抗肿瘤反应(例如,R848 +聚我:C)。

3.5。TLR配体对CRC肿瘤生长的影响在活的有机体内

最后证明CRC antitumoral TLR配体的影响,一个在活的有机体内实验使用的执行CT26肿瘤模型。在体外,这鼠CRC细胞系是敏感对紫杉醇但没有其他TLR配体用于这项研究(数据未显示)。

当肿瘤达到50 - 100毫米³进行实验治疗,两周一次的ip的应用紫杉醇,R848,有限合伙人或TLR组合(图5)。为了更好地评价TLR-mediated增长抑制在这个模型中,一群动物的拓扑异构酶抑制剂伊立替康治疗,临床批准药物治疗CRC患者的标准。单独控制老鼠收到同等体积的溶剂(生理盐水)。

所有治疗协议,除了两(多聚肌苷酸和紫杉醇+ LPS)的结合,介导至少轻微抑制增长。R848潜力最强antitumoral TLR内配体单一疗法组(紫杉醇>有限合伙人相比,与控制)。多聚肌苷酸表现出意外,而是一个非常强大的肿瘤生长促进活动和动物要救赎苦难的第七天治疗。最强的antitumoral效果得到紫杉醇和R848疗法。这种组合是更好比伊立替康在控制肿瘤的生长。的组合R848 + LPS稍微阻止肿瘤的生长。但是,没有添加剂或协同效应可以获得比单一的有限合伙人或紫杉醇治疗。

3.6。相关的免疫状态与肿瘤的生长

最后,参与免疫系统在肿瘤的生长控制在活的有机体内是检查。治疗和控制动物的血液样本进行了分析后第十天开始治疗(图6(一)),在治疗完成(图十七天6 (b))。此外,潜在的激活脾脏的免疫细胞治疗动物进行了研究(图6 (c))。

所有的治疗方案介导免疫的重大变化,除了大规模增加激活循环存在⁺免疫细胞(ALCAM)伴随着CD62L水平下降(L-selectin)细胞。尤其是存在的重要海拔⁺血液中的细胞可以观察到10 d后与伊立替康治疗(= 0032)和R848 +有限合伙人(= 0035)以及有限合伙人(= 0004)在脾脏17天。此外,CD62L海拔达到意义在17天治疗组的脾脏R848 +紫杉醇(= 0002)和紫杉醇+有限合伙人(= 0038)。这两个标记表明t细胞活化。L-selectin,蛋白水解细胞表面分子的乳沟上的差别(= L-selectin脱落)或对这些基因的mRNA水平可能解释这种观察最好。有趣的是,这一发现与antitumoral在活的有机体内结果,表明这些细胞群参与肿瘤的生长控制。

然而,我们没有观察到任何其他的免疫刺激作用在给定的时间点。

4所示。讨论

近年来,对抗肿瘤的旧概念与微生物的代理重新点燃了我们和其他人15- - - - - -20.]。这个想法是诱导肿瘤回归直接溶癌作用和间接通过免疫刺激。进一步发展的方法,我们在这里探讨TLR配体定义为治疗药物的潜力。因此,我们选择配体为TLR3(多聚肌苷酸),TLR4(有限合伙人,紫杉醇),TLR7, TLR8 (R848)。那些TLR配体进行了广泛的临床调查,临床调查。然而,大多数研究集中在这些分子和他们的应用程序作为佐剂的免疫刺激性能力以及肿瘤和病毒疫苗(21- - - - - -23]。从力学上看,TLR配体施加antitumoral效果通过激活多种细胞类型,包括DCs和T细胞(24,25]。由于他们应该直接antitumoral潜力,TLR配体现在测试作为免疫治疗药物(26]。

首先,有关toll样受体的表达进行了分析在我们刚建立,ultra-low-passage CRC肿瘤细胞系。尽管表达模式之间的不同细胞系,四分之三的受体检测(TLR3、4和7)。正如所料,表达水平相对较低(即。,而免疫细胞)。通过使用细胞系在低段(< 40),大多数保留原发肿瘤细胞的特征。在这些不同的TLR模式被发现不仅在正常和肿瘤细胞在肿瘤(如upregulation TLR3/4),但也在一个肿瘤(27]。然而,这意味着一个重要尽管澄清的作用,通常在CRC生物学。其中,TLR表达式是特殊的,因为结肠细菌不断受到细菌抗原和生活。有一线之隔的生理体内平衡共生的植物和慢性炎症的刺激肿瘤的生长条件下28]。

来阐明TLR激活的直接影响,主要CRC细胞在这里处理各自的TLR配体。这些都是作为单药应用或组合(i)模拟整个细菌/病毒和(2)分析如果任何antitumoral合作行动。没有了物质介导的显著增长抑制或单药或肿瘤细胞凋亡/ necrosis-neither combination-some甚至倾向于促进肿瘤增长(例如,R848 +有限合伙人;数据1和2)。唯一的例外是紫杉醇,TLR4的广泛使用的化疗药物,另外结合。这一发现是有趣,因为TLR4的表达通常与药物抗性和转移(29日]。虽然我们也观察到个人间的差异,所有的细胞系回应这种药物(图1)。Antitumoral效果略增强通过添加另一个TLR配体(图2)。然而,组合没有紫杉醇抑制不协调增长。这个观察从文学与最近的数据。新兴证据表明TLR配体的双重角色,他们同时触发的赞成和antitumoral效果取决于应用分子(7,12,13,30.]。在多发性骨髓瘤细胞,诱导自分泌白细胞介素- 6 / -18生产占增强扩散对TLR激活(30.,31日]。奥利里和同事甚至描述增加转移性结肠癌细胞的潜力在LPS刺激通过Nox1-mediated氧化还原信号(32]。相比之下,flagellin-induced TLR5激活介导肿瘤回归(33]。

尽管他们冲突的直接作用于肿瘤细胞,TLR配体,在大多数情况下,强有力的免疫刺激器。符合这种既成事实,我们观察了antitumoral效果的在体外coculture设置类似方面的主管免疫系统(图3)。影响是细胞系和物质specific-HROC40细胞通常倾向于比其他细胞系有更强的抵抗力。值得注意的是,R848和紫杉醇被证明是最有效的在刺激免疫介导的肿瘤细胞溶解,而有限合伙人和保利我:C没有工作在我们的手中。他们认为那些潜在的可能是不足以谈判肿瘤细胞的天然免疫抑制能力(34]。

TLR7/8活化剂R848是临床批准皮肤肿瘤的免疫治疗(35]。的病人,R848治疗诱发炎症巨噬细胞分泌的细胞因子和骨髓DCs以及干扰素-α释放血浆DCs (36]。额外的机制包括NK细胞的活化。此外,紫杉烷调解对肿瘤免疫刺激性影响,支持TLR配体肿瘤疫苗的想法。聚集在临床研究经验表明,紫杉醇增强NK -和淋巴因子激活的杀伤细胞功能(37]。观察到的溶瘤细胞的影响在本研究也很可能是由于激活NK或NK-like细胞,肿瘤的攻击可能是被广泛接受的38- - - - - -40]。

为了测试这个理论,免疫疗法与TLR配体进行同源的肿瘤模型。小鼠肿瘤细胞与小鼠CT26挑战收到重复注射TLR配体。应用程序和治疗间隔的路线已经被发现是一种有效的治疗计划的关键(36]。局部应用TLR配体通常是非常有效的,而他们的系统性应用会见了有限的成功41,42]。然而,对于潜在的CRC患者的临床应用,系统性,重复注射的方法选择。有了这个方案,我们观察到的至少部分肿瘤模型(图生长迟缓4)。值得注意的是,与R848单一疗法是有效的伊立替康,一线和二线标准治疗先进或复发crc (43]。这里使用的最佳组合是由紫杉醇和R848,抑制收益率> 50%增长。Antitumoral影响是伴随着大量增加激活循环存在的水平⁺免疫细胞,激活T细胞和单核细胞(图5)。这一发现是一致的在体外coculture结果对人类CRC和免疫细胞。基于这些在体外发现,更好的antitumoral结果可能会在人源化小鼠测试这种治疗方法时,由于通常是在老鼠和人类中表达的不同44]。这也是对我们人类和小鼠CRC细胞系。紫杉醇和R848如何行动的确切机制相互补充和加强antitumoral反应仍然是难以捉摸的。可以推测,紫杉醇主要直接抑制肿瘤生长通过干扰细胞周期。R848另一方面刺激免疫系统(主要是存在⁺细胞)。增加两个代理antitumoral免疫反应,最终控制肿瘤的生长。

一个相当意外发现当前研究的肿瘤促进活动的保利我:C和紫杉醇+ LPS的结合。这是明显的从一开始的治疗。肿瘤迅速增长,成为坏死,往往形成溃疡。最好在紫杉醇+有限合伙人的情况下,这可能是由于某种对立,在这两个物质争夺相同的TLR或胞内信号。另外,肿瘤或免疫细胞可能应对tumor-growth-promoting和免疫抑制细胞因子的分泌(例如,IL10) [45]。这些机制废除antitumoral单一物质的影响,加强肿瘤发展。

因此,TLR宽容,以免疫状态反应迟钝,可以放弃36]。此外,由于这是相反的在体外结果,我们只能推测培养的原因在活的有机体内肿瘤生长与这些药物组合治疗躺在特定的国际米兰和细胞内环境或可能部分归因于人类和老鼠通常之间的差异。

最后,尽管TLR配体是一线肿瘤治疗的关键,有许多观点赞成的免疫治疗应用:(i)单一物质或组合是理想的免疫刺激器:受体(尤其是DCs)和效应细胞(CD8⁺在功能上是激活T细胞和NK细胞);(2)结合抗原肽在技术上是容易执行;(3)通过增加Fc -增强抗体介入的细胞毒性γ受体的表达;因此用单克隆抗体治疗可能改善;(iv)和合成自然,他们可以生产的GMP条件下,事实上,大多数配体在临床上已经批准。

5。结论

本文提供的数据证明toll样受体激动剂的治疗潜力介导肿瘤抑制和激活免疫效应器。因此,他们非常有前途的候选人为优化免疫疗法,包括应用程序作为活跃的非特定的单一代理或组合疗法,辅助标准方案或除了细胞免疫疗法。我们的数据也关注toll样受体激动剂的另一面的性格,后来的研究将进一步阐明pro -之间的平衡和antitumoral活动toll样受体激动剂的单剂特别是组合。

缩写

出版广播公司:	外周血淋巴细胞
TLR:	toll样受体
儿童权利公约:	结直肠癌
DC:	树突细胞。

作者的贡献

Saskia金牛和克劳迪娅Maletzki同样这项工作。