文摘

BK多瘤病毒感染病毒相关肾病肾移植后的重要原因。BK病毒复活在30% -80%的肾移植受者导致BK病毒相关肾病在1% - -10%的病例。目前,在移植患者与无症状感染相关的分子过程BK病毒感染仍不明朗。在这项研究中,我们评估intrarenal BKV感染的分子过程在不同阶段。90年目标基因的基因表达谱已知与肾移植免疫反应评价活检材料使用TaqMan低密度数组。三个病人组:检查控制患者没有证据表明BK病毒复活(),无症状感染患者()和BK病毒肾病患者()。分析活检从无症状病毒尿病人导致5个差异表达基因的识别(CD3E,CD68,CCR2,ICAM-1,滑雪)(),功能分析显示显著加剧costimulatory信号(例如,CD40 / CD40L;)。基因本体论分析显示几个生物网络与BKV免疫控制与对照组相比。这项研究表明,无症状BK病毒尿与不同的多个基因intrarenal监管暗示在抗病毒免疫反应。

1。介绍

创新免疫抑制方案改善了病人肾移植存活率;然而,药物引起的免疫抑制也导致显著的并发症与感染有关。BK多瘤病毒(BKV)病毒相关的感染已成为一个重要的原因肾病肾移植后在现代免疫抑制治疗的时代1]。BKV可以恢复30% - -80%的肾移植受者但只有1% - -10%的情况下导致BKV肾病的发展(BKVN)与后续肾功能恶化和失败2- - - - - -5]。

最近,聚合酶链反应(PCR)已被用于常规监测外周血(BKV复制的5]。然而,PCR检测表明,多数肾移植受者BKV积极在尿液而不是血液,从不与移植肾功能恶化发展BKV肾病。此外,结果表明,患者无症状病毒尿了重大BKV病毒载量在肾移植活检标本6),暗示成功控制BKV感染宿主的免疫系统。

一般来说,先天免疫和特异性的效应机制代表对抗感染的第一道防线,紧随其后的是更具体的发展,获得性免疫反应。活跃的病毒复制的组织被认为是炎症的触发点,和细胞免疫建议在病毒控制起到至关重要的作用。最近,这是表明患者自限性BKV复活没有治疗干预发达BKV-specific T细胞和清除BKV迅速而患有BKV associated-nephropathy [7]。

然而,成功的过程BKV控制在分子层面上尚未完全描述。

在这项研究中,我们调查了intrarenal特定期间成绩单BKV感染肾移植的不同结果。

2。材料和方法

2.1。病人

基于BKV监测研究[8)和组织病理学临床和实验医学研究所的档案,布拉格,不同患者群体建立了如下。(我)无症状病毒尿组(AV) ()提出了BK病毒尿负荷高于10⁷/毫升(9)协议当天活检(移植后3个月)。这些病人不发达BKV-associated肾病,不利于BKV复制筛选在尿液和血液移植后12个月。协议肾脏移植活组织检查显示正常发现免费的排斥和患者移植肾功能稳定。(2)对照组(NCG) ()由患者BKV阳性的尿和肾移植后血清中在任何时间点。没有一个病人表现出同种异体移植物排斥反应;协议活检f移植肾功能正常患者稳定。(3)BK病毒肾病(BKVN)集团由患者(与BKV-associated肾病)。八个患者伴有BKV-associated肾病研究开始之前和归档活检标本进行分子生物学被用于分析。在2例,BKV-associated肾病发展过程中研究。组织学证实BKV-associated肾病被定义为检测病毒细胞病理变化与在细胞核内的包涵体,肾小管上皮细胞损伤有关,包括管状上皮细胞坏死、剥蚀的基底膜,以及积极的免疫组织化学染色的SV40 T抗原。病人的临床和人口统计变量在桌子上1。

移植后3个月,所有患者肾移植活检是在协议组I和II和活检标本的一部分固定的分子生物学分析在稍后的日期。研究伦理委员会批准的协议是在布拉格的临床和实验医学研究所和书面知情同意是获得所有的病人。

2.2。RNA隔离和TaqMan低密度阵列(TLDA)

皮质的一小部分(~ 2毫米)或从活检标本juxtamedullary区立即存储在RNA后(Ambion公司、奥斯汀、TX)。肾组织均质;使用StrataPrep总RNA提取总RNA Microprep工具包(美国Stratagene拉霍亚,CA)和反向转录成互补DNA(互补)所描述的其他地方10]。

90个候选基因的基因表达谱目标扮演着角色引出的免疫反应(如细胞因子的基因表达,costimulatory分子,生长因子,趋化因子,免疫调节,细胞凋亡标记,和缺血标记)确定使用实时rt - pcr (),GAPDH内部控制和互补控制肾脏作为校准器30肾活检标本分析。表中描述的所有评估基因是S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/972102。每个免疫TLDA概要文件包含冻干基因表达试剂(引物和探针标记(FAM)预配置384格式。分析了两个样品一式两份/卡。每一个装运港充满了100μL cDNA、核酸酶游离水,2 x TaqMan普遍PCR掌握混合。离心后,卡片是用TLDA封口机密封(应用生物系统公司,培育城市,CA),以防止交叉污染。rt - pcr扩增进行使用ABI棱镜7900高强度序列检测系统(应用生物系统公司)。②TLDA卡分析相对量化和RQ经理1.2。使用自动化的数据分析软件(应用生物系统公司)。

2.3。统计和分析功能

提出了连续变量均值±SD(标准差)。统计分析的分类特征进行使用测试中,使用学生的连续参数和非参数变量以及和Mann-Whitney测试。Bonferroni调整是在适当的时候使用。使用兆电子伏(执行监督层次聚类)软件以可视化的结果。使用Mann-Whitney基因表达数据进行比较其次是Bonferroni调整测试。

对功能分析,大规模数据管理是用来识别特定的转录模式。在一组分析中,基因分为集由他们的注释,然后定义组之间相比。的功能分析,两种类型的分析。因为数量有限的基因进行了评估,完全耦合的通量分析,反映了分析路径片段作为第一组分析(11]。完全耦合的通量是一个基因网络,对应于一个反应通路中零通量意味着零通量第二反应,反之亦然。这个通量表示定性连接性最强的,可以确定在一个网络。酶耦合的通量的基因被证明有相似的表达模式,分享转录监管机构,经常驻留在相同的操纵子。第二组基因型分析包括基因共享一个共同的基因本体论(12]。使用功能分析,基因表达数据日志转换和比较组之间单向方差分析(方差分析),其次是Bonferroni调整适当占多重比较。使用XGENE集合级别进行了分析。ORG (13,14]。

3所示。结果

3.1。基因表达谱

我们首先确定90个候选目标记录确定不同水平组之间的表达式。使用这些标准,群患者无症状病毒尿和建立了负对照组;我们还研究了存档活检病理组织切片证实患者BKV-associated肾病。

使用层次聚类,不同的基因转录谱确定了学习小组。层次聚类证明基因转录谱表达在肾移植患者的组织不是测试BKV正类似于配置文件中观察到无症状患者BKV病毒尿不存在BKV积极血液样本或BKV-associated肾病。然而,基因转录谱确定BKV-associated肾病患者形成一个集群(图明显不同1)。

3.2。表征Intrarenal基因转录谱无症状患者BK病毒尿

为了识别的本质intrarenal BKV感染的免疫机制与控制,intrarenal贪污成绩单从患者无症状病毒尿或负对照组病人进行了分析。五个差异表达基因被确定,包括upregulation T细胞(CD3E)和巨噬细胞(CD68)标记,除了基因编码的受体单核细胞化学引诱物蛋白1 (CCR2;趋化因子,特别是介导单核细胞趋化性)和粘附分子,ICAM-1。的滑雪的差别protooncogene,参与对这些TGF -β1基因转录,在无症状显著下调BKV感染组()(表2)。

功能分析显示,患者无症状病毒尿表现出明显高于costimulatory信号CD40 / CD40L的表达水平()比阴性对照组。此外,群体的基因共享一个通用的本体进行了分析,显示几个生物网络参与BKV免疫控制。这些网络主要涉及与B细胞增殖(BCL2, CD40、CD40L IL10),T细胞增殖(CD28、CD3E IL12A、IL4 PTPRC)、跨膜受体酪氨酸激酶通路(CD4、CD8A FN1)、蛋白水解作用(ACE、ECE1 GZMB,英国网球协会,任),蛋白激酶绑定(CD3E、CD4 PTPRC)、凋亡过程(BCL2、BCL2L CCL2, CD40L、FAS IL10 IL1A)和白细胞粘附(CD40L、ICAM1)(表3)。

3.3。识别Intrarenal基因的转录与BKV-Associated肾病有关

BKVN组显示33/90微分调节的基因分析。最不同的调节基因CCL2,CCL5,CCR2,CD4,CD68,FASL,gn,IL1B,IL2RA,IL8,PRF1,PTPRC,和肿瘤坏死因子(所有阴性对照组相比)。这些基因主要参与T细胞信号,趋化作用,活化和细胞毒性(表4)。

功能分析显示,患者BKVN有显著较高的表达水平的通量FASL / FAS(),CD28,CD80,CD86(),与细胞凋亡相关的信号分子,和聚集有关。此外,广泛的分子网络被证明有一个相同的本体,即基因与NF -积极的调节有关κB转录和细胞内的信号转导肿瘤坏死因子,TGFB1)、趋化性(CCL3、CCL5 IL18、IL1B IL8, VEGF),激活MAPK活动(IKBKB TGFB1, TNF),负调节病毒基因组复制(CD80、IL8)。ontology-related与BKV-associated肾病相关的基因的详细描述是列在表中5。

4所示。讨论

多瘤BK病毒相关肾病代表了一个最具挑战性的传染性与肾移植相关并发症(15]。

更好的理解与免疫相关的分子过程控制BKV感染可能促进临床管理的改进策略16]。本研究评估BKV尿液样本中进行盲评;因此任何更改在临床管理进行了基于结果(8),因为它会影响转录表达谱在活检收集移植后3个月。我们所知,这是第一个分子研究在这样的病人队列。这一分析表明,有效的BKV控制移植后3个月与基因表达谱的潜在影响细胞免疫反应,包括B和T细胞信号和抗凋亡基因网络而BKV-associated肾病年末,深刻的基因upregulation覆盖T细胞信号网络,chemoattraction,激活,细胞毒性以及许多其他炎症网络被检测到。

具体来说,5基因可能与成功控制病毒复制中被确认。高度的T细胞(CD3E)、单核巨噬细胞(CD68),他们的化学引诱物趋化因子CCR2(以及粘附分子的存在ICAM-1)被描述。先前的研究已经发现这些分子与病毒感染有关17,18]。

大致知道T细胞扩张和细胞因子的生产需要的生成有效的抗病毒免疫反应(19]。CD8⁺细胞毒性T细胞分泌移行细胞(IFN -γ)或/和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)是重要的组件在中介对病毒感染宿主免疫力和已被证明在BKV间隙(扮演关键角色17]。然而,在我们的研究中,表达的模式干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在无症状的病毒尿只是边际(),可能反映了只是一个有限的免疫损伤的负担。CD8⁺T淋巴细胞激活是严格监管,尤其是在初级反应后引起积极的和消极的聚集有关(BKV感染后20.,21]。在我们的研究中,分子与聚集有关都调节肾组织无症状的病毒尿患者以及患者的活检证实BKV-associated肾病。因此,为了进一步确定附加与防止BKV感染相关的基因,我们的研究数据进一步分析了进行功能分析。因为低数量的基因进行评估的数量相比,可以分析基因微阵列分析后,我们我们的研究集中于描述较小的交互性和功能单元使用一个基因本体论方法和网络流量,对应于一个通路的一部分。

通量CD40 / CD40L costimulatory信号显著调节患者的活检成功控制BKV感染,出现无症状病毒尿。众所周知,激活CD40表达CD40L在结扎后抗原呈递细胞(CD4细胞⁺T淋巴细胞)有助于根除促炎反应所需的特定类型的病原体引起的感染(22]。研究关注于定义细胞免疫反应的潜在控制BKV复制确定大多数BKV-specific T细胞表达CD40L (CD154) [23]。

发现的基因目标基因本体分析鉴定基因通常与引出特定于病毒感染的免疫反应B细胞和T细胞功能之间的相互作用和有效的细胞增殖是一个基本的保护策略。

激活的细胞机制,以应对BKV感染是一个损伤修复免疫反应与纤维化发展结果(9]。在最近的研究中,患者无症状病毒尿(从不发达BKV-associated肾病)提供3年的移植肾功能正常跟踪。这意味着成功的免疫控制病毒感染可能与有限或瞬态相关细胞因子相比upregulation BKV-associated肾病损伤启动纤维化发展的负担。

目前,有限信息的分子过程与BKV-associated肾病有关。大量的upregulation基因参与细胞周期和增殖了在体外在初选BKV感染肾脏上皮细胞表明刺激BKV蛋白质的性质(24]。基因调节的体内,分析肾移植受BKV-associated肾病确定促炎基因(CD8及相关分子与贪污有关纤维化)类似于剖面观察在例急性排斥反应;然而,表达水平的大小(25]。在我们的研究中,intraparenchymal upregulation 33基因在BKV-associated肾病,确认以前的结果(25),以及展示类似的表达谱中观察到急性排斥反应(25- - - - - -27]。此外,使用功能分析方法,另一个50生物过程被描述在肾脏受到BKV-associated肾病的影响。使用层次聚类,基因表达在BKV-associated肾病形成明显不同。

在这项研究中,定量PCR分析。芯片分析相比,这种技术是快速和定量,结果更可靠。更具体的研究工具与BKV感染相关的特异性免疫反应有关酶联免疫斑点和多参数流式细胞术分析将包括(7,17,28,29日]。

5。结论

总之,这项研究表明无症状BKV病毒尿反映出成功的病毒感染与免疫系统控制特定基因转录和免疫过程,专门记录与B淋巴细胞信号和聚集有关。此外,相关的免疫反应的程度要高得多与BKV-associated肾病患者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

伦理批准

多中心伦理委员会的Thomayer医院和临床和实验医学研究所,布拉格,批准了研究方案。

确认

作者要感谢f . Zelezny和m . Holec帮助使用X-gene平台与数据分析。此外,作者的病人和护士的合作和帮助。这项工作从内部获得一笔赠款资助机构从卫生部(NS / 9714/2008 00023001)和制度支持和MZO 00023001。

补充材料