基于HIV多表位和p24蛋白的rDNA和rFPV联合疫苗对中国恒河猴SHIV-KB9感染的保护

摘要

开发有效的艾滋病毒疫苗仍然是一个紧迫的目标。我们使用DNA启动/鸡痘病毒增强方案来免疫中国恒河猴。肌肉注射致病性分子克隆SHIV-KB9。通过测定IFN-来研究疫苗的免疫原性和保护效果检测hiv特异性结合抗体，检测病毒载量，分析CD4/CD8比值。结果表明，疫苗组在受到攻击后，可诱导机体产生较强的免疫应答，表现为IFN-表达增加，抗体生成缓慢稳定升高，急性病毒载量峰值降低，CD4/CD8平均比值升高。目前的研究表明，快速的反应速度、适当的反应强度和持久的免疫反应时间可能是艾滋病疫苗的关键保护因素。本研究对艾滋病疫苗和临床前研究具有重要意义。

1.介绍

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原。自从1981年洛杉矶报道首例HIV-1感染病例以来[1]，超过6800万人被全世界艾滋病毒感染了。近2500万人死亡，根据联合国艾滋病毒/艾滋病计划（联合）艾滋病毒/艾滋病计划[）的全球报告，约有3330万人患有2009年底的艾滋病毒[2］．由于缺乏有效的预防或治疗方法，艾滋病/艾滋病毒仍然是现代最致命的危机和最大的社会、经济和公共卫生挑战[3.-9.］．

毫无疑问，根除或控制HIV-1扩散的最佳和最经济的解决方案是开发安全有效的疫苗。虽然已经致力于实现这一目标的大量努力，但尚未证明可用疫苗的成功[3.那4.那10那11］．以前的研究已经确定了HIV特定的CD8⁺细胞毒性t细胞反应在控制病毒复制中发挥关键作用，这可以减少病毒载量并延缓HIV-1感染个体的疾病进展[12-16］．具有多价抗原的免疫可能可能刺激更有效的免疫，而是如前述研究中所述的单一抗原[12那17］．因此，组合来自HIV-1的不同基因的多CTL表位构建嵌合抗原可能是开发新疫苗的更好的策略。以前，我们设计并构建了一种新的免疫原性，其包括29个多功能孔和HIV-1的P24蛋白作为载体分子。所选表位涵盖了来自艾滋病毒的结构，调节和辅助蛋白质的最多显性表位，例如GAG，ENV，POL，RT，IN，VPR，TAT和NEF;也考虑了HLA-DR表位，ER信号肽和Kozak序列。在体外和体内评估抗原性和免疫原性[18-20.］．

为了进一步证实该疫苗的免疫原性和保护作用，我们采用DNA启动/鸡痘病毒增强方案免疫中国恒河猴。这些动物被静脉注射致病性分子克隆SHIV-KB9。通过测量猴子的IFN-来监测它们γ通过分析疫苗的免疫原性和保护作用，促进临床试验。

2.材料和方法

2．1.动物

中国原产恒河猴（章RH），3-5岁，女性和男性，并没有临床疾病的迹象，是由实验动物中心，中国人民解放军军事医学科学院提供。Sixteen Chinese rhesus macaques from Guangxi, aged 3–5 years, weighing 3–5 kg, and without simian immunodeficiency virus (SIV), monkey T lymphocytes of I virus (STLV), monkey ART D-type virus (SRV/D), or B virus infection, were bred and provided by the experimental Animal Center of Military Medical Sciences. The present research project was approved by the relevant ethics review committee. Animal husbandry and sample collection were in accordance with relevant biosecurity requirements.

2.2。疫苗

在目前的研究中使用的疫苗是重组DNA疫苗的rDNA / pVMp24和重组禽痘病毒重组鸡痘/ MP24。两者都是含有相同的免疫原，其包括Kozak翻译起始序列，ER信号肽，29个HIV优势表位（24 CTL或CD8 T细胞表位和5个B细胞表位），和HIV-1的p24蛋白的基于表位的疫苗．免疫原被军事兽医研究所教授金宁金，中国人民解放军军事医学科学院提供。的rDNA和重组鸡痘病毒疫苗构建体的示意图示于图1．

2.3。免疫和挑战实验

将中国恒河猴随机分为2组，每组4只。每组肌内注射rDNA/pVMp24 (500μg/每只动物)接种疫苗和空载体pVAX1对照，随后注射10周^9.斑块形成单位(PFU) rFPV/Mp24疫苗和野生型FPV在第18周。在第28周，对猕猴进行静脉注射20个MID_50.由中国疾病预防控制中心邵一鸣教授提供。

免疫接种计划和给药途径见图2．

2.4。样品收集和处理

在EDTA抗凝血剂存在下，在7,13,21,28和35d发射中收集后肢静脉血液。将样品在6小时内送到实验室。为血液常规检查和流动分析处理了一部分未忽略的血液。将剩余的样品以1700rpm离心并在室温下保持10分钟。分析了病毒RNA负载和抗体的血浆。将PBMC与酶联免疫活动（ELISPOT）和其他分析分离。将血浆储存在-20℃，PBMC在液氮中冷冻。

2．5．干扰素-γELISPOT检测

进行ELISPOT测定以评估γ干扰素 - （IFN-γ-)分泌细胞。如前所述，通过Ficoll梯度离心分离pbmc [21］．用猴子进行检测ELISPOT应答IFN-γγ根据制造商的说明，ELISPOT工具包（Utrecht，荷兰乌得勒支）。通过加入单一的P24肽（15-MER HIV-1共有P24肽，用11-氨基酸重叠的15-MER HIV-1共有P24肽，由China浓度为4. μ每种肽的g / ml。PMA（50ng / ml）和离子霉素（1 μ克/毫升）用作阳性对照，而RPMI 1640培养基作为阴性对照。结果被表示为斑点形成细胞（SFC）/百万个PBMC。阳性反应被定义为4倍ELISPOT指向高于阴性对照百分点和大于50 SFC / 10^6.每个时间点的单元格。

2.6。血清中hiv -1特异性结合抗体的检测

序列比对表明，HIV-1 p24与SHIV p24蛋白具有较强的同源性。因此，SHIV病毒诱导的抗体对HIV抗原有很强的交叉免疫反应。在本研究中，使用第三代总HIV结合抗体诊断试剂盒(Vironostika HIV Uni-Form II Plus O, BioMérieux Corporate, France)检测HIV-1特异性抗体应答。实验采用酶联免疫吸附法进行，实验依据厂商的方案和文献。

2.7。测量等离子体病毒RNA负载

血浆病毒RNA由Qiagen病毒RNA小尼基特（QIAGEN公司）提取，并通过使用Taqman EZ RT-PCR核心试剂盒（ABI公司）和ABI Prism 7700设备进行实时PCR分析。样品中的SHIV病毒RNA通过来自RNA标准的标准曲线量化。

2.8。CD3、CD4、CD8淋巴细胞亚群分析

我们使用三种非人类灵长类抗体FITC-CD3、PerCP-CD4和PE-CD8 (BD Pharmingen Inc.)进行流分析。每个流管包含5个μL和100μ我是全血的。建立淡色对照和CD3-、CD4-、cd8 -染色对照。内容物摇匀，室温避光孵育20 min。摇晃时，1 mL 1 x PBS溶于500μ加入L溶血素溶解红细胞。将混合物保存10分钟，直到液体变得半透明。随后，以1500 rpm离心5分钟。舍弃上清，振动使细胞分散。甲醛固定剂(300μL)，采用流式细胞仪(BD FACSCalibur)分析。

2.9。统计分析

学生分析了组之间的差异T.以及。结果用均数±标准差表示。值< 0.05被认为是显著的。

结果

3．1.elisa检测IFN-γ

ELISPOT方法用于确定IFN-γ-分泌由HIV-1 p24肽库刺激的t细胞免疫反应。与对照组动物相比，疫苗组免疫后产生较强的ELISPOT阳性反应，如图所示3.．rFPV增强免疫后2周(20 w)， ELISPOT反应显著增强，平均为437SFC/10^6.细胞。一个空载体也显示弱阳性反应，说明鸡痘病毒载体本身具有一定的非特异性t细胞应答。

在SHIV-KB9病毒攻击后，免疫基团中的所有动物显示出不同程度的ELISPOT阳性反应（峰值在115-890SFC / 10的范围内^6.细胞)。在感染后7天(29 w)， ELISPOT反应迅速增加，在感染后21天(31 w)， ELISPOT反应保持在适当水平。这些结果表明，本研究生产的疫苗具有良好的细胞记忆免疫应答。

３．２．血清特异性结合抗体的测定

感染后抗体分析结果见表1．对照组(A)在第35天(M1-M2)表现为弱阳性反应。M3在第28天和第35天表现出阳性反应，但抗体滴度没有增加。然而，疫苗组中所有动物的抗体滴度均呈现缓慢、稳定的上升。抗体产生时间(第21天的M5、M7和M8)明显早于另一组，表明该疫苗诱导了显著的体液免疫记忆反应。

3.3。测量等离子体病毒RNA负载

血浆病毒RNA负荷的结果示于图4.．各疫苗组平均病毒载量均在第17天出现峰值，晚于对照组(13 d)。平均峰值明显低于阴性对照组(），表明疫苗对病毒复制具有一定的抑制作用。

3.4。T淋巴细胞亚群分析

的T淋巴细胞亚群的流分析显示在图5.．当恒河猕猴被病毒感染时，对照组的所有动物都表现出CD4 / CD8比率的连续下降，随着第13天发生的反演现象。在整个实验时间内，没有CD4 / CD8的恢复检测到。然而，疫苗组中的CD4 / CD8的总体平均比率在第一和随后增加并随后增加，CD4 / CD8的平均比在第35天在相对较高的水平中回收。

4.讨论与结论

SIV/恒河猴是研究HIV发病机制和预防机制最有效的模型[22那23］．然而，SIV、HIV-1和HIV-2之间的抗原差异导致了该模型的显著局限性[24-26］．近年来，使用嵌合猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)代替SIV作为感染模型的情况有所增加[27］．此前，在猴子身上进行的大多数艾滋病毒疫苗试验都涉及印度恒河猴[28那29］．SHIV-KB9 /印度恒河模型广泛应用于众多研究机构，已成为评估各种疫苗的免疫保护作用的参考模型[30.那31］．然而，由于印度恒河猴动物资源短缺，中国恒河猴人口（包括约30万中国野生猕猴）已经成为重要的替代能源[32］．先前的研究表明，中国恒河猴(ChR)是更好的艾滋病疫苗研究模型[33-35］．目前的研究利用了SHIV /中国恒河猴模型来评价疫苗的免疫原性和保护效果。

以往的研究表明，天然病毒抗原可能含有对保护反应有负面影响的成分，包括多种免疫抑制和免疫病理序列。这些成分可干扰免疫反应，阻断细胞信号通路，导致体内Th1/Th2型免疫反应失衡[4.那36-39］．因此，这可能导致免疫反应偏差或缺陷。因此，在抗原表位水平上筛选、改变或修饰天然抗原，消除免疫应答中的负面因素，同时确保应答特异性，对疫苗设计极为重要。此外，单抗原基因疫苗没有显著的免疫效果。因此，疫苗设计需要结合多种不同的免疫原以及结构多样性，以获得广泛的病毒特异性免疫应答[17那40那41］．因此，目前的研究以HIV的优势表位为基础，以大分子颗粒蛋白p24为载体分子，提出了一个多表位基因。该多表位基因包含hiv特异性t细胞表位、hiv特异性b细胞表位、通用Th表位、b细胞表位和一个来自破伤风毒素(TT)的b细胞表位。除了Gag、Env、Pol等结构蛋白的功能外，该疫苗还加强了非结构蛋白(vpr、nef、tat等)在免疫应答和病毒复制控制中的重要作用。对于慢性感染，如HIV，细胞免疫反应，特别是CTL，对于清除病毒感染的细胞具有相当重要的意义[42-44］．因此，我们强调了艾滋病毒的非结构蛋白的表位，这些表位主要来自具有保护能力，广泛交叉反应性的经典，有利的种类，并且已在患者和动物实验中被证明。这将允许专注于艾滋病毒的非结构蛋白CTL。考虑到国内和亚洲艾滋病毒流行病的新特征，基于Genbank（Genbank登录号AX149898）的最近出版的HIV亚型进行了调整表位。在疫苗建设期间，考虑了Kozak规则。肽信号序列，密码子偏好和可以增加抗原转录和翻译的其他因素是针对性的，目的是实现具有诱导特异性免疫应答的有效候选疫苗，以破坏宿主中的免疫抗原。基本上，目的是预防和控制艾滋病毒感染以及疫苗接种后对疾病的补救措施。

“Prime-Boost”免疫策略是当前疫苗研究中的耸人听闻的话题[45］．首次报道使用这种策略是在流感病毒免疫中[46］．目前，这种免疫策略被广泛应用于各种病原体疫苗的研究，特别是艾滋病疫苗的研究[17那41那47］．

在该研究中，我们使用了RDNA / RFPV“Prime-Boost”的助致战略来免疫中国恒河猴。此外，我们使用SHIV-KB9感染来分析疫苗的免疫保护作用。结果表明，在RDNA / PVMP24疫苗的主要免疫过程中，疫苗仅诱导相对较低的IFN水平γ- 在免疫基团中分泌T细胞免疫应答，而在RFPV增强免疫后，免疫应答显着增加。这与相关文献一致[41那48］．DNA疫苗的初次免疫可诱导高亲和力T细胞，但免疫水平低。而鸡痘病毒增强免疫后，鸡痘通过机体的促炎免疫反应，增强初次免疫的免疫效果。

干扰素-γSHIV-KB9病毒攻击后一周和三周进行的分泌t细胞免疫反应分析显示，当暴露于病毒时，所有接种组都迅速激活了抗原特异性CD8⁺t细胞免疫力。在感染7天后，ELISPOT反应迅速增加，并在21天后维持在适当的反应水平。这说明疫苗有效地扩展了记忆CD8⁺t细胞存活并维持t细胞免疫反应的能力。

关于体液免疫，我们专注于p24的抗体，抗体滴度和抗体持续时间的生产速度。M1和M2阴性对照组呈弱HIV-1结合后的病毒攻击35天抗体反应。M3显示了在28天和35积极响应然而，抗体滴度没有上升。M4在实验过程中仍然是负数。三只动物在经免疫的组（M5，M7，M8）显示在第21天阳性抗体反应，并且该抗体表现出效价随时间变化的平滑，稳定上升，表明经免疫的组有效诱导特异性抗体的产生。

病毒载荷是可用于评估HIV疫苗是否可诱导免疫保护的主要参数，并且病毒攻击后的病毒载荷变化预测疾病的进程。在本研究中，在病毒攻击7天后对照动物出现病毒载荷的阳性响应，并且在第13天发生平均负荷的峰值。相反，平均负载的峰值发生在第17天免疫基团，峰值低于对照组的峰值。这些结果表明，疫苗延迟了早期感染阶段的病毒峰值的产生，并降低了峰值点的病毒载量。

病毒感染后，阴性对照组所有恒河猴在第13天CD4/CD8比值均出现倒转现象，比值继续迅速下降。实验期间CD4/CD8比值未见恢复。而免疫组的平均CD4/CD8比值则先下降后升高，最终在第35天恢复到较高水平。这说明该疫苗能有效地诱导t细胞增殖。

本研究的鸡痘病毒表达系统是在牛痘病毒载体的基础上新开发的痘病毒载体[48那49］．矢量继承痘苗病毒载体的相同的优点。此外，禽痘病毒具有窄的宿主范围和更安全[50.那51.］．除了考虑载体外，免疫原设计也是一个好的疫苗的关键因素。本研究通过对HIV-1全基因组的扫描分析，检索权威数据库，结合亚洲和国内HIV流行株的新特点，选择并设计了含有HIV-1优势表位的最优抗原组合。此外，我们利用p24蛋白作为分子支架。基于安全质粒DNA和新的FPV转移载体，我们构建了含有上述抗原的艾滋病疫苗。初步猴免疫实验和感染研究表明，该疫苗能在急性期降低病毒载量峰值，延迟峰值时间，使病毒载量迅速下降。结果表明，本研究构建的疫苗具有一定的免疫保护作用。这为艾滋病疫苗的开发提供了新的思路和方法。我们目前正在进行该疫苗的安全性、质量控制等临床前研究，以推进下一阶段的临床研究。

致谢

这项工作得到了资助来自中国的国家863项目（编号2006AA02Z447）和中国国家自然科学基金（编号81001342）的支持。

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51. 乔灿，蒋勇，田国光等，“基于禽痘病毒载体的重组疫苗完全保护鸡免受H5N1禽流感病毒的侵袭，”抗病毒研究第81卷第1期3，第234-238页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术

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