文摘

改变的B细胞亚群形容最新描述hiv - 1感染的高级阶段。然而,这类缺陷是否保存相关科目的CD4细胞的数量+T细胞(> 350细胞/μL)尚不清楚。在横断面的一项研究中,我们调查如果B细胞衰竭的迹象,受损的病毒免疫监测存在一群43无症状患者HIV-1-infected CD4保存+(> 350细胞/ T细胞数量μ左)和高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗。疲惫的急剧扩张组织如记忆B细胞(CD 张 张 )被观察到。B细胞改变与增加扭矩塔诺河病毒(TTV)负载,用于替代标记的免疫功能。成功HAART-treated病人显示B细胞亚群频率和正常化时段负荷。这些结果提供新的见解在hiv - 1感染和显示B细胞B细胞异常之前CD4的发展+T细胞下降。

1。介绍

通过直接或间接的影响,hiv - 1感染导致一些扰动在大多数细胞的免疫系统。持续的病毒复制引起CD4的损失+慢性细胞激活T细胞和一般影响生存能力,子集分布、表型和功能的所有主要的免疫细胞的数量(1]。B细胞表现出众多HIV-1-induced免疫激活的影响。增加的活化和增殖标志物的表达,多克隆B细胞hyperactivation, hypergammaglobulinemia一些HIV-1-infected B细胞缺陷检测的患者(2,3]。此外,B细胞来源于HIV-1-infected病人显示一些变化在体外,因为高自发抗体分泌,缺陷对B细胞刺激的反应,和costimulatory功能受损4- - - - - -8]。这些功能缺陷最近与扰动频率的几种B细胞的亚种。天真的B细胞( CD27−)构成最大的B细胞人口健康个体的血液,其次是记忆B细胞( CD27+)。记忆B细胞强烈的频率减少HIV-1-infected个人,这个事件是伴随着天真的B细胞水平的增加,激活成熟B细胞(CD20+ CD27+)和浆细胞(CD20− CD27+)[9- - - - - -11]。此外,有关扩大B细胞亚种群的特征 CD27−表型中描述最近慢性感染患者在hiv - 1感染明显的CD4的高级阶段+T细胞淋巴细胞减少和持续的hiv - 1复制(12]。B细胞群,这通常是在低频率在健康人的外周血,可以进一步划分,根据CD10的表达,到成熟/过渡B细胞(CD10+)或疲惫的组织如记忆B细胞(CD10−)[13- - - - - -15]。

转矩塔诺河病毒(TTV)是一种单链DNA病毒无害由大多数健康的人(16]。电视被认为是替代宿主的免疫状态的标志(17]。事实上,TTV病毒载量被发现明显高于HIV-1-infected患者呈现艾滋病和减少生存比健康的人18]。

在这里,我们表明无症状病人天真与保存CD4鸡尾酒疗法+(> 350细胞/ T细胞数量μL)表现出异常的B细胞分布和子集TTV病毒载量增加并发HIV-1-uninfected相比个人以及鸡尾酒疗法成功治疗病人。

2。材料和方法

2.1。研究人群

血液样本来自一群慢性HIV-1-infected患者43天真的鸡尾酒疗法,没有任何历史的机会性感染和恶性肿瘤。表中描述了这些患者的临床特征1。血液样本也从20个HAART-treated患者群,获得aviremic至少12个月(表2),从34实验室工作人员的健康。HIV-1-infected病人参加本研究招募了传染病和热带病研究所的布雷西亚大学的,提供他们的书面知情同意。这项研究是大学医院的伦理委员会批准的布雷西亚根据《赫尔辛基宣言》。

表1
的无症状HIV-1-infected病人。
表2
概要文件的HAART-treated HIV-1-infected病人。
2.2。流式细胞仪分析

血样分析3 -或4颜色表面染色后细胞溶解的红细胞(流式细胞仪赖氨酸溶液,BD Bioscences,米兰,意大利)。单克隆抗体直接共轭要么异硫氰酸荧光素(FITC),或藻红蛋白(PE),或peridinin-chlorophyll-protein (PerCP),或AlloPhycocyAnin (APC)具体CD10, CD19, CD21,表征CD27, CD3, CD4, CD8, CD127使用(BD Bioscences)。流仪分析使用FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)和50.000事件(封闭的淋巴细胞)。数据分析CellQuest软件。

2.3。IL-7血清检测

IL-7血清浓度的检测通过Quantikine HS IL-7免疫测定,根据供应商提供的协议(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。

2.4。病毒检测和量化

hiv - 1血浆病毒载量检测使用罗氏Amplicor PCR试剂盒(RocheDiagnostic、米兰、意大利)。DNA提取从200年μL的血浆样品检查TTV基因使用单步环球TaqMan实时PCR试验(如前所述)(17]。的敏感性分析是3.0的日志10DNA拷贝/毫升的等离子体。所有样本测试同时一式三份。

2.5。统计分析

统计分析进行使用Mac OS x GraphPad棱镜v4.0c每个免疫参数的分布之间的健康的捐赠者和使用非参数Mann-Whitney HIV-1-infected患者人群进行比较 测试。所有 值2站,未经调整的。变量之间的相关性进行了测试使用斯皮尔曼等级相关系数测试。统计分析,使用0.05显著性水平( )。文本中的数据被表示为值。

3所示。结果

3.1。几个B细胞改变子集在无症状和HAART-Naive HIV-1-Infected病人

在目前的研究中我们调查了频率和43 HIV-1-infected患者B细胞数量的功能特点是无临床症状,CD4细胞+> 350细胞/ T细胞计数μL(中位数:510细胞/μL),中位数6779拷贝/毫升和HAART-naive RNA病毒载量。控制,B细胞数量在34个人健康检查。

我们观察到,CD19的中值+B细胞计数的无症状患者HIV-1-infected重合健康个体的平均(129.5与143细胞/μL, resp)(图1(一))。此外,B细胞的频率子集,比如成熟/激活,不成熟/过渡或组织如记忆、休息/内存和天真的B细胞在所有测试个人分析。虽然正常的B细胞数,数扰动检测无症状的B细胞亚群HIV-1-infected病人。如数据所示1 (b)和1 (c)在 B细胞我们观察到的频率/内存(CD27休息+),和天真(CD27−)显著降低外周血的无症状患者HIV-1-infected相比健康的捐赠者(百分比中位数:23.5和29.4。 54.2和64.4, 、职责)。然而,我们观察到激活/成熟 CD27+和不成熟/过渡或组织如内存 CD27−B细胞明显高于在无症状的患者比未感染的捐赠者HIV-1-infected(百分比中位数:9.6和2.4。 10.4和2.1, 、职责)。一项研究从Malaspina et al。13显示的频率 CD27−B细胞增加HIV-1-infected患者在疾病的晚期(CD4细胞+< 200细胞/ T细胞计数μL)。这既包括CD10细胞子集+元素,占一个不成熟/过渡B细胞表型和CD10−细胞定义疲惫组织如记忆B细胞。在我们的病人无症状HIV-1-infected CD10的百分比+B细胞特别低,类似于健康的捐赠者。的 CD27−CD10 B细胞亚型是阴性,证明一个疲惫的组织如记忆B细胞表型(图1 (b))。的百分比 CD27−hiv - 1病毒载量B细胞呈正相关( , )。更高的比例 CD27−B细胞中检测出高血浆病毒血症患者(> 10000拷贝/毫升)RNA,亦然,循环的比例较低 CD27−B细胞被发现在低血浆病毒血症患者(< 10000拷贝/毫升)RNA ( )(图2)。没有观察到的相关性之间的比例 CD27−B细胞和CD4+T细胞计数( , ,而不是如图所示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
无症状HIV-1-infected患者外周血B细胞改变子集。(一)CD19的比较分析+(手机号/ B细胞数量μL) HIV-1-uninfected个人和无症状HIV-1-infected病人。(b)分析CD21和表征CD27表情b细胞从HIV-1-uninfected个人和无症状HIV-1-infected病人,和分析CD10的表情 / CD27−B细胞。的B细胞的百分比子集是由四色流式细胞术分析CD19, CD21,表征CD27和CD10表面分子表达。概要文件的表达CD21和CD27表征一个每组的代表。根据淋巴细胞细胞被封闭端散射模式和CD19向前发展+细胞。(c)比较分析HIV-1-uninfected B细胞亚种群的个体和无症状HIV-1-infected病人。的频率 CD27−天真的B细胞(左面板上), CD27+休息记忆B细胞(右上面板),CD10− CD27−疲惫的组织如记忆B细胞(左下方面板),和 CD27+成熟/激活B细胞(右下面板)所示的捐助者。使用双尾Mann-Whitney组之间的差异进行评估 测试和被认为是重要的 。入禁区情节,水平线表示为每组中值值,盒子显示第25和第75百分位数,和酒吧展示SD。n =不显著。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
疲惫的组织如记忆B细胞和艾滋病之间的关联血浆病毒血症。CD10之间的相关性− CD27−B细胞百分比和hiv - 1等离子体病毒血症(RNA拷贝/毫升)无症状HIV-1-infected患者(a) CD10的比较分析− CD27−在无症状的hiv - 1等离子体病毒血症患者B细胞百分比≤10000拷贝/毫升和RNA患者无症状的hiv - 1等离子体RNA病毒血症> 10000拷贝/毫升(B)。协会的两个不同数据组被斯皮尔曼等级测试分析; 和ρ值表示。每个符号代表一个个体,回归线。使用双尾Mann-Whitney组之间的差异进行评估 测试和被认为是重要的 。入禁区情节,水平线表示为每组中值值,盒子显示第25和第75百分位数,和酒吧展示SD。
3.2。水平的提高IL-7无症状HIV-1-Infected患者的血清

IL-7是控制的多效细胞因子T淋巴细胞增殖和T细胞外围扩张与它的表面受体(IL-7R通过交互α或CD127) (19]。几个研究人员观察血清水平的增加IL-7 CD4 HIV-1-infected患者表现为严重+淋巴细胞减少,直接联系IL-7血清浓度和病毒载量,CD4的损失+T细胞和B细胞的改变子集(13,20.]。此外,不成熟/过渡CD10的频率+ CD27−B细胞呈正相关的IL-7浓度检测lymphopenic HIV-1-infected患者(13]。由于这些原因,高水平的IL-7被认为是先进的hiv - 1疾病的一个标志。然而,我们观察到的一个戏剧性的增加IL-7血清水平也与健康人相比,患者无症状HIV-1-infected(浓度中位数:12.9 pg / mL和1.7 pg / mL, )尽管相对保存CD4的数量+T细胞(中位数号码数:510与831细胞/μL)(图3(一个))。IL-7血清水平和CD4之间没有相关性+T细胞计数或疲惫的组织如记忆B细胞频率被发现(图子集3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
IL-7血清水平无症状与CD10 HIV-1-infected患者和相关− CD27−B细胞的频率。(一)比较分析IL-7血清水平(pg / mL) HIV-1-uninfected捐赠者和无症状HIV-1-infected病人。ELISA进行测量IL-7浓度。(b)相关性IL-7血清水平和CD10的百分比− CD27−无症状HIV-1-infected患者的B细胞。区别使用正反Mann-Whitney组评估 测试和被认为是重要的 。入禁区情节,水平线表示为每组中值值,盒子显示第25和第75百分位数,和酒吧展示SD。协会的两个不同数据组被斯皮尔曼等级测试分析。每个符号代表一个个体,回归线。北卡罗来纳州=没有相关性。
3.3。增加台负载的无症状HIV-1-Infected患者和相关CD21。表征低CD27−B细胞频率

到目前为止,我们的研究结果显示,B细胞间深刻的表型改变的患者无症状的hiv - 1感染阶段。先前的研究表明,B细胞的子集,HIV-1-infected患者的外周血中表达异常疾病的晚期,在健康个体几乎可检测,显示一些功能缺陷(13,21]。我们的研究的目的是试图了解这些常见的影响B细胞免疫监视子集在活的有机体内。

台是一个无处不在的病毒感染了健康人口的80% (22),这是目前在高效价在晚期病人的血液中hiv - 1感染健康受试者相比。HIV-1-infected患者时段负荷与CD4负相关+T细胞计数(18]。台等离子体病毒血症测量在所有个人参加我们的研究。无症状患者HIV-1-infected显示更高的循环时段相比健康个体(效价值:5.7和4.6 DNA拷贝/毫升, 、表3)。之间的直接相关性观察时段负荷和hiv - 1病毒血症和百分比 CD27−B淋巴细胞( , , resp)(图4)。这些数据表明,在无症状HIV-1-infected病人比例的增加 CD27−B细胞可能与缺乏有关在活的有机体内免疫控制时段的复制。

表3
鸡尾酒疗法对B细胞频率,IL-7血清水平,和TTV病毒载量。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
扰动在台视无症状HIV-1-infected病人的免疫监视。(一)电视和hiv - 1病毒载量(之间的相关性 DNA拷贝/毫升, RNA拷贝/毫升,resp)等离子体来源于无症状HIV-1-infected患者。台和艾滋病病毒载量测定通过PCR和rt - PCR,分别。(b)等离子电视效价之间的相关性和CD10的百分比− CD27−无症状HIV-1-infected患者的B细胞。协会的两个不同数据组被斯皮尔曼等级测试分析; 和ρ值表示。每个符号代表一个个体,回归线。
3.4。正常B细胞频率和子集正常时段HAART-Treated患者的血浆水平

然后我们调查的影响HAART的B细胞室群HIV-1-infected个体经验的CD4水平低+T细胞计数过程中感染(低谷中位数:183细胞/μL),和维护检测不到hiv - 1病毒载量在过去12个月的治疗。在我们的研究中,所有患者CD4显示属于这个群组+T细胞计数高于无症状therapy-naive HIV-1-infected患者(平均682细胞/μL与510细胞/μl )。B细胞的绝对数量明显高于在HAART-treated患者相比无症状HIV-1-infected HAART-naive病人和健康人(中位数:233细胞/μL和129.5细胞/μl ,与143细胞/μl 职责。)(表3)。HAART-treated队列的患者没有观察到罕见的B细胞数量的百分比 CD27−和 CD27+B细胞重叠的健康个体(图5)。与此同时,的百分比 CD27−B细胞亚群在HAART-treated高于无症状HIV-1-infected组患者( ),接受治疗的患者是可以重叠的IL-7水平的健康的捐赠者。最后,一个成功的免疫监视观察在HAART-treated病人显示一台等离子体范围内病毒血症通常在健康受试者(中值:4.1和4.6 DNA拷贝/毫升)。


图5
鸡尾酒疗法的效果在HIV-1-infected患者B细胞分布子集。比较分析CD21和CD27表达表征的B细胞从HIV-1-uninfected个人、无症状HIV-1-infected患者和HAART-treated病人。概要文件的表达CD21和CD27表征每个组织的一个代表(下图)。根据淋巴细胞细胞被封闭端散射模式和CD19向前发展+细胞(上半部分)。

4所示。讨论

干扰在B细胞的分化和功能描述hiv - 1感染,主要是,这些障碍相关CD4的损失+T细胞和hiv - 1负载的增加12]。在目前的研究中,我们表明,患者无症状HIV-1-infected天真的鸡尾酒疗法的特点是正常B细胞数量但B细胞受损子集的频率。特别是,我们观察到 CD27−和 CD27+B细胞过表达,而的频率 CD27−和 CD27+B细胞,分别占天真和休息记忆B细胞,较低而健康的捐赠者。增加的不常见的 CD27−无症状患者HIV-1-infected由B细胞人口完全筋疲力尽的组织如记忆B细胞因为没有CD10分子表面检测到细胞的子集。很可能的外观 CD27+B细胞,进行等离子体爆炸HIV-1-induced激活和分化,和通常称为激活成熟的元素,以及外观 CD27−B细胞,来源于疲惫B细胞亚群,可以归结于B细胞hyperactivation由慢性病人无症状的hiv - 1的存在。疲惫的无症状患者的B细胞的存在hiv - 1负荷密切相关但不CD4细胞+T细胞计数。不成熟/过渡CD10+ CD27−外周血B细胞,先前描述的hiv - 1阳性患者在疾病的晚期,没有出现在无症状患者的队列可能是因为他们因此出现强烈的CD4细胞减少+T细胞计数(13,15]。事实上,成熟/过渡B细胞也non-HIV-1-related特发性CD4患者中观察到+淋巴细胞减少表明HIV-1-induced CD4+淋巴细胞减少(而不是hiv - 1病毒血症本身)驱动的扩张HIV-1-infected患者的这些元素(23]。因此,我们的数据显示,疲惫的组织如记忆B细胞出现独立于不成熟/过渡HIV-1-infected患者B细胞和先于后者的出现可能引起的稳态压力诱导淋巴细胞减少,从条件和/或增加早期B细胞的表达水平IL-7等刺激因素(13,23]。

一些研究报告,CD4细胞+淋巴细胞减少由hiv - 1感染或骨髓移植和特发性CD4细胞+T淋巴细胞减少通常与血清水平的增加有关IL-7 [21,23- - - - - -25]。为了解释CD4 IL-7水平的增加+T lymphopenic个人,有人建议IL-7增加发生的补偿效应增强差异化,T细胞的生存和发展以应对HIV-1-mediated T细胞耗竭(24]。令人惊讶的是,我们发现水平的提高IL-7在无症状HIV-1-infected病人血清,与CD4但没有相关性+T细胞计数或hiv - 1负载检测。这个结果可能会发现一个可能的解释在最近发现Guimond et al。26],系统性IL-7浓度增加仅仅因为减少使用目标细胞的淋巴因子。

因此,可以假设疲惫的记忆B细胞在无症状的存在HIV-1-infected病人可能偏见免疫细胞的正常运行,和,因此,一个合适的免疫监视。

到目前为止,还没有病理效应可以归结于电视22,27]。TTV病毒载量似乎取决于宿主的免疫状态,肿瘤患者或hiv - 1感染健康人相比具有较高的时段负荷(16,28]。此外,最近发现通过研究TTV在骨髓移植患者表明,病毒载量的增加与CD8失调的比例上升+CD57+T淋巴细胞在血液传播(17,29日]。在这项研究中,我们表明,无症状HIV-1-infected个人TTV病毒载量高于健康对照组,其滴定度直接相关的hiv - 1病毒载量CD4但不是+T细胞计数。此外,TTV病毒载量直接相关的百分比 CD27−B细胞。这些相关性可能证实一种稀缺的免疫控制时段复制的B细胞和一个已经在治疗无症状HIV-1-infected免疫监测病人。

多项研究表明,HAART-mediated抑制hiv - 1等离子体病毒血症是紧随其后的是B细胞计数和hyperactivation正常化。此外,减少hiv - 1病毒血症通过鸡尾酒疗法与减少频率筋疲力尽的组织如记忆B细胞(30.]。我们已经描述了经验丰富的鸡尾酒疗法的患者,导致无法觉察的hiv - 1病毒血症在过去12个月的治疗,显示正常B细胞分布子集。高效抗逆转录病毒疗法的作用正常化IL-7血清水平是有争议的:一些调查显示只有部分减少IL-7水平,不会对正常价值的下降而另一些记录完整的正常化这个免疫参数(19,31日]。在我们的研究中,成功地HAART-treated病人显示IL-7值重合的健康HIV-1-uninfected个人。

有趣的是,我们都报道,HAART-treated患者时段负荷水平通常在健康个体中发现。这一发现表明,抗逆转录病毒疗法旨在控制hiv - 1加载和正常化B细胞亚种群可以帮助恢复免疫功能水平能够控制这种内源性病毒的复制。规范化的B细胞计数和亚种群HAART紧随其后的是改进的B细胞反应T cell-independent和T cell-dependent免疫原(29日,32- - - - - -34]。特别感兴趣的是最近发现的早期控制病毒复制通过鸡尾酒疗法保持长寿的B细胞反应接种HIV-1-infected孩子因此凸显出hiv - 1病毒血症的直接作用在B细胞终端分化35]。这些观测具有重要意义不仅对二级保护免疫反应病原体,也是为了维护或促进hiv - 1特定的免疫反应,包括抗体反应。

5。结论

我们已经提供了证据,无症状HIV-1-infected患者CD4保存+T细胞数量,天真的鸡尾酒疗法,显示改变在B细胞表型子集和受损的免疫反应,通过他们无法控制时段复制。另一方面,正常B细胞表型和计数在发起鸡尾酒疗法的患者被发现在慢性疾病和显示消极的hiv - 1病毒载量在过去12个月的治疗。正常B细胞亚群HAART-treated正常TTV病毒载量患者反映,为复苏证明足够的免疫监视。从这个角度来看,鸡尾酒疗法以及免疫细胞疗法旨在减少管制有助于更好地控制免疫功能的损失如果管理早在hiv - 1感染。

确认

作者要感谢的人参与这项研究,加入他们的团队。他们也承认Minini的熟练的技术援助。本文是由史Superiore di Sanita(国家艾滋病研究项目资助:45 g。5和40 g.16)。