发布机制降低了谷胱甘肽在人与艾滋病毒感染

文摘

我们检查了原因减少谷胱甘肽(GSH)在感染艾滋病毒的人。我们观察到低水平的细胞内谷胱甘肽在巨噬细胞从艾滋病患者与健康受试者相比。此外,谷胱甘肽合成中发现巨噬细胞受艾滋病病毒的感染⁺学科严重倾向于氧化谷胱甘肽(GSSG)缺乏抗氧化活性,在免费的谷胱甘肽负责谷胱甘肽的抗氧化活性。这种减少与增加的增长结核分枝杆菌(结核病)巨噬细胞从艾滋病毒⁺个人。另外,我们观察到增加自由基的水平,interleukin-1 (il - 1)、interleukin-17 (IL-17)和转化生长因子-β(TGF -β)血浆样本来自艾滋病毒⁺个人健康受试者相比。我们观察到的减少表达基因编码酶负责从头合成谷胱甘肽的巨噬细胞来源于艾滋病毒⁺科目使用定量PCR (qPCR)。我们的研究结果表明,生产过剩的促炎细胞因子在艾滋病毒⁺个人导致自由基的生产。这结合减少谷胱甘肽合成的酶的表达导致自由谷胱甘肽的耗竭和可能导致部分艾滋病患者的免疫功能观察到的损失。

1。介绍

根据世界卫生组织(世卫组织),据估计,大约有3330万人感染艾滋病毒,其中三分之二生活在撒哈拉以南非洲地区。也估计,每年近2.6人被感染(1]。人被诊断为艾滋病经常遭受危及生命的疾病造成的机会性感染包括肺结核(TB)。近年来,结核病的发病率显著增加,由于耐多药和extreme-drug耐药菌株的出现m .结核病由于增加数量的高度易感艾滋病引发的免疫功能不全的人。它也认为,在发展中国家,多达40 - 80%的艾滋病患者在患结核病的风险(2,3]。在以前的研究中,我们实验室毒性菌株的报道m .结核病是敏感的抗氧化剂,谷胱甘肽(4- - - - - -9]。我们的研究表明,感染艾滋病毒的个体细胞内谷胱甘肽的不足红细胞(RBC)以及外周血单核细胞(PBMC),包括T细胞、自然杀伤细胞,单核细胞(8]。

谷胱甘肽是一种三肽谷氨酰胺组成,半胱氨酸,甘氨酸在维护中起着重要作用的细胞内氧化还原状态。谷胱甘肽对细胞体内平衡也很重要,以及许多不同的细胞功能,比如蛋白质合成、酶催化、跨膜运输、受体作用,中间代谢,细胞的成熟10- - - - - -12]。谷胱甘肽是由几乎所有的细胞类型,以两种形式存在。减少或免费的谷胱甘肽负责谷胱甘肽的抗氧化功能,虽然GSSG的副产品的自由基清除活性谷胱甘肽和缺乏抗氧化功能10- - - - - -12]。

免费的谷胱甘肽合成的细胞通过两个不同的机制。自由可以从头合成谷胱甘肽通过一个两步的过程是由两个不同的酶。第一,更始病原反应一步合成谷胱甘肽是链接的谷氨酰胺和半胱氨酸glutamine-cysteine连接酶(GCL)形式γ谷酰基半胱氨酸(图1(一))。第二步是甘氨酸的链接γ谷酰基半胱氨酸酶催化的谷胱甘肽合成酶(GSS)(图1 (b))。免费的谷胱甘肽也可以通过减少GSSG合成。这个反应是由谷胱甘肽还原酶催化(GSR)利用NADPH作为代数余子式(图1 (c))。

我们的假设是慢性感染艾滋病毒会导致过度生产的促炎细胞因子如il - 1、IL-17, TNF -α。促炎细胞因子导致的慢性生产过剩自由基的生成。这些自由基被免费回收谷胱甘肽。自由基的过度生产感染艾滋病毒的人会导致谷胱甘肽的耗竭。此外,高架TGF -β块的生产GCLC降低生产谷胱甘肽的新分子。高浓度的il - 1还将促进细胞内半胱氨酸的损失,从而进一步减少生产新谷胱甘肽分子。我们测试我们的假设进行体外研究使用人类monocyte-derived巨噬细胞与健康个体和个人与艾滋病毒感染。我们的研究结果意味着一个重要的机制,负责减少谷胱甘肽的水平与艾滋病毒感染导致增强巨噬细胞从个人乘法和细胞内的生存m .结核病。

2。材料和方法

2.1。主题

总共26志愿者(13名健康受试者和13名患有艾滋病毒感染)参与了这一研究。感染艾滋病毒的人是从山麓艾滋病招募项目。健康受试者没有感染艾滋病毒和结核病的历史是从大学教职员工招募的。感染艾滋病毒的志愿者被诊断出患有hiv - 1,都是采取某种形式的抗逆转录病毒治疗(ART), CD4细胞⁺t细胞数量在271年到1415年之间细胞每毫米³。35毫升的血液是一次健康的志愿者和患者感染艾滋病毒后获得知情同意签署。我们所有的研究机构审查委员会和机构批准生物安全委员会。

2.2。隔离的单核细胞和体外培养分化为巨噬细胞

我们第一次分离PBMC全血的健康和艾滋病感染者使用聚蔗糖密度梯度离心法Histopaque(σ)。等离子体健康,感染艾滋病毒的患者样本收集的细胞因子测量。单核细胞被坚持远离PBMCs poly-L赖氨酸(% 0.005)治疗- 96 well-tissue文化板块。简而言之,PBMCs (细胞/)被添加到poly-L lysine-treated组织培养板和孵化一夜之间在37°C促进单核细胞粘附。隔夜坚持后,不依从细胞被移除,和新媒体(RPMI(σ)补充5%人类AB血清(σ)添加到贴壁细胞培养7天的培养条件允许单核细胞分化成巨噬细胞。

2.3。测定il - 1、TGF -β、IL-17和丙二醛(MDA)在等离子体和巨噬细胞溶菌产物

从收集血浆和细胞因子测定巨噬细胞文化上层清液,酶联免疫吸附试验(ELISA) (eBioscience)。在巨噬细胞溶菌产物MDA测定比色测定(开曼化学)。

2.4。测定谷胱甘肽水平的巨噬细胞健康和感染艾滋病毒的科目

谷胱甘肽水平以孤立的巨噬细胞与艾滋病毒感染健康受试者和个人。分光光度法测定细胞内的谷胱甘肽水平在巨噬细胞使用从阿伯化验分析工具。简而言之,巨噬细胞()脱离胰岛素治疗(50的培养板μL / 10⁵在培养条件下细胞)10分钟。分离的细胞被清洗和resuspended冰冷5% 5-sulfosalicylic酸脱水(SSA)的解决方案。上层清液离心后收集分析和氧化谷胱甘肽按照制造商的说明。免费的谷胱甘肽被减去测量计算氧化谷胱甘肽浓度的测量总谷胱甘肽浓度,根据制造商的指示。谷胱甘肽的测量都是标准化的,总蛋白质含量。

2.5。总蛋白质含量的测定巨噬细胞上清液和细胞溶解产物

蛋白质在巨噬细胞上清液中分离出来,并溶解产物被布拉德福德的测量方法使用Coomassie蛋白质测定试剂(热科学)。

2.6。巨噬细胞感染细菌细胞的准备

所有感染研究使用毒性实验的进行m .结核病,H37Rv在生物安全三级(BSL-3)设施。m .结核病感染处理如下:静态文化H37Rv峰值在对数期的增长(在0.5和0.8之间A600)被用于单核细胞的感染。细菌悬液洗,re-suspended RPMI(σ)包含AB血清(σ)。细菌团分解了涡流的5倍和3毫米的玻璃珠子。细菌悬液是通过5μm注射器过滤器(微孔)来删除任何进一步的团。微生物的总数在悬架被镀确定。处理H37Rv被冻结在−股票80°C。感染时,冷冻处理的股票H37Rv解冻,用于单核细胞的感染。

2.7。感染的巨噬细胞m .结核病

加工H37Rv Monocyte-derived巨噬细胞被感染的感染复数10:1和2小时孵化吞噬作用。Unphagocytosed分枝杆菌是被洗涤三次被感染的巨噬细胞与温暖的无菌PBS。被感染的巨噬细胞在RPMI + 5% AB血清培养。感染文化被终止在1小时和5天postinfection H37Rv确定细胞内生存。0.2文化收集上层清液,过滤μm过滤,储存在−80°C细胞因子的测定。

2.8。终止感染巨噬细胞集落形成单位的文化和测量

终止m .结核病文化是由添加200人感染μL蒸馏无菌水的每种文化。7日收集到的细胞溶解产物镀h11介质(嗨媒体)富含白蛋白葡萄糖复杂(ADC),估计H37Rv巨噬细胞增长的程度。

2.9。谷胱甘肽合成基因的定量PCR分析

RNA是孤立的从巨噬细胞健康和艾滋病感染者使用试剂盒(表达载体)制造商的指示。孤立的RNA是量化使用NanoVue分光光度计(GE)。孤立的RNA是反向转录cDNA使用qScript互补脱氧核糖核酸合成装备(量子生物科学)制造商的指示。qPCR基因表达进行了分析使用一个EvaGreen qPCR大师(Biotium)和混合GSH-metabolism基因引物:glutamine-cysteine连接酶(催化亚基)(GCLC) glutamine-cysteine连接酶(调节亚基)(GCLM)、谷胱甘肽合成酶(GSS)、谷胱甘肽还原酶(GSR)γ谷酰基转移酶1 (GGT1)(琳生物制药)StepOne + thermocycler (ABI) /制造商的指示。使用ΔΔCt方法,比较基因表达分析。目标基因表达与内源性基因的控制β肌动蛋白(ACTB)为每个样本。为每个目标感染艾滋病毒的基因样本的基因表达主题是表达在健康对照组相比。

3所示。结果

3.1。检测细胞因子和MDA在等离子体和巨噬细胞上清液

il - 1浓度测量等离子体的健康和艾滋病感染者显示显著增加大量的il - 1出现在等离子体的感染艾滋病毒的人在健康个体中发现的。事实上,我们的研究表明血浆il - 1的浓度大于6倍增长的感染艾滋病毒的人(图2 (b))。此外,我们分析文化上层的巨噬细胞il - 1的艾滋病毒感染和健康个体表现出显著增加生产的il - 1感染艾滋病毒感染巨噬细胞(图3(一个))。

我们还观察到显著增加TGF -的水平β等离子体的感染艾滋病毒的人相比,健康受试者(图2(一个))。测定TGF -β上层清液中巨噬细胞文化也表现出显著增加生产TGF -β艾滋病毒感染的巨噬细胞群在那些从健康组(图3 (c))。

我们的分析还包括一个分析IL-17艾滋病毒和对照组的血浆。我们发现水平显著提升IL-17血浆从艾滋病感染组与对照组相比(图2 (c))。

我们比较TNF -α上层清液的艾滋病毒感染和健康的巨噬细胞显示显著增加TNF -α艾滋病毒感染巨噬细胞(图生产3 (b))。

除了上述细胞因子外,我们还在分析中MDA浓度巨噬细胞溶菌产物从健康和感染艾滋病毒的科目。MDA是一个副产品中形成脂质过氧化作用。MDA的测量已被证明是一个相当准确的表示自由基形成(13,14]。MDA的化验显示巨噬细胞溶菌产物的水平增加感染艾滋病毒的人在健康个体(图3 (d))。这些MDA水平升高与提高自由基的生产。

3.2。测定谷胱甘肽的巨噬细胞溶菌产物

我们的分析巨噬细胞溶菌产物表现出明显的谷胱甘肽减少总谷胱甘肽存在于艾滋病感染巨噬细胞感染巨噬细胞(图相比4(一))。此外,我们的谷胱甘肽的分析测试中巨噬细胞溶菌产物表现出显著低水平的免费的谷胱甘肽与艾滋病毒感染巨噬细胞从个人相比,巨噬细胞在健康受试者(图4 (b))。特别感兴趣的是免费的谷胱甘肽和GSSG的相对百分比。在巨噬细胞从hiv阳性个体分离,我们观察到约30%的总谷胱甘肽是由自由GSSG谷胱甘肽和70%。在巨噬细胞与健康个体,我们观察到60%的谷胱甘肽合成谷胱甘肽和40% GSSG(图4 (c))。

3.3。细胞内生存的决心m .结核病在孤立Monocyte-Derived巨噬细胞

我们的测试的细胞内生存m .结核病在孤立的巨噬细胞的增长m .结核病巨噬细胞的健康和艾滋病毒感染巨噬细胞;然而,增加数倍的增长m .结核病在巨噬细胞感染艾滋病毒。事实上,有超过3倍m .结核病艾滋病毒感染巨噬细胞的增长相比,健康的巨噬细胞(图4 (d))。这些结果证实艾滋病毒感染的巨噬细胞收集受试者的能力来控制感染受损。

3.4。比较基因表达分析的谷胱甘肽合成的酶

比较GCLC基因表达分析、GCLM GSS, GGT1巨噬细胞感染hiv病毒的受试者表现出显著减少这些基因的表达相比,健康的巨噬细胞。在艾滋病毒感染巨噬细胞表达GCLC和GCLM减少了大约一半。在艾滋病毒感染巨噬细胞表达GSS减少约89%。有趣的是,GSR表达式在艾滋病毒感染巨噬细胞在GSR表达增加了3.8倍的巨噬细胞与健康受试者。最后表达GGT1在艾滋病毒感染巨噬细胞被发现相比减少约80%健康的巨噬细胞(图5)。

4所示。讨论

m .结核病仍然是最有害的和持久的人类的病原体。推断,第一个感染细胞是肺泡巨噬细胞这内在化的液滴雾化吸入后杆菌感染者[15]。巨噬细胞被认为是主要的防御机制对微生物入侵(16,17]。巨噬细胞吞噬系统,提供微生物室,也就是说,该网站生成的活性氧中间体,酸度增加,水解活性,抗菌肽的存在(15]。重要的是,我们报道,谷胱甘肽在限制细胞内的增长中扮演着重要角色H37Rv在人类和小鼠巨噬细胞(4- - - - - -6]。因此,谷胱甘肽有直接抗活动不同于它的作用作为一个载体,功能先天防御的效应分子m .结核病感染(4- - - - - -6]。这些结果展开小说和潜在的重要的先天防御机制采用人类巨噬细胞控制m .结核病感染(5,6]。符合这些观察,我们还发现谷胱甘肽结合细胞因子,如和白介素- 2,增强自然杀伤细胞的活性控制m .结核病内感染人类巨噬细胞(7]。从我们最重要的是,数据最近的研究表明,谷胱甘肽激活T淋巴细胞的功能控制m .结核病内感染人类单核细胞(未出版)。所有这些观察结果支持这一事实谷胱甘肽控制m .结核病作为抗感染功能代理通过增强免疫细胞的功能。最后,我们证明了谷胱甘肽水平显著降低在PBMC感染艾滋病毒的人隔绝,这减少与增加产量的促炎细胞因子和增强的增长m .结核病(8]。

在这项研究中,我们调查了原因,减少谷胱甘肽在感染艾滋病毒的人。此外,我们还为特征的影响,减少谷胱甘肽在损伤的生长抑制m .结核病在巨噬细胞。

测量的il - 1和TGF -β等离子体和巨噬细胞上清液浓度的健康和艾滋病感染者显示这些细胞因子的含量显著增加在健康个体出现在感染艾滋病毒的人。il - 1是一种促炎细胞因子,当绑定到它的受体,能传感信号,启动各种炎症基因的表达通过NF -κB系统。随后转录的基因可以产生多种炎症趋化因子等产品,和促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,il - 6,引发18]。il - 1、TNF -α已经被证明是由绑定的CD4分子gp120单核吞噬细胞或感染艾滋病毒19,20.]。几项研究已经证明了TGF -增加之间的联系β生产和减少GCLC基因表达,以及合成谷胱甘肽(21,22]。另外,我们观察到显著增加生产il - 1和TGF -β文化的上层清液中巨噬细胞从艾滋病毒感染组与健康个体(数字3(一个)和3 (c))。

我们还观察到显著增加的水平IL-17血浆样本中感染艾滋病毒的人。IL-17被认为扮演了一个重要的角色在激活和诱导抗菌肽和促炎细胞因子il - 6, CCL2, TNF -α(23,24]。此外,高水平的细胞因子与许多炎性疾病包括风湿性关节炎、多发性硬化症、和哮喘。低水平,另一方面,被认为是导致受损宿主防御分枝杆菌感染和减少抗菌免疫(23,25]。

研究艾滋病的影响IL-17浓度使用流式细胞仪发现艾滋病病毒感染者IL-17水平有显著提高(26]。然而,Brenchley et al。25)指出,有IL-17生产Th17细胞明显减少胃肠道的感染艾滋病毒的病人。事实上,研究表明,Th17细胞优先目标在艾滋病毒感染。IL-17浓度的减少在胃肠道黏膜壁的概率会大大增加细菌感染,这可能反过来对艾滋病发病机理[的速度有着重要的意义26]。Levy指出[27)、慢性免疫激活增加生产的促炎细胞因子(il - 6、IL-17 TNF -α等)。这upregulation促炎细胞因子通常会导致CD4的快速流失⁺T细胞通过细胞凋亡。

我们观察到显著增加生产TNF -α文化的上层清液中巨噬细胞的艾滋病毒感染组与健康个体(图3 (b))。此外,在一个单独的研究中,我们观察到显著增加浓度的TNF -α等离子体的感染艾滋病毒的科目(未出版)。肿瘤坏死因子-α,另一个促炎细胞因子在艾滋病毒感染中起着重要作用,是由单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞在应对艾滋病毒感染19,20.]。HIV病毒血症和TNF -之间有相关性α并在感染艾滋病毒的患者的血清il - 1的水平。TNF -生产过剩α可能导致炎症损伤和毒性,这可能导致退化CD4的宿主免疫反应的独立⁺T细胞耗竭。这些高水平的肿瘤坏死因子-α导致发热、厌食等症状的艾滋病病毒/艾滋病。艾滋病导致慢性感染,这导致了长时间的生产il - 1、TNF -α,这刺激的长期生产自由基。这种慢性炎症状态,进而导致慢性氧化应激(19,20.]。

MDA的化验显示巨噬细胞溶菌产物的水平增加感染艾滋病毒的人在健康个体(图3 (d))。这些MDA水平升高与提高自由基的生产。此外,在以前的研究中,我们演示了血浆中MDA的含量严重超标孤立从感染艾滋病毒的人血浆从健康人(未出版)。

我们观察到明显降低总和免费的谷胱甘肽存在于巨噬细胞从个人与健康受试者相比,HIV感染巨噬细胞(数字4(一)和4 (b))。我们也观察到GSSG比例增加巨噬细胞的感染艾滋病毒的人相比,巨噬细胞在健康受试者(图4 (c))。

减少总和免费的谷胱甘肽的水平和增长数倍的增加有关m .结核病从患有艾滋病毒感染(图内巨噬细胞4 (d))。这些结果证实了巨噬细胞来源于感染艾滋病毒的能力控制m .结核病感染受损。艾滋病感染巨噬细胞的免疫功能不全的状态与促炎细胞因子水平的增加,TGF -β,减少谷胱甘肽的水平。

一般慢性氧化应激是艾滋病患者的观察,表明有利于增加抗氧化补充剂可以减少DNA的损伤,可能是感染的进展放缓(28]。艾滋病毒感染的发展特点是CD4的丧失⁺T细胞和免疫力下降。延长自由基过量的单核细胞和粒细胞结合减少生产谷胱甘肽合成的酶可以看出,我们的实验有助于抗氧化机制的缺乏,尤其是谷胱甘肽。这可能会导致CD4的损失⁺T细胞通常出现在艾滋病毒的进展(28- - - - - -30.]。

我们观察到显著减少的表达GCLC, GCLM, GSS, GGT1基因与艾滋病毒感染巨噬细胞从个人与健康受试者相比。大多数细胞无法运输谷胱甘肽或GSSG跨质膜,这些化合物必须首先裂解γ谷酰基键才可以被转移到胞质(10,31日]。GGT1执行这个乳沟,允许组件新谷胱甘肽分子转移到细胞(11,12]。减少GGT1表达我们观察表明减少新创谷胱甘肽生产所需的原材料,也导致谷胱甘肽缺乏。有趣的是,GSR表达式在艾滋病毒感染巨噬细胞在GSR表达增加了3.8倍的巨噬细胞与健康受试者。这个增加GSR表达式表明试图通过增加免费的谷胱甘肽浓度的细胞氧化谷胱甘肽的回收。然而;由于这种酶的生产力是有限的氧化谷胱甘肽现在和需要NADPH作为辅因子,GSR的增加似乎并不足以弥补新创谷胱甘肽产量的减少。

总而言之,我们观察到显著增加促炎细胞因子的水平如il - 1、TNF -α,IL-17患有艾滋病毒感染(数字2和3)。这增加HIV感染患者的促炎细胞因子水平与增加自由基(图的生产3)。此外,我们还观察到显著增加TGF -的水平β在等离子体和巨噬细胞上清液从个人与艾滋病毒感染,这在GCL基因表达增加与减少巨噬细胞(数字2,3,5)。我们的研究结果表明,自由基水平上升(由促炎细胞因子诱导)和减少GCL (TGF -诱导表达β)可能导致的谷胱甘肽水平降低巨噬细胞来自患者感染艾滋病毒。重要的是,巨噬细胞中谷胱甘肽水平降低艾滋病毒感染患者伴随有增强细胞内生存m .结核病。

最后,我们观察到的相关性降低细胞内谷胱甘肽水平,增加了促炎细胞因子,增加自由基。我们的数据支持我们的假设,即减少细胞内谷胱甘肽水平感染艾滋病毒的人是由于慢性炎性细胞因子(il - 1、TNF -生产过剩α和IL-17),细胞因子(TGF -β),干扰谷胱甘肽的生物合成(图6)。我们的数据也支持这个想法,慢性炎症导致增加自由基的生产,进而促进促炎细胞因子的生产,从而进一步细胞内谷胱甘肽的耗竭,增加自由基的生产。我们相信这是一个自我推销循环炎症。在未来的研究中,我们希望证明可以打破这个循环补充谷胱甘肽。如果成功,我们的数据表明补充谷胱甘肽治疗功效的可能性与艾滋病毒和个人m .结核病合并感染。

确认

这项工作是由Potts纪念基金会和创业资金从西方大学健康科学。作者感谢员工西方大学医学中心在抽血的帮助。我们感谢志愿者的参与这项研究。

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