NK细胞受体的影响LIR-1 (ILT-2 / CD85j / LILRB1)对多发性骨髓瘤细胞毒性

文摘

不同的受体的作用自然杀伤(NK)细胞介导细胞毒性对多发性骨髓瘤(MM)细胞是未知的。我们调查如果NK-cell-mediated的增强细胞毒性对MM可以达到通过阻断抑制白细胞immunoglobulin-like受体1 (LIR-1)。我们的调查显示高水平的LIR-1表达式不仅NK细胞系NK - 92,但也对骨髓瘤细胞(MOLP-8 RPMI8226)以及lymphoblastoid细胞系(LBCL;IM-9)。随后的细胞毒性分析旨在展示的孤立效应LIR-1阻塞效应或肿瘤一侧排除receptor-receptor交互。尽管nk - 92能够骨髓瘤细胞溶菌作用,抑制LIR-1 nk - 92并没有增强细胞毒性。针对受体在毫米和LBCL也没有改变nk - 92介导细胞溶解。我们得出结论,LIR-1并不能直接影响NK-cell-mediated对骨髓瘤细胞毒性。据我们所知,这工作提供了第一手的调查的抑制能力LIR-1 nk - 92对MM介导细胞毒性和第一个功能评价LIR-1毫米和LBCL。

1。介绍

NK细胞功能的理解经历了一个漫长的过程,因为他们的身份在1975年(1]。NK细胞最初被认为是先天免疫系统的一部分,不允许任何调制的行动对他们的微环境的变化。模式的抑制和激活受体被认为是足够充分的检测肿瘤细胞缺乏人类白细胞抗原(HLA)类我分子。这些肿瘤细胞是当场死亡,没有任何明显的需要coactivation其他细胞的免疫系统(2]。这个独特的特性在淋巴细胞已被理解为只有响应的基本功能,完成的不同相互作用尤其是树突细胞(DC)和T细胞(3]。NK细胞进行广泛沟通与他们的环境,和他们still-not-fully-deciphered组受体检测正常表面模式的变化在所有类型的组织。

NK细胞受体在功能上分为激活和抑制受体。他们的主要配体是主要组织相容性复合体(mhc I)分子,尽管其中的一些受体可以直接识别特定抗原在细菌或受损的细胞。主要是三个不同的子类nk细胞受体(NKRs)可以区分。

LIR和杀手immunoglobulin-like受体(吉珥)是I型immunoglobulin-like的跨膜蛋白受体超科(IgSF)。识别经典HLA分子,而LIR还可以与模HLA类我和细菌绑定亲和力较低(2,4- - - - - -6]。第二组的自然细胞毒性受体(协助)也属于I型跨膜蛋白,但定义糟糕的配体。II型C-lectin类型的跨膜蛋白总科包括自然杀伤细胞lectin-like受体组2 (NKG2)受体,形成与CD94形成(2]。

LIRs表达上的NK细胞和T细胞亚群,以及单核细胞,B细胞,分布最广的DC, LIR-1 [7- - - - - -10]。

LIR-1是一种抑制性受体也称为immunoglobulin-like成绩单2 (ILT-2) / CD85j或白细胞immunoglobulin-like受体亚B成员1 (LILRB1) [7]。它第一次被发现在寻找UL18的同行,巨细胞病毒编码的HLA类我同族体感染细胞上表达(8,11,12]。

MM是一种无法治愈的疾病,特点是终末分化浆细胞的克隆增殖13,14]。干细胞移植(SCT)是迄今为止唯一的选择来达到长期缓解的疾病15]。为了提高MM患者的结果,正在调查方法如免疫调节和细胞疗法。NK细胞免疫治疗是一个有吸引力的候选人。他们杀死肿瘤细胞抗原启动(2),是主要的淋巴细胞在移植后的头90天(子集16- - - - - -19]。LIR-1是其中一个主要抑制NK细胞受体在这个早期阶段SCT (10,16,20.]。

因此,我们调查的影响对骨髓瘤LIR-1失败。在此,我们研究了影响LIR-1阻塞NK - 92以及一组肿瘤细胞系包括MM。据我们所知,这些实验提供第一个数据有关的影响孤立LIR-1抑制NK细胞对骨髓瘤细胞溶菌作用。此外,他们提供的第一功能研究LIR-1毫米和其他肿瘤实体,考虑其广泛分布在组织。

2。材料和方法

2.1。细胞

除非另有说明,所有的媒体和补充从生活中获得的技术。自然杀手细胞nk - 92是培养与伯爵alpha-MEM补充盐和谷酰胺,12.5%马血清,12.5%胎牛血清,0.2毫米肌醇(Sigma-Aldrich), 0.1毫米2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 0.02毫米叶酸(Sigma-Aldrich)和1% PenStrep。细胞分裂每隔两天,共收到了200个U /毫升rhIL-2 (CellSystems)新鲜培养基。骨髓瘤细胞系MOLP-8在RPMI1640培养FCS 20%和1% PenStrep IM-9 RPMI 8226年,HL60, K562收到同样的媒介,但只有10% FCS抗生素。COS-7细胞在DMEM培养PenStrep FCS为10%和1%。JEG-3是生长在火腿的F12 PenStrep FCS为10%和1%。

2.2。流式细胞术

单克隆抗体(mAb)藻红蛋白(PE)共轭CD2(战- 2.10,BDPharmingen) CD159a (Z199,贝克曼库尔特),CD85j (HP-F1,贝克曼库尔特);太平洋Blue-conjugated CD16 (MOPC-21 BD Pharmingen);异硫氰酸荧光素(FITC)共轭CD25 (B1.49.9,贝克曼库尔特)和anti-IgG(山羊多克隆anti-mouse免疫球蛋白,Abcam);allophycocyanin (APC)彩色CD56 (B159 BD Pharmingen)以及适当的同形像控制。非结合的anti-HLA-I (HP-1F7)是来自圣克鲁斯,anti-HLA-G (MEM-G / 09年)和e (MEM-E / 08年)获得Abcam。7-Amino-Actinomycin D(7操弄,BD Pharmingen)被用于分析死亡细胞。20μL从B试剂用于每个样本块不具体的绑定(Ortho-Clinical诊断)。细胞抗体孵育或同形像控制在4°C 30分钟,与PBS洗,如果合适,沾洗二次抗体紧随其后的是一个额外的步骤。所有样品都是另外沾7法。荧光测量在BD FACSCanto二流式细胞分析仪和BD FACSDIVA软件v.6.1.3(正)是用于数据分析。

2.3。与LIR-1 COS-7细胞的转染

作为免疫印迹实验,积极控制COS-7细胞转染对LIR-1 pCMV6-AC向量编码(OriGene)或pCMV6-XL5模拟控制(OriGene),使用FuGene高清转染试剂(Promega) [21,22]。所有步骤都是按照制造商的指示执行。向量乘以转换的E。coli cells (One Shot TOP10/P3 competent cells) with subsequent purification of the plasmids (Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit).

2.4。免疫印迹分析

免疫印迹分析效应和目标细胞表面分子的表达(23,24]。蛋白质分离,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)在减少的条件下。在硝化纤维膜凝胶(技术)涂抹(绘画纸)。膜被封锁一小时TBS-T缓冲区(0.05 Tris-HCL, 0.15 M氯化钠,0.1%渐变20)含3%脱脂奶粉。孵化anti-LIR-1 (VMP55, Santa Cruz)一夜之间完成在4°C下温柔的风潮。与TBS-T广泛的洗涤后,二次一小时孵化与horseradish-peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(研发系统)完成了额外的清洗。膜与增强化学发光彩色代理(通用电气医疗集团)和暴露在x射线胶片(通用电气医疗集团)。确认相同加载的所有胶室,从特定的抗体膜被使用Re-Blot解决方案(微孔),其次是额外的染色β肌动蛋白(ACTB C4, Santa Cruz)。

2.5。细胞毒性检测

细胞溶解决心在4小时chromium-release化验(耐腐蚀合金)根据标准协议25- - - - - -27]。简而言之,nk - 92和靶细胞被播种在新鲜培养基的前一天功能化验。第二天与100年目标细胞被标记μCi sodium-51-chromate (51 cr) 1.5小时37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。两个清洗步骤进行与PBS(技术)和试验介质(PenStrep FCS RPMI1640, 10%, 1%;生活技术),分别。细胞被resuspended的稀释细胞/ 100μl . nk - 92和肿瘤细胞在各种效应:coincubated目标(E: T)比率U-bottom微量滴定板总数为200μL分析媒介。最大溶解或自发释放(SR) 51铬诱导Triton-X或试验中100年增加5%μL靶细胞,分别。所有样品都是镀在一式三份。前4个小时的潜伏期,盘子都仔细离心机促进E: T接触。孵化和额外的离心后,25岁μL上层清液被转移到一个96孔板(96年Isoplate PerkinElmer)。每个好,150μL闪烁液添加(Rotiszint生态+,卡尔罗斯)。盘子被关闭和Viewseal箔(他一一Bio-One)。悬架是彻底混合15分钟19°C的埃普多夫全能料理机,然后以Wallac Trilux 1450 Microbeta计数器,Windows WS诉2.70.004 PerkinElmer)。特定的细胞溶解的百分比计算如下: 结果显示平均至少有三个独立的实验。在所有的实验中,SR (< 20%28]。

2.6。阻断实验

阻止抗体anti-NKG2A (CD159a、IgG2b Z199 BeckmanCoulter) anti-LIR-1 (IgG2b CD85j, 292319年,研发系统)和anti-HLA-I (HP-1-F7 IgG1, Santa Cruz),哪些块抗原,b - c, e, g接触(10,29日,30.]。IgG1(11711)和IgG2b(20116年,从研发系统)被用作同形像控制。F (ab′)₂片段(杰克逊ImmunoResearch)被用来防止ADCC [27,30.]。控制没有F (ab′)₂显式命名。毒性的试剂使用仔细排除(图8)。

2.7。屏蔽效应细胞

CRA进行如上所述。热灭活的人类血清(HS)从健康志愿者知情同意后获得的。nk - 92细胞preincubated RPMI1640 PenStrep 1%和10% HS 30分钟,保持在同一介质中额外的30分钟的孵化马伯浓度为0.1,1和10μ分别g / mL。靶细胞是如上所述。nk - 92细胞被洗两次,以避免交互的马伯后来coincubated靶细胞线。细胞修复调整的E: T的比例1.25:1,使用靶细胞/ 100μL。在一些实验中,这一步是紧随其后的是额外的预培养11μg / mL F (ab′)₂15分钟前coincubation NK和肿瘤细胞。样本中列为“未经处理”,没有F (ab′)₂使用(30.,31日]。SR总是< 20%为细胞系除了MOLP-8,显示一个不断高SR高达36% [28]。排除马伯的毒性,在四个实验nk - 92放射性标记(51 crnk),视为未标记细胞在一系列平行阻塞化验。51 crnk显示SR < 6%为所有条件标准差(SD) < 3%。没有差异相关参数F (ab′)₂,统计分析中检测到的抗体或浓度(30.]。

2.8。阻断肿瘤细胞的

靶细胞孵化了1μ克/毫升的各自的马伯的细胞密度细胞/毫升。程序和孵化时间为NK细胞所描述的一样。F (ab′)₂使用浓度为1.7μg / mL样品,在内地“未经处理”控制。肿瘤细胞培养与马伯MOLP-8和RPMI8226 SR的< 25%和11%其他细胞。

2.9。统计数据

控制的间接影响,统计解释是由多元方差分析(方差分析)。在所有的计算,具体的溶菌作用被定义为因变量。抗体,mAb的浓度,使用或不使用的目标和F (ab′)₂被定义为独立变量。只要合适,考虑变量之间的相互依赖关系。所有计算都是通过SPSS (IBM SPSS统计版19日发布19.0.0)。

3所示。结果

3.1。对nk - 92和肿瘤细胞系

nk - 92被发现表达高水平的LIR-1基于流仪分析(图1)。我们证实了高NKG2A和CD25表达,以及少量的FcγRIII (CD16) [10]。在此,但不是关于LIR-1表达式,nk - 92细胞与CD56分享重要的相似之处^明亮的子集的NK细胞(32]。

LIR-1在场对骨髓瘤细胞以及IM-9,但没有目标NKG2A细胞系表达。免疫印迹分析证实LIR-1表达式的模式,和乐队的力量代表反映了流式细胞仪探测到(图染色强度2)。LIR-1或mock-transfected以及天真COS-7担任正面和负面的控制,分别。评价HLA类我表情,K562作为消极的控制。除了K562细胞系都是先前我积极与HLA类调查为毫米(图3)[13,33]。LIR-1有广泛的配体,但其绑定属性较弱。作为HLA-G是最强的约束力的合作伙伴,我们评估HLA-G表情所有细胞系(4,6,34,35]。只有JEG-3 HLA-G阳性。因此,交互的LIR-1后来CRA仅限于其他绑定合作伙伴进行。

选择nk - 92和这些不同肿瘤细胞系而不是主细胞允许一个孤立的看待LIR-1的抑制能力。没有增加的细胞毒性的封锁NKG2A有望在随后的阻塞化验,没有目标细胞系表达唯一已知NKG2A配体HLA-E [36]。此外,nk - 92被描述在缺乏抑制吉珥分子(37,38]。

其他抑制LIRs,可以发现在NK细胞只有LIR-3 (ILT5)和LIR-8以及可溶性LIR-4的配体还没有检测到(6]。

LIR-1可能因此被认为是唯一已知主要抑制性受体在这种情况下,在高水平表达(数字1和2)。迄今为止未知的抑制性受体的影响被选择性地封锁LIR-1排除。

由于这些发现,我们认为nk - 92的使用和选择肿瘤细胞系作为一个理想的系统研究离散LIR-1对调制自然杀手细胞的细胞毒性的影响。

3.2。骨髓瘤细胞极易受nk - 92介导杀死

细胞毒性的nk - 92对肿瘤细胞株研究小组CRA在不同E: T比率(图4)[28]。毫米细胞系和IM-9被nk - 92高效细胞溶解,与最高结果IM-9 (E: T 10: 1;特定的细胞溶解69.9±6.3%),其次是MOLP-8 (29.8±3.9%), K652(22.6±7.6%),和RPMI8226 (21.3±3.6%)。HL60几乎是耐溶解(4.5±2.5%)。

3.3。阻塞的LIR-1 nk - 92不增加靶细胞溶菌作用

评估LIR-1在骨髓瘤细胞溶菌作用的影响,mab被用来阻止LIR-1 receptor-ligand交互。作为靶细胞缺乏HLA-E分子的表达,阻塞NKG2A不会改变结果,但作为负控制进行。没有显著增加的肿瘤细胞溶菌作用可以通过任何的马伯尽管高浓度(图5)。

特定的靶细胞裂解的nk - 92被发现独立于马伯浓度和类型,结果表现为手段的使用浓度(0.1 / 1/10μg / mL)或在一个单独的酒吧的浓度和马伯(CD85j、CD159a IgG2b)(图6)。MOLP-8 RPMI8226和HL60, F (ab′)的一个重要影响₂对降低裂解似乎是相关的,但它不可能被考虑。

首先可能出现的保护作用应用F (ab′)₂对降低溶解靶细胞也可以观察到的未经处理的样品,必须因此被认为是一个副作用引起的细胞培养过程。只有实验K562在同一天进行,没有F (ab′)₂和观察到的特定的K562细胞溶解实验行是一样的。这证实了文化的论文副作用负责重大变化的实验结果。

LIR-1可能影响无法测量,如果NK-activation已经最大程度上实现了抑制性受体阻断前(38,39]。白介素2 (IL)要求在细胞培养,诱导的高潜能激活受体NKp44 [- 240NK - 92],起源从迅速进步的NK细胞淋巴瘤(38,41]preactivated条件有利。

3.4。阻塞LIR-1和HLA类的我在靶细胞增加靶细胞裂解

正如所料,抗原,b - c, e, g封锁对裂解肿瘤细胞没有任何影响(图7)由于阻塞LIR-1作为唯一相关抑制NK细胞受体NK - 92已经不是调制细胞毒性。我们也决定选择性地阻止LIR-1受体在肿瘤细胞在coincubation nk - 92。虽然不可能直接改变天然杀伤细胞属性,LIR-1表达可能有助于MM阻力在迄今为止未知的方面在免疫中所扮演的角色和其规定仍然相当未知(下面讨论)。随着LIR-1表面表达增加在b细胞和DC成熟42),它可能直接参与和信息交互促进生存和增长。在我们的实验中,LIR-1表情靶细胞似乎并不负责耐溶菌作用(图7)。

3.5。马伯或F (ab′)₂没有毒性实验条件下nk - 92

排除毒性马伯,nk - 92与51铬标记和孵化与各自的马伯进行平行实验。在四个独立的实验中,没有anti-LIR-1的有害影响,anti-NKG2A或F (ab′)₂可以观察到(图8)。

3.6。F (ab′)₂肿瘤细胞溶解的稳定模式

虽然没有显著影响肿瘤细胞溶解,似乎有一个重要的影响F (ab′)₂片段(图9)。他们稳定的结果,尽管之前评估的表面分子只显示非常低的CD16(见上图)。除了离群值,使用F (ab′)₂似乎甚至马伯影响阻断实验,导致振动值在两个方向上都接近原点(a)。保留这些碎片降低相对裂解,主要MOLP-8和RPMI8226细胞有关。只有K562细胞呈现更容易NK介导细胞溶解与缺乏F (ab′)₂虽然没有在显著水平(b)。

4所示。讨论

本调查的目的是评估如果LIR-1 NK细胞抑制NK - 92对不同肿瘤细胞系介导细胞毒性。其次,存在LIR-1对靶细胞对NK细胞介导细胞溶解的影响进行验证。LIR-1被认为是唯一相关的抑制性受体nk - 92如上所述(nk - 92和肿瘤细胞株)的特征(38]。令人惊讶的是,没有抑制LIR-1对nk - 92内的影响对不同肿瘤细胞系细胞毒性检测可以检测到治疗后与特定的抗体LIR-1(数字5- - - - - -7)。

现在,LIR-1参与保护胎儿免受流产已经成为常见的免疫学知识,所以采用这种机制通过肿瘤细胞表达LIR-1配体HLA-G [43- - - - - -45]。此外,病毒表达高度密切相关的LIR-1配体为防止免疫防御和LIR-1作为受体细菌检测(5,8]。数据的特定角色,这种受体在“正常”的淋巴细胞,特别是NK细胞,是更多的冲突和罕见的。而LIR-1抑制T细胞和单核细胞活化之前已经证明,只有很少的研究集中在NK细胞调制,和更少引用实验设置中HLA-G并非出现在靶细胞(46- - - - - -48]。可用出版物强调数据证实LIR-1重要的抑制作用,但更质疑的观点可能是指实验中提到的数量没有提供明显的成果。我们将给一个简短的概述的可用的功能研究LIR-1 donor-derived NK细胞和NK细胞系为了证明可用的知识冲突。

Godal等人试图在揭示LIR-1 dNK在细胞毒性的影响对HLA-G - AML和爆炸。他们的结果表明,LIR-1只作为一个弱抑制NK细胞受体在肿瘤细胞缺乏HLA-G,但可能在较低的情况下有关吉珥表达式如干细胞移植后第一个月内(SCT) [10]。

其他作者使用仅仅HLA-transfected 721.221,小鼠细胞(P815)或未成熟树突状细胞(iDC)为靶细胞,但往往比较结果的好处从NK细胞系NK细胞的性能来源于健康的捐赠者。2008年,八幡等人进行了一系列的脱粒化验对HLA dNK类我不足721.221为了调查不同的受体参与“missing-self”识别和无法识别任何牵连LIR-1 [49]。更成功LIR-1介导的抑制是通过龙葵和Bellon测试dNK和nk - 92的细胞毒性与HLA-G 721.221和- b转染CRA后续使用阻塞抗体(39]。他们前期发现,只有15%的LIR-1积极dNK被目标刺激这些响应dNK接触和后续研究的选择。比较分析不同类型的nk - 92和dNK化验是相互矛盾的。

没有这样的冲突是由Favier观察et al ., dNK孵化和NK细胞系NKL 721.221 g1和使用阻塞Abs与LIR-1 HLA-G [50]。Vitale等也是如此。他们孵化dNK不同HLA转染细胞系在标准CRA和溶菌作用增加了LIR-1封锁,但不幸的是,没有明确的预防(ADCC)被提及的依赖抗体的细胞毒性51]。最后,报摊等人在不同的实验设置显示预期的LIR-1影响力NKL,血清素释放家庭细胞以及dNK和捐助派生LIR + T细胞(dTK) [21]。有趣的是,在所有化验dTK或dNK对721.221 - b * 2705, anti-LIR-1只能部分恢复transfection-induced抑制,指示不完整的绑定的anti-LIR-1受体或其他受体的存在除了LIR-1结合的配体。

此外,在反向ADCC (rADCC)化验dNK P815,只有少数克隆被LIR-1抑制。在这里,NK细胞克隆可预测的结果显示表现出低于细胞系(21]。

总结现有的数据,比dNK NK细胞系似乎更可靠的差别有关LIR-1介导对这些细胞毒性。结果多克隆dNK显示之间的高度差异不同的克隆,大多不会在细节特征。成功LIR-1介导抑制HLA-transfected 721.221有大量被证明。参与额外的未被发现的受体可能并不总是被排除在外,和不同类型的分析执行相同的效应和目标细胞可能导致非常不同的结果。调查的细胞毒性dNK donor-derived肿瘤细胞很少,没有足够的信息可用的角色LIR-1 HLA-G的缺失。目前意见的抑制性影响LIR-1主要是基于调查feto-maternal接口或已经获得的设置中,只有一个HLA分子出现在目标cells-mostly HLA-G或- b 721.221。做实验不充分覆盖广泛的绑定能力LIR-1 HLA I类。

虽然我们都知道问题NK细胞系的可比性donor-derived NK细胞(dNK),我们选择一个实验设置,允许研究孤立LIR-1对细胞毒性的影响。我们的主要目标是提供一个模型系统来克服使用的惯例转染靶细胞在细胞毒性分析。意识到未来的必要性的努力证实目前发现在一个光明面板的细胞细胞系,这些结果可能会提供一个新的LIR-1理解的第一步。

可用数据不充分支持的直接含义LIR-1在NK细胞的抑制作用。Upregulation受体并不一定有利于免疫抑制,但可能与记忆的收购。LIR-1在B细胞表面表达增加,DC成熟(42)以及在巨细胞病毒感染(52和收购t细胞记忆53,54]。我们还假设越来越LIR-1表达式与NK细胞记忆的收购(55),支持高LIR-1水平的监测对NK细胞导致艾滋病毒感染的有效溶解直流(56]。

LIR-1似乎有很高的影响调节激活和抑制免疫反应之间的平衡(42]。它可能通过合作与其他受体就像吉珥,支持集群的mhc i (57]。HLA-G是唯一LIR-1配体在细胞表面产生共价二聚体和三聚,聚合受体的激活可能是一个先决条件。已经提出,这些复合物增加对LIR-1贪欲,解释差异LIR-1其配体的亲和力相对较低和高相关性的上下文中胎儿公差(58]。人类——或者异形的复杂LIR-1受体及其配体的形成可能是一个关键因素,调节NK细胞抑制的程度。,LIR-1可能作为一个变阻器的NK细胞活化。这个假设符合LIR-1感觉整个HLA类的能力我在人体组织表达。增加在衰老以及记忆收购可以提升所需的阈值激活一个平行的过程中引起的增加激活NK细胞受体重复病原体接触。

5。结论

在目前的研究中,没有观察到改变NK介导细胞毒性与毫米后LIR-1的封锁。在此设置是唯一功能抑制受体,主要已知的副作用,例如,吉珥被排除。这个意外的结果打开门富有成果的讨论LIR-1交互的复杂性及其潜在作用在肿瘤的防御。很可能现在对LIR-1在免疫调节功能的成见远远落后于实际的影响。我们假设LIR-1有关键作用的变阻器NK细胞调制和强烈参与收购NK细胞记忆。

利益冲突

作者没有财务利益冲突。

确认

作者感谢Tumorimmunology实验室的成员广泛讨论;流式细胞仪核心分类单元汉堡大学医院(尤克里里琴)有用的援助;d . Niedzielska灵活组织和美国基什内尔在尤克里里琴同位素实验室的设施;教授b Fehse批判阅读的论文。

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