非专业吞噬作用可促进疱疹病毒进入眼细胞

摘要

吞噬是一种主要机制，由先天免疫的介质挫败微生物感染。在这里，我们证明了人类疱疹病毒可能已经进化出一种共同的机制，利用吞噬样包夹进入眼细胞。单纯疱疹病毒-1 (HSV-1)导致角膜角膜炎，巨细胞病毒(CMV)与免疫缺陷个体的视网膜炎相关。第三种疱疹病毒，人类疱疹病毒-8 (HHV-8)，是卡波西肉瘤(一种常见的与艾滋病相关的眼睑和结膜肿瘤)发病的关键。利用激光扫描共聚焦显微镜，我们发现这三种属于疱疹病毒三个亚科的病毒都能通过诱导富f -肌动蛋白的膜突起而成功感染眼部细胞。细胞松弛素D和拉楚库林B是f -肌动蛋白聚合和膜突出形成的抑制剂，能够阻断这三种病毒的感染。通过阻断磷酸肌苷3激酶信号传导也可以看到类似的抑制作用，磷酸肌苷3激酶是微生物吞噬所必需的。透射电镜数据显示，人角膜成纤维细胞检测HSV-1，人视网膜色素上皮细胞检测CMV，人结膜上皮细胞检测HHV-8，与假足样膜突出物促进病毒被眼细胞摄取的可能性一致。我们的发现提示了一种新的机制，通过这种机制，非专业吞噬介质可以被人类疱疹病毒感染。

1.介绍

吞噬作用基本上是内吞作用的形式，其中颗粒被细胞膜突起捕获并包围。我们对吞噬作用的知识主要来自巨噬细胞等巨噬细胞和中性粒细胞，这与抗微生物侵袭和去除死细胞[1］.然而，在许多情况下，还显示了包括上皮细胞和眼源的成纤维细胞的非专业吞噬细胞具有吞噬细胞邻近凋亡细胞或花液碎片的能力[1- - - - - -3.］.众所周知的实例包括睾丸中的Sertoli细胞[3.]和视网膜内的视网膜色素上皮细胞[3.］.最近，我们证明了单纯疱疹病毒-1（HSV-1）具有利用吞噬作用的能力，以促进其进入角膜成纤维细胞[4］.在米米变形虫病毒上也有类似的发现[5，6］.非专业吞噬作用也由吞噬细胞上相应受体对配体的识别引发。这导致在目标粒子周围有一个特化的假足样延伸的质膜。f -肌动蛋白在延伸下的局部重组和支持重组的收缩马达提供了捕获粒子的驱动力[2，7，8］.与巨噬细胞和中性粒细胞的专业吞噬作用类似，非专业吞噬作用也需要磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号[6］.

Herpesviruses在人类中普遍存在[9］.绝大多数成年人对多种疱疹病毒的血清呈阳性反应，这些病毒会导致终生感染，而且几乎所有病毒都能引起眼部症状[9，10］.疱疹病毒科可能有一百多个已知成员，它被分为三个亚科。在人类疱疹病毒中，阿尔法疱疹病毒亚科由单纯疱疹病毒-1 (HSV-1)， β疱疹病毒亚科由巨细胞病毒(CMV)，伽马疱疹病毒亚科由人类疱疹病毒-8 (HHV-8) [9］.最常见的眼部感染是由HSV-1引起的，这是一种被广泛研究的导致疱疹基质角膜炎(HSK)的原因，这是一种致盲的眼病。此外，HSK还与睑缘炎、树突状角膜炎、盘状间质水肿和结膜炎有关[11］.巨细胞病毒和HHV-8在眼部疾病中的参与大多局限于免疫功能低下的人群，包括艾滋病患者和器官移植受者[10］.巨细胞病毒曾在相当数量(30%或更多)的艾滋病患者中引起视网膜炎。最近，这种情况已经通过引入高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)得到控制。然而，与HHV-8相关的眼部问题在艾滋病患者中仍然很常见，他们经常遭受眼睑和结膜肿瘤的折磨[12］.

Herpesviruses进入宿主细胞的机制因单独的病毒而变化[4，13- - - - - -15］.例如，前面讨论的三种疱疹病毒都使用不同的进入受体，在感染和建立潜伏期时更倾向于某些细胞类型，并使用不同的进入模式[16］.在HSV-1的情况下，内吞作用和非专业吞噬作用在许多细胞类型的感染中起主导作用[4，14，17］.最近的研究表明，HSV-1进入可能是非典型内吞作用，因为它不通过形成克拉棘涂层凹坑或Caveolae而介导，并且它可能或可能不是pH依赖性[18，19］.相比之下，CMV和HHV-8可通过网格蛋白包被的胞吞杯形成进入细胞，而进入细胞取决于pH值[15］.虽然内吞作用的意义已为人所知，但疱疹病毒如何感染眼源细胞尚不清楚，其中许多眼源细胞具有免疫特权[20.］.肌动蛋白细胞骨架是否在感染开始中起直接作用尚不清楚，同样，疱疹病毒入侵过程中假足样突起的重要性也未被描述。在这里，我们展示了一个独特的共同点，在进入机制方面的三个代表成员疱疹病毒亚科。我们发现，含有假足样膜突起的f -肌动蛋白有助于病毒进入眼球来源的靶细胞类型。与吞噬作用类似，这种进入机制也受PI3K信号通路控制。非专业吞噬过程中形成的突起可能促进病毒摄取，因为突起形成的抑制可以显著抑制病毒进入细胞或摄取细胞。我们的发现也证明了一种可能的方式，通过这种方式，疱疹病毒可能已经进化到逃避吞噬的固有介质的中和作用。

2.材料和方法

２.１.细胞培养

视网膜色素上皮（RPE）细胞在Dulbecco的改性鹰（DMEM）培养基中生长，其补充有含有青霉素和链霉素的10％胎牛血清（FBS）[21］.原代培养的人角膜成纤维细胞(CFs)在含10%胎牛血清和5%小牛血清(CS)的DMEM培养基中生长，如前所述[22］.人结膜上皮细胞(HCE)原代培养物由Dr. Ilene K. Gipson (Schepens Eye Research Institute;哈佛医学院)。HCE细胞在含有BPE(牛垂体提取物)和EGF (0.2 ng/mL)无血清的GIBCO角质形成细胞培养基上培养[23］.CMV病毒采用糖蛋白B (Virostat Inc.， Portland, ME)单克隆抗体检测。用针对HHV-8包膜糖蛋白K8.1A的单克隆抗体和fitc结合的二抗检测HHV-8病毒。

２.２.病毒

的β-半乳糖苷酶表达HSV-1 gL86, gfp -1表达HSV-1 (K26GFP-HSV-1)，巨细胞病毒(CMV;本研究采用汤恩株RC256和HHV-8病毒(野生型和rKSHV.152)。HSV-1 gL86在gL补体细胞(79B4细胞)中增殖。表达gfp的HSV-1 (K26GFP)病毒在Vero细胞中生长[4］.如前所述，病毒通过蔗糖密度梯度纯化[22］.

２.３.电子显微镜

CF、RPE和HCE细胞在Lab-Tek玻片和anpore井(Nalge Nunc)中培养(约1.510⁵细胞/well)用纯化的HSV-1、CMV和HHV-8在50-100 MOI下感染90-120分钟，如前所述[4］.用无血清缓冲液冲洗感染的细胞，并用1％锇氧化锇固定10 s，然后立即进行1小时（2.5％戊二醛，在100mM Cacofocylate缓冲液中2％多聚甲醛，pH7.4）的醛固定。用100mM的冷脱水缓冲液将细胞冲洗三次5分钟，在1％锇氧化锇中固定1小时，用乙酸铀酰染色，脱水通过梯级乙醇系列，最后用嵌入嵌入。对于透射电子显微镜（TEM）（JEM-1220; JEOL USA Inc.）图像在1,000-600,000倍，点-0.36nm（3.6a）和晶格-0.2nm（2 a）的图像温度下捕获图像，ACC电压40-120 KV使用Gatan相机（数字CCD; GATAN Inc.）和Gatan数字显微照片（DM）V2.5采集软件。

２.４.间接免疫荧光法

在Lab-Tek室载玻片中培养的靶CF，RPE和HCE细胞被疱疹病毒感染90-120分钟。然后染色细胞。对于细胞表面免疫荧光，将细胞与初级抗体在4℃下孵育45分钟，用冷PBS洗涤10次，并用丙酮固定在-20℃下10分钟。通过抗GB（CMV）和抗K8.1A（HHV-8）抗体和FITC缀合的二抗检测HHV-8和CMV病毒。肌动蛋白纤维还用10nM罗丹明 - 共轭的阴蛋白（分子探针，Carlsbad，California，USA）染色，以比较与未感染的细胞相比受感染细胞中产生的富含肌动蛋白富突起的数量。在安装在Vectashield安装介质（矢量实验室，Inc.Burlingame，CA）之前，将细胞洗涤。Leica共聚焦显微镜SP2用于成像。

2．5．病毒进入试验

病毒进入试验是基于定量β- 通过可溶性O-硝基 - 苯基从HSV-1基因组表达的-Galactosidase- d -半乳糖苷(ONPG, Pierce Biotechnology)， 3 mg/mL．同样的巨细胞病毒用ATCC中-半乳糖苷酶表达的报告病毒。采用荧光读数法检测HHV-8病毒进入。CF、RPE和HCE经模拟处理或用含Cyto D(0.5和1.0)的培养基处理μ.g/mL)、Lat B (0.25-2.5 .μ.M)、pi3激酶抑制剂(LY294002)和活性化合物LY303511。在平行实验中，CF、RPE和HCE细胞分别转染PI3K显性阴性表达质粒(ΔiSH2)或对照质粒，然后病毒感染[24］.

3。结果与讨论

通过监测用疱疹病毒感染后眼细胞发生的形态变化，我们开始调查。最初的目标是突出疱疹病毒，属于三个不同的亚属植物的方式差异，感染了眼源的靶细胞。我们使用初级人体角膜成纤维细胞（CFS），人体结膜上皮（HCE）和人视网膜颜料上皮（RPE）细胞进行含HSV-1（K26GFP），CMV（AD169）和HHV-8（圣华盛顿西雅图大学J.Vieira提供的礼貌。令我们惊讶的是，三种不同的疱疹病毒感染三种不同的细胞类型导致了常见的形态变化，这是通过致曲蛋白富血浆膜突起的透明增强来表示（图1(一)-1（C））。突起为1.0-10 μ.m大，通常沿各个细胞表面均匀分布（图1(d) -1(f))。HSV-1侵袭CF时可见突出物(图)1(一)和1（d）），CMV侵袭RPE细胞（图1（乐队1（e））和HHV-8侵袭HCE细胞（图1(c)和1(f))。

图1

Herpesvirus感染导致F-肌动蛋白的突起的数量增加。（a） - （c）在添加病毒（疱疹病毒型-1）之前和之后，在添加病毒之前和之后的每种细胞的基础上进行计数（HSV-1），缩细胞病毒;（CMV）和人疱疹病毒-8;（HHV-8））。在该和所有其他随后的实验细胞中，用于HSV-1的HSV-1，人视网膜颜料上皮（RPE）细胞的角膜成纤维细胞（CFS）（A），以及用于HHV的人结膜上皮（HCJE）的原代培养物 -8（c）感染。进行四个独立实验以记录数据。富含曲素的突起的数量作为误差条显示出标准偏差的平均值。（d） - （f）显示用指定病毒挑战的细胞的共焦图像。在安装（Vectashield安装介质）之前，用10nM罗丹明 - 共轭的阴泡蛋白肽固定，渗透细胞固定，渗透和染色。所有共焦（Leica SP2）图像都被捕获在63倍目标。框中的图像的放大视图显示在它们旁边并标记相同。 CMV and HHV-8 viruses were identified by monoclonal antibodies against CMV envelope glycoprotein gB and HHV-8 K8.1A (1 : 50) followed by secondary antibody treatment conjugated to FITC.

由于已经提出了HSV-1的吞噬样摄取，而且许多眼细胞类型都可以进行吞噬[4]，我们决定产生超微结构证据来支持这种可能性，即投影可能也有助于病毒包夹。因此，如前所述[4[透射电子显微镜（TEM）用病毒感染的眼细胞进行（用于HSV-1，CMV的RPE，HHV-8的HCE）进行。同样，通过延伸由血浆膜（在所有情况下可见质膜的连续性）形成的突起的可能重要性由它们旁边的病毒颗粒存在（图2)．1型单纯疱疹病毒(图2(一)、巨细胞病毒(图2(b))和HHV-8(图2(c)在由质膜突起形成的杯内均可见。在许多情况下，突出物似乎能捕获单个病毒颗粒(图)2（乐队2（C））。

图2

t 疱疹病毒可以通过膜突出物被内化，膜突出物的形成阻断了疱疹病毒的进入。(a) - (c)展示了感染疱疹病毒的人眼细胞的高分辨率透射电子显微照片。面板中的箭头表示病毒与细胞突出物的关联。(d) - (f) f -肌动蛋白依赖的疱疹病毒进入眼细胞。肌动蛋白解聚剂(细胞松弛素D;Cyto D和latrunculin b;Lat B)检测病毒进入眼细胞的能力(CF (d)检测HSV-1, RPE细胞检测CMV (e)， HCjE检测HHV-8 (f))。在暴露于所示病毒之前，按指示浓度用Cyto D或Lat B处理细胞90分钟。星号表示与对照组有显著差异(，-测试，误差柱代表标准差)。

为了产生生化证据支持膜突出在生产性病毒摄取中的作用，研究人员检测了f -肌动蛋白聚合抑制剂阻断感染的能力。使用的抑制剂是细胞松弛素D (Cyto D)和latrunculin B (Lat B)，两者都可以阻断质膜形成突出所需的F-actin聚合[25，26］.对于HSV-1，通过测量分析的测量法测定病毒吸收β半乳糖苷酶表达报告病毒HSV-1(KOS) gL86。如前所述，早期病毒基因的转录允许表达β-半乳糖苷酶活性，加入其可溶性底物ONPG后用分光光度计读取[27］.一个类似的β以-半乳糖苷酶表达为基础的空斑实验用于CMV，以感染细胞中GFP表达作为HHV-8感染HCE细胞的标志[4］.在所有病例中可以看到，在先前确定的剂量下，这两种抑制剂对病毒感染都有显著的负面影响。大约50-80%的HSV-1进入CF被抑制剂阻断(图)2（d））。同样，40-75％的药物治疗的CMV感染细胞显着抑制病毒进入（图2(e))，在Cyto-D和la - b处理的HCE细胞中观察到GFP表达细胞减少40 - 60%(图)2(f))。因此，膜突起形成是对眼细胞的Herpesvirus感染的共同和重要要求。

最后，为了增加更多证据，支持在疱疹病毒被眼细胞摄取过程中膜突出形成和吞噬作用的参与，我们决定阻断pi3k介导的信号通路，这是吞噬杯形成所必需的[6］.如图所示3(一个)- - - - - -3 (c)，经pi3激酶抑制剂预处理的眼细胞(LY294002) [28，29]通过HSV-1显示进入下降（图3(一个))、巨细胞病毒(图3 (b))和HHV-8(图3 (c))．当细胞首次转染缺失PI3K的p110催化亚基结合域(ΔiSH2)的显性阴性PI3K突变体的表达结构时，也可以看到类似水平的下降[30.然后用疱疹病毒感染（图3(一个)- - - - - -3 (c))．在所有病例中，很明显，PI3K信号对于病毒的有效感染是必需的。为了确定PI3K阻断的特异性，我们使用了与LY294002高度相关的化合物LY303511 (Calbiochem Inc.)。很明显，前者对HSV-1没有显著影响(图1)3(一个))、巨细胞病毒(图3 (b))，或HHV-8(图3 (c)） 入口。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图3.

(a) - (c)抑制PI3激酶信号通路负向影响疱疹病毒进入细胞。用所示化合物处理细胞或转染pi3显性阴性质粒(其次是HSV-1 (a)、CMV (b)和HHV-8 (c)感染。病毒进入试验的结果显示。

总之，我们展示了眼源细胞的Herpesvirus感染的一些独特特征。显然，眼细胞可以通过诱导基于F-肌动蛋白的膜突起来对三种代表性疱疹病毒亚家族构件进行响应。突出形成的任何堵塞大大限制了病毒进入（图1)和抑制PI3K信号，这是吞噬过程中f -肌动蛋白重塑的必要条件，也可以阻止疱疹病毒进入眼细胞(图)3.)．PI3Ks是由酪氨酸磷酸化激活的调控亚基(p85)组成的细胞异二聚酶，它招募被催化亚基(p110)磷酸化的肌醇磷脂[31- - - - - -34］.然后，脂类作为第二信使，控制其他激酶的磷酸化，如Akt/PKB，一些蛋白激酶C亚型，环状amp依赖的蛋白激酶A，以及核糖体S6激酶p70和p85 [35］.PI3K调节吞噬通路的能力与疱疹病毒调节其活性的能力相结合，可能是病毒利用吞噬进入的重要机制。我们的观察也得到了这样一个事实的支持:许多疱疹病毒的突出形成可能需要额外的细胞内信号，例如GTPases Rho家族的激活[15，36］.我们的研究最重要的贡献是证明了在眼细胞型疱疹病毒感染中，膜突出的参与可能是常见的，也许是至关重要的。疱疹病毒倾向于通过无症状脱落传播，这使得看起来正常的人将病毒传播给健康的人[37］.在缺乏针对许多疱疹病毒的有效疫苗的情况下，迫切需要新的和有效的广谱预防药物，以防止疱疹病毒传播以惊人的速度增长。在这方面，我们的研究确定了一个重要的共同目标，未来干预对抗多种疱疹病毒。可能不仅仅是疱疹，还有许多其他不相关的病毒也开始了它们的感染之旅通过与膜突出物相互作用并利用吞噬作用或一种非常相似的感染机制。我们的最终目标是确定病毒粒子如何成功退出吞噬酶体的降解。

致谢

本文得到了NIH RO1 GRANTS AL057860（DS）和P30 EY01792（核心授权）和Lew Wasserman Merit奖项支持，从研究中获得Lew Wasserman Merit奖项，以防止失明（D. Shukla）。V. Tiwari由伊利诺伊州预防失明（ISPB）获得伊利诺伊州社会的赠款奖。作者感谢Kahn C. Roland博士（哈佛医学院）为他们提供PI3K主导负面构建体。Beatrice Yue博士（伊利诺伊州芝加哥，美国伊利诺伊大学伊利诺伊州伊利诺伊大学）和伊琳吉普森（哈佛医学院，美国哈佛医学院），人类CF和人类结膜上皮细胞

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