HMGB1表达增强可能导致Th17细胞活化在风湿性关节炎

文摘

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病与Th17细胞有关,但高机动组框的影响染色体蛋白1 (HMGB1)和Th17-associated因素和HMGB1在RA的关系仍然未知。在目前的研究中,我们调查了HMGB1的mRNA水平,RORγt, IL-17外周血单核细胞(PBMCs)风湿性关节炎患者通过定量实时PCR (RT-qPCR), HMGB1的浓度,IL-17, IL-23等离子体被ELISA检测。然后,HMGB1 Th17细胞分化的影响进行了分析体外。临床研究表明,HMGB1的mrna, RORγt, IL-17患者高于健康控制(),特别是在活跃的RA患者()。等离子HMGB1、IL-17 IL-23 RA患者也高于健康控制();之间存在着正相关HMGB1表达水平和c反应蛋白的数量,人,射频等离子体。在体外,IL-17-produced CD4⁺T细胞增加了100 ng / mL rHMGB1 12 h,这表明增加HMGB1可能导致Th17细胞活化在RA患者。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病,其特征是在小关节慢性炎症导致关节软骨和骨的破坏。肿瘤坏死因子-α、il - 1和IL-17以及T, B淋巴细胞和巨噬细胞与RA的发病机制(1- - - - - -3]。最近,高机动组框染色体蛋白1 (HMGB1),非组蛋白的核dna结合蛋白质,是被证明是一个有效的促炎介质在类风湿性关节炎(4- - - - - -7]。增加HMGB1被发现在RA患者的关节8- - - - - -10),HMGB1转移到健康老鼠联合可能诱发关节炎[11]。HMGB1分泌或释放淋巴细胞,死和/或凋亡细胞(12- - - - - -15]。先前的研究已经表明,HMGB1在环境贡献促炎如il - 6、il - 1β,il - 10由巨噬细胞分泌,维持炎症(15]。很明显,il - 6和il - 1β可以'天真的CD4⁺T细胞分化成Th17细胞(16]。

HMGB1是否参与了RA的发病机制通过促进Th17细胞激活还不清楚。在目前的研究中,我们研究了HMGB1的表达水平和Th17-associated因素在RA患者中,分析它们之间的关系,探索HMGB1在Th17细胞分化的潜能体外。

2。患者和方法

2.1。病人

80 RA患者参加江苏大学附属医院被包括在本研究从2008年1月至2009年9月。在80名患者,59岁女性和21岁男性,从36到80岁不等。48例患者在活跃的阶段,和32名患者在不活跃的阶段。建立了诊断根据美国风湿病学院(ACR)标准(17)和疾病活动分数计算出28个关节(DAS28)。48个病人在活跃阶段untreament在过去两年没有陪其他慢性疾病;所有的48例包括8个40岁男性和女性,年龄是43±10年,疾病持续时间为10.3±4.5个月,DAS28的范围是4.21 - -6.32(平均值为5.60±0.78);32例RA患者在不活跃的阶段,6个男性和26岁女性,年龄是49±13年,病程为40.1±25.7个月,DAS28范围是1.92到0.67(平均为1.75±0.23)。50名健康志愿者,38岁女性和12男性范围从28到41岁,作为控制。本研究经伦理委员会批准江苏大学的附属医院。所有人都被告知共识。

2.2。试剂

rHMGB1表示在大肠杆菌(大肠杆菌由Ni-column)和净化。从产生的控制蛋白质eGFP大肠杆菌并通过相同的方法纯化。

2.3。血液样本

从健康志愿者外周血样本收集和病人。集合管含有肝素钠0.2毫升。血液样本使受离心作用在1000 r / min 4°C 5分钟,然后上层清液收集和储存在−70°C,和沉积物被标准Ficoll-Hypaque密度离心PBMCs分开。试剂盒被添加到PBMCs总RNA。

2.4。引物设计

根据基因序列,由总理5.0软件设计并合成引物由上海Sangon生物工程技术和服务公司。所有的引物序列见表1。

2.5。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

制造商的指示后,从PBMCs总RNA提取与试剂盒(美国表达载体)。互补脱氧核糖核酸合成了反转录试剂盒(TOYOBO、日本)。所有RNA样本加热在65°C 10分钟变性的二级结构模板然后放入冰5分钟。总RNA (1μg)是相对地转录总量的20倍μL,含有益生元(dT) 1μL核苷酸(10毫米)2μL, 5×RT缓冲区4μReverTraAce (100 U / LμL) 1μL核糖核酸酶抑制剂1μL, DEPC免费H₂O 20μL,反应条件:20分钟42°C;5分钟99°C;4°C为5分钟。互补脱氧核糖核酸是储存在−20°C。

2.6。构建重组质粒校准器

进行PCR扩增的Thermon Hybaid系统(美国埃普多夫)。程序由一个初始变性步骤5分钟在94°C紧随其后的是30个周期,每个周期组成的30年代变性步骤在94°C, 30年代退火56°C和30年代在72°C扩展。反应是在最后5分钟完成扩展在72°C。纯化HMGB1, RORγt, IL-17,β肌动蛋白聚合酶链反应碎片都被转换成了PMD18-T向量(美国英杰公司)建立重组质粒PMD18-HMGB1, RORγt, IL-17,β肌动蛋白。所有这些重组质粒转化为主管大肠杆菌DH5α、转让1.5%琼脂Amp-resistant板,然后在37°C培养12 ~ 14 h。积极的最初被克隆测序。阳性克隆的一部分被进一步放大和提取和准确地量化核酸acid-protein紫外线仪器。连续稀释10倍的重组质粒dna被用作校准器和存储−20°C到使用。

2.7。RT-qPCR-Detected目的基因表达

目的基因表达(HMGB1 RORγt, IL-17)检测到定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR),和所有的样品被校准β肌动蛋白。所有PCR反应进行使用Rotor-Gene 6000系统(Corbett研究,澳大利亚)总量的20倍μL,包含1μL cDNA、10μL 2×sybr1预混料(豆类,中国),0.3μL 10μ每个引物,和8.4μL水。的特异性扩增产品控制使用一个融化曲线分析。ROR的拷贝数γt, IL-17,β肌动蛋白转录与Corbett样本计算软件根据相应的标准曲线。基因的拷贝数/ %β肌动蛋白基因的比值来表示。没有模板负控制还包括在每个实验中,测量样品一式三份。

2.8。rHMGB1 Th17细胞分化在体外的功能

CD4⁺从C57BL / 6小鼠脾脏T细胞是由磁柱;1×10⁶/好细胞放入预涂24-well anti-CD3盘子,anti-CD28,拘谨的- 1640年培养包括10% FCS公司5%₂,37°C,不同剂量的rHMGB1细胞被刺激。eGFP和有限合伙人大肠杆菌被用来控制。收集细胞后0、3、6、9、12、24、48小时和上层清液被用来检测相关的细胞因子如前所述。

2.9。酶联免疫吸附试验(elisa) IL-17 IL-23

HMGB1的水平,IL-17 IL-23在等离子体或细胞培养上清液通过elisa测定,按照制造商的协议(美国eBioscience)。所有样品都是一式三份。

2.10。流式细胞术分析

流式细胞术分析的过程进行了描述(其他地方18]。简单地说,1×10⁶PBMCs是沾anti-CD3-PE-cy5 (eBioscience) anti-CD8-FITC (eBioscience)和anti-IL-17-PE (eBioscience)。1×10⁶CD4⁺从小鼠的脾脏T细胞沾anti-IL-17-FITC (eBioscience)。数据采集的彩色细胞应用库尔特史诗XL血细胞计数器(贝克曼库尔特)和分析软件WinMDI(版本2.9)。

2.11。统计分析

所有使用SPSS17.0统计软件进行统计分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)的文本和数据。比较配对或未配对组进行使用适当的学生的t以及。对于非参数数据,由Mann-Whitney两组之间的差异进行了分析测试。斯皮尔曼的相关性是用来测试两个连续变量之间的相关性。P< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。电泳鉴定扩增子的

ROR HMGB1的扩增子长度γt, IL-17,β肌动蛋白是233、171、231和265个基点,分别,这是符合预期的数据。积极的克隆重组质粒被测序鉴定。这些目标基因序列按照基因库seqence(详细数据未显示)。

3.2。线性范围和再现性

重组质粒dna的检测范围从10到10⁸复制和变异系数值从2.20%到8.32%不等。扩增效率范围从0.88到0.92,> 0.99。

3.3。ROR HMGB1的水平γRA患者的t, IL-17 mRNA

ROR HMGB1的表达水平γt, IL-17 mRNA的RA患者和健康对照组被RT-qPCR测量。如图1的mrna Th17-associated细胞因子和转录因子在RA患者PBMCs显著增加,尤其是在RA患者的活跃阶段,是完全不同于在不活跃的阶段的患者和健康对照组()。

3.4。HMGB1的mRNA水平之间的相关性和th17 Cells-Related因素

评估HMGB1的mRNA水平之间的关系,th17 cells-related RA患者的因素。我们检查了HMGB1的mRNA水平之间的相关性和Th17 cells-related PBMCs RA患者的因素。其中有一个显著的正相关关系(图2)。

3.5。在从RA患者血浆细胞因子浓度增加

等离子体浓度HMGB1、IL-23 IL-17衡量ELISA每组如表所示2。的Th17细胞相关细胞因子显著增加在RA患者的血浆从活跃的阶段,但不活跃的RA和健康对照组没有明显的区别。HMGB1之间的相关性分析,IL-23 IL-17和其他临床目标积极RA患者的血清显示有显著正相关(表3)。

3.6。CD3频率的增加⁺CD8^{- - - - - -}IL-17⁺PBMCs从RA患者的T细胞

流式细胞仪是用来评估CD3的频率⁺CD8^{- - - - - -}IL17⁺PBMCs从患者的T细胞和控制,结果表明,CD3⁺CD8^{- - - - - -}IL17⁺T细胞在患者的活跃阶段(1.36±0.98%)高于控制(0.39±0.16%),和差异统计学意义(P< 0.05),而没有非活动阶段的患者之间差异显著(0.45±0.23%)和控制(图3)。

3.7。的信使rna表达水平Th17 rHMGB1-Stimulated小鼠CD4闲暇的因素⁺T在体外

进一步证实HMGB1和Th17细胞之间的关系,rHMGB1被用来刺激CD4细胞⁺T细胞在体外然后检测的mRNA水平Th17细胞相关因素RT-qPCR。我们的数据表明,rHMGB1可以提高表达水平Th17闲暇的因素和水平改变剂量和时间由rHMGB1刺激。-100年0.1 ng / mL rHMGB1刺激剂量范围,Th17-related因素表达是剂量依赖性,100 ng / mL是最好的浓度。细胞被收集在不同的点rHMGB1刺激后,和Th17闲暇的因素是在12 h峰(图4)。

3.8。CD4⁺IL-17⁺rHMGB1刺激T细胞比例增加

流式细胞仪分析显示IL-17-producing细胞(Th17)的比例最高(1.50±0.43%),而100 ng / mL HMGB1被用于12 h,它显示与其他组相比显著差异(P< 0.05)(图5)。

4所示。讨论

Th17细胞及其相关的特定转录因子或细胞因子被认为是重要的炎症介质和自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎,但相对很少有人知道HMGB1角色和Th17 HMGB1在RA之间的关系。在目前的研究中,我们发现,在RA患者,HMGB1的mrna, RORγt, IL-17 PBMCs HMGB1的水平,IL-17, IL-23等离子体增加,还有HMGB1 - Th17-cell之间的正相关关系,尤其是在RA的活跃阶段。进一步分析表明,HMGB1及Th17相关因素也有正相关与其他RA临床相关的检测。研究HMGB1和Th17细胞的关系,我们在CD4探索HMGB1的功能⁺T细胞在体外和观察到rHMGB1可以增强Th17细胞的比例。相同的源蛋白质和内毒素LPS功能。我们发现HMGB1-triggered RA可能通过Th17通路在RA发病机理。

有两种途径的HMGB1交通从细胞到细胞外,一个是分泌激活先天免疫细胞,另一种是发布的死亡或凋亡细胞(13- - - - - -16]。HMGB1在环境参与了先天和适应性免疫系统7]。之前的数据显示,HMGB1可能'天真的CD4细胞⁺向辅助T 1 T淋巴细胞表型。越来越多的证据表明,HMGB1作为早期炎性介质在关节炎的发病机制11,19]。

Th17细胞和他们的效应细胞因子被认为是重要的因素在瀑特异性自身免疫性疾病,尤其是之前被认为调解Th1细胞(20.- - - - - -25]。Th17细胞发病机制已成为至关重要的效应细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎(20.,21]。HMGB1的多种促炎细胞因子的诱导物,如il - 1β和il - 6,这被视为重要的介质诱导Th17细胞(26]。最近,刘报道,HMGB1可以通过TLR4通路诱导IL-23和IL-23 IL-17水平可以提高27]。菲利帕表明IL-23 / IL-17轴存在在RA的发病机制28]。HMGB1也扮演了重要的角色在其他自身免疫性疾病以及急性同种异体移植物排斥反应(29日- - - - - -32]。

在目前的研究中,我们不仅证实了以前的结果,但也表明,HMGB1参与了RA的发病机制。有一个积极的HMGB1和Th17或其他临床指标之间的相关性。我们的流式细胞仪的数据还显示,HMGB1可能上调CD3⁺CD8^{- - - - - -}IL-17⁺T细胞在RA患者中,也在我们的在体外研究中,我们观察到在CD4 HMGB1直接行动⁺T细胞增强IL-17生产激活后CD3和CD28马伯,这是符合我们最近的报告(33]。总之,我们的数据之间提供一个强大的协会Th17活动增加,HMGB1在RA, HMGB1可能上调Th17细胞在活的有机体内或在体外,打开一个新途径研究风湿性关节炎的免疫治疗和发病机理。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(号。30871193,30972748,81001319),自然科学基金江苏省高校和江苏省创新基金的候选人的医生(批准号09年kjb310001 CX09B_217Z,分别)。

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