单纯疱疹病毒-2糖蛋白与HVEM的相互作用影响粘膜上的病毒特异性召回细胞反应

摘要

单纯疱疹病毒(HSV)感染易感细胞需要HSV gD糖蛋白与两个主要的进入受体之一，疱疹病毒进入介质(HVEM)或nectin相互作用。HVEM自然在免疫信号传导中发挥作用，gD-HVEM相互作用在黏膜感染后早期改变固有信号传导。我们研究了gD-HVEM相互作用是否改变了小鼠阴道内模型的淋巴细胞回忆反应。小鼠用表达野生型gD的减毒HSV-2或不能与HVEM结合的突变型gD进行引物，32天后用表达野生型gD的强毒HSV-2攻击小鼠。HSV-specific CD8⁺在召回反应中，病毒无法与HVEM结合后，生殖粘膜的T细胞减少，但在引流淋巴结中没有差异。CD4⁺T细胞是进入hsv特异性CD8的关键⁺T细胞在急性感染时进入粘膜，两组在任何组织中没有差异。Foxp3之间的反向关联⁺CD4⁺调节性T细胞和CD8⁺渗透到粘膜上并不统计学意义。不同淋巴细胞子集之间的CXCR3表面表达在不同的情况下没有显着差异。我们得出结论，HMEM在HSV感染急性期间的参与影响抗病毒CD8⁺回顾不明原因的机制。

1.介绍

单纯疱疹病毒类型2（HSV-2）是一种常见的感染原因，17％的美国成年人血清阳性[1］.HSV-2通常与生殖器感染有关，病毒在人群中的传播通常是由于潜伏感染的重新激活和随后的病毒脱落[2］.

HSV感染易感人类和小鼠细胞需要病毒糖蛋白gD与其细胞表面受体之一的结合[3.那4.］.HSV gD结合三种一般类型的表面受体，包括疱疹病毒进入介质(HVEM)、nectin-1和-2，以及硫酸肝素的特定位点[3.］.其中，HVEM和nectin-1似乎在人类和小鼠中都能最有效地介导病毒进入[5.那6.］.小鼠的受体与人的受体同源，小鼠的HSV病类似于人的HSV病，可以将小鼠模型应用于人类HSV发病机制的研究。

HVEM是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族的蛋白质的成员[7.］.HVEM在许多组织中表达，但其主要的自然功能似乎是通过与激活配体LIGHT或衰减结合伴侣B和T淋巴细胞衰减器(BTLA)或CD160的相互作用来调节免疫反应[8.］.尽管淋巴细胞未被认为是HSV感染的显着靶标，但是由于这些天然HVEM配体可以增强或抑制淋巴细胞活化，因此提出了GD-HVEM相互作用可以影响淋巴细胞介导的HSV的免疫力。在HSV感染期间Gd与HVEM的免疫学作用尚未详细阐明，尽管我们在鼠静脉内攻击模型中的前后工作鉴定了粘膜在粘膜上的趋化因子反应的差异，这取决于病毒是否可以接受HVEM，急性细胞反应不是显着影响[9.］.

最近的研究表明，由病毒抗原和HSV gD组成的融合蛋白组成的候选DNA疫苗，提高了gD与HVEM的结合可能会影响记忆细胞对HSV的免疫应答。结果表明，保护性抗原特异性CD8⁺gD序列的存在增强了t细胞的反应，提供了与HVEM结合所需的结构域的功能[10-12］.

虽然大多数免疫细胞表达HVEM，但在目前的研究中，我们专注于淋巴细胞，包括调节性T细胞(Tregs)。在免疫应答的不同时间，免疫细胞上的HVEM表达水平不同。Naïve和一些内存CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞组成性表达HVEM，但激活后表达下调[13那14］.在小鼠中，缺乏HVEM或BTLA表达导致循环CD8的群体增加⁺具有激活的内存表型的T细胞[14］.CD4对树突状细胞(dc)的最佳激活⁺记忆T细胞依赖于光的表达[15］.B细胞的反应也可能被HVEM/LIGHT相互作用增强[16］.与效应淋巴细胞相比，活化后treg增加HVEM的表达[17］.Tregs的最佳效应响应需要HVEM和BTLA [17］.有趣的是，HVEM在缺乏Foxp3的小鼠T细胞上不表达[17，一种定义主要Treg子集的转录因子[18］.总之，这些观察表明，HVEM在效应记忆淋巴细胞的产生和功能以及treg的功能中发挥重要作用。

在本研究中，我们采用小鼠阴道内HSV-2感染模型来研究HVEM参与影响召回免疫反应的作用。我们观察到hsv特异性CD8的差异⁺启动过程中基于gD-HVEM相互作用的生殖粘膜t细胞召回反应。启动病毒在粘膜上复制的差异不能解释观察到的CD8的差异⁺t细胞浸润，CD4也不行⁺T细胞频率和CXCR3在应答细胞上的表达在这两种情况下是不同的。尽管我们观察到与CD4相反的趋势⁺Foxp3⁺Tregs，我们无法清楚地将这些细胞暗示为不同的CD8⁺我们观察到的T细胞召回响应。我们得出结论，Gd和HVEM在HSV急性感染期间的相互作用可能影响在生殖器粘膜中随后的召回响应的幅度和质量，尽管该机制仍有待阐明。

2.材料和方法

2．1.动物实验指南

本研究中的动物护理和使用符合机构和NIH的指南。

２.２.细胞和病毒

在Dulbecco对Eagle（DME）培养基加上10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素的修饰中培养Vero细胞，并用于繁殖和滴定病毒。用标准方法进行斑块滴定。

HSV-2株333最初是从生殖器损伤中分离出来的，并在人类细胞中进行了有限的传代[19］.该病毒经空斑纯化，在Vero细胞中传代不超过三次。对HSV-2(333)糖蛋白gD的修饰已在前面描述过[9.］.本研究使用的强毒株HSV-2(333)/gD含有FRT重组位点两侧的野生型gD。通过插入alacZ表达式磁带（导致表达β-半乳糖苷酶)的UL3-4基因间区，如先前描述的野生型HSV-2(333) [20.］.使用了两种减毒病毒:一种含有FRT位点两侧的野生型gD(指定为HSV-2(333)/gD-)βgal)和另一种含有缺乏氨基酸7-15的突变型gD，使其无法与HVEM结合(指定为HSV-2(333)/Δ7-15-)β加)。先前的研究(未发表)证实，与接种的野生型病毒相比，这些病毒可以感染小鼠，但不会导致死亡或显著的临床症状。在我们之前的研究中，gD基因引入的Δ7-15突变对黏膜复制的影响相对于gD野生型病毒只有很小的影响[9.］.

2.3。动物程序

6 - 10周龄的雌性C57BL/6小鼠购自Jackson实验室，在接种前保持在特定的无病原体条件下。小鼠被转移到一个隔离设施进行接种，接种发生在12周龄之前。小鼠对阴道内感染的易感性是通过在接种前6天皮下注射2.5 mg醋酸甲羟孕酮(Depo-Provera, Pharmacia)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中确定的[21］.接种时，用氯胺酮-氧嗪麻醉小鼠，拭子清除阴道分泌物，用微管注入总容量为20ml的病毒。将病毒稀释在含有1%灭活小牛血清和0.1%葡萄糖的PBS中进行递送空斑形成单位/鼠标。所有小鼠首先接种弱毒病毒(“引物”)，然后在引物32天后用强毒HSV-2(333)/gD攻毒(“引物”)。攻毒后3天处死小鼠以评估细胞免疫反应。临床症状一般在接种后均未观察到，尽管个别小鼠接种减毒病毒后出现阴道周围脱发或轻微病变，这些病变在接种前已消失。

2.4。阴道道病毒复制的测量

为了评估减毒病毒在阴道内的复制，在指定的时间从感染小鼠中收集分泌物。无菌PBS在40μL体积，移液进、出2-3倍(见22])。这个过程重复了两次，并将样本汇集起来进行标准空斑分析。样品保存在−70°C直到分析。

2．5．淋巴细胞的分离

淋巴细胞从引流淋巴结(DLN)和阴道组织中分离。每只小鼠的DLNs分别用2%热灭活胎牛血清RPMI-1640均质。用ACK缓冲液裂解红细胞，洗涤、计数并保持在完全培养基(rmi -1640、10%胎牛血清、1 mM丙酮酸钠、0.1 mM非必需氨基酸、1%青霉素链霉素和20 mM)中β-巯基乙醇)，用于流式细胞术评价。

阴道组织的处理方法与我们以前使用的方法类似[9.，基于Gierynska等人所描述的方法[23］.简单地，分离的组织在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中洗涤，切成小块，在HBSS中与胶原酶D (1 mg/mL)在37℃温和搅拌下孵育1小时。消化后的组织经细胞滤器挤压，用2%热灭活胎牛血清RPMI-1640洗涤，细胞计数并在完全培养基中重悬。在从任何组织中恢复的细胞总数上，两组之间没有差异。

2.6。流式细胞术检测小鼠t细胞反应

洗涤分离的细胞并重新悬浮在FACS缓冲液中。表面标记包括与鼠CD4，CD8，CXCR3和DIMORX-PE试剂（BD Biosciences）的荧光缀合的抗体预加载到GB中_496-503肽根据制造商的说明。细胞渗透试剂盒用于细胞内标记荧光标记的小鼠Foxp3抗体(BD生物科学)。使用LSR II流式细胞仪(Becton-Dickinson)和FloJo软件(TreeStar)对细胞进行分析。根据正向和侧散点特征对淋巴细胞进行门控，使用同型对照抗体确定Foxp3和CXCR3阳性标记阈值。未感染小鼠的淋巴细胞用DimerX试剂作阴性对照标记。对每个分析的条件至少收集了10000个事件。根据在相关波长检测到的荧光测量不同亚群的百分比。

2.7。统计测试

在使用未配对的学生的实验组之间比较群体中荧光标记细胞的平均百分比以及。

3.结果

3．1.病毒与HVEM相互作用的能力对病毒在小鼠阴道内复制的影响很小

我们之前的研究发现，在感染强毒株HSV-2(333)/gD和HSV-2(333)/Δ7-15后，阴道内的病毒复制只有微小差异[9.］.证实这些病毒的减毒株(HSV-2(333)/gD-β加和HSV-2(333) / 7 - 15Δ-βGAL，REP。）在阴道道中也有类似的复制动力学，我们用两种减毒病毒接种小鼠组，并随时间测量阴道分泌物中的病毒滴度（图1）.无法与HVEM结合的病毒株在第1天滴度降低约0.5 log ()，但随后数天滴度无统计学差异。我们的结论是，gD中的Δ7-15缺失，在不改变病毒使用nectin-1能力的情况下，取消了病毒使用HVEM作为入口受体的能力，不会有很大的改变体内复制减毒病毒菌株。

３．２．HSV-Specific CD8⁺在引发期间HSV-2与HVEM的HSV-2相互作用降低T细胞粘膜召回响应

雌性小鼠分别用HSV-2(333)/gD-启动βGAL或HSV-2（333）/Δ7-15-βgal和HSV-2(333)/gD激发(图2(一个)）.CD8的研究⁺HSV感染C57BL/6小鼠后的t细胞免疫反应鉴定出一种免疫显性H--限制性表位在gB糖蛋白(gB_496-503)，占CD8的70%⁺细胞免疫反应[24那25]，允许使用装载显性肽的荧光标记MHC二聚体测量hsv特异性反应[26］.HSV-specific CD8⁺在之前用HSV-2(333)/gD-刺激的动物中，在用HSV-2(333)/gD-刺激后3天，淋巴细胞显著增加βgal，而那些使用HSV-2(333)/Δ7-15-β加(图2 (b)和3.）.

使用能够接合HVEM的病毒引发的灌注在HSV特异性CD8的平均百分比中导致大于双重增加⁺与使用病毒的引发相比，在阴道粘膜中回收的T细胞不能接合HVEM。在特定于HSV特定CD8的频率下没有看到差异⁺从DLN中分离淋巴细胞(图2 (b)和3.）.在CD8的平均百分比上也没有发现差异⁺T细胞(独立于gB_496-503抗原特异性）从两组（数据未显示）之间的阴道粘膜或DLN分离。我们得出结论，HSV GD在C57BL / 6小鼠初始感染期间与HVEM的相互作用导致HSV特异性CD8的频率增加⁺在表达野生型gD的毒性HSV-2刺激后的召回反应中，T细胞位于粘膜而非DLN。

３．３．启动过程中HVEM的参与不会改变CD4⁺回忆反应期间，DLN或阴道粘膜的t细胞频率

先前的研究人员已经证明了CD4的关键作用⁺T细胞直接进入病毒特异性CD8⁺急性HSV感染后，T细胞通过分泌干扰素进入粘膜组织γ(IFN -γ）诱导趋化因素生产[27］.我们之前的研究没有发现IFN-频率的差异γ生产CD4⁺T细胞在急性感染后使用的病毒是或不能与HVEM结合的[9.］.因为CD4的频率不同⁺T细胞(通过推断IFN-的数量γ可以解释病毒特异性CD8细胞浸润频率的差异⁺T细胞，我们测量了CD4⁺在回忆反应期间，t细胞浸润到粘膜组织和DLN(图)4.）.与hsv特异性CD8的结果相反⁺T细胞，CD4细胞浸润频率没有差异⁺用HSV-2(333)/Δ7-15-诱导的小鼠阴道粘膜或DLN中可见T细胞βgal与HSV-2(333)/gD-相比βgal.我们得出结论，在C57BL/6小鼠免疫应答启动阶段，HSV与gD的初始相互作用不会改变CD4⁺挑战期DLN或阴道黏膜的t细胞反应。然而，我们的数据不能排除IFN-的差异γ通过反应CD4产生⁺T细胞在回忆反应中。

3．4．在召回反应期间，调节性t细胞浸润到感染组织可能被HVEM的预先参与改变

treg通过改变感染组织和引流淋巴结之间的趋化因子和细胞因子梯度，在指导小鼠对粘膜HSV感染的急性细胞免疫反应中发挥重要作用[28］.因为在回忆反应期间，不同组织中Treg频率的改变可能导致我们在抗病毒CD8中观察到的差异⁺T细胞频率，我们评估了在我们的感染模型中召回反应中的Treg频率。Foxp3⁺CD4⁺在注射了HSV-2(333)/Δ7-15-的小鼠阴道粘膜中检测到较低频率的tregβ加仑与用HSV-2（333）/ gd-的小鼠相比β加(图5.）;但是，这种差异没有达到统计学意义。Foxp3无差异⁺CD4⁺在不同实验组之间的DLN中的Tregs。虽然在召回反应期间观察到在阴道粘膜中的Treg渗透到阴道粘膜的趋势与HSV特异性CD8的渗透反向⁺T细胞，由于缺乏统计学意义，我们无法确切地暗示treg在指导这种反应中的作用。

3．5．在召回反应中，hsv特异性T细胞的归巢受体表达不受HVEM预先参与的影响

效应T细胞对感染粘膜组织的招募依赖于CXCR3的表达[27它是趋化因子CXCL9和CXCL10的受体。我们以前观察到CXCL9和CXCL10的水平在HSV感染的急性期都受到影响，这取决于病毒是否能与HVEM结合[9.］.CXCR3在启动T细胞反应中很重要，并在诱导T细胞记忆中具有潜在作用[29，这可能解释了CD8的差异⁺我们观察到的T细胞浸润可能与这种归巢受体的表达有关。因此，我们检测了CXCR3在回忆反应过程中引流淋巴结和阴道组织中不同淋巴细胞亚群的表达。CXCR3在CD8上表达的平均荧光强度⁺,CD4⁺,具体⁺CD4⁺T细胞没有根据引发病毒是否能够接受HVEM（图6.）.我们得出结论，尽管我们先前观察到基于急性反应中HVEM表达的趋化因子产生的差异[9.[在引发期间与HVEM的GD相互作用，在召回响应期间，在召回响应期间，在召回响应期间没有明显的趋化因子表达的可测量差异。

4.讨论

我们的研究描述了HSV-2 gD与HVEM的急性相互作用在修改小鼠阴道内感染后抗病毒回忆免疫反应中的作用。我们的主要观察是，在急性感染(启动)期间，HVEM的参与增加了hsv特异性CD8⁺再激时粘膜的t细胞反应。我们调查了这一观察的几个可能的因素，但不能清楚地证明CD4的作用⁺t细胞,Foxp3⁺CD4⁺treg，或趋化因子受体CXCR3在应答细胞上的表达，与启动病毒是否能够与HVEM结合有关。

我们使用成熟的小鼠阴道内刺激模型进行这些研究[21]探讨粘膜上的抗病毒细胞召回响应。当使用野生型病毒时，该模型限于通过在高效的动物中通过死亡率研究小鼠的HSV-2发病机制，要求我们通过用减毒病毒引发初始抗病毒免疫应答。通过多种方式用野生型病毒彻底攻击后可以保护小鼠免受疾病，包括被动抗体转移[30.]，并产生hsv特异性细胞反应[23那31那32[我们从初步研究中，我们知道我们的减毒病毒可以免受随后的野生型HSV挑战的保护。我们没有正式展示这种保护的机制，但我们预计用病毒引发促进能够介导保护的体液和细胞免疫力。自从我们之前的工作以来[9.]和当前数据(图1)也证明了gD突变以消除与HVEM相互作用对阴道内模型中病毒的局部复制只有很小的影响，我们认为我们的结果反映了一种主要归因于启动病毒与HVEM相互作用的相对能力的影响。记忆T细胞反应是由CD8效应池中的一个小群体产生的⁺T细胞(33，而抗病毒T细胞的活化和扩张在感染24小时后才开始[34］.此外，急性感染解决后产生的记忆T细胞的数量被认为至少部分依赖于细胞免疫反应效应期的峰值反应[34];我们之前的数据并没有发现hsv特异性CD8峰值的差异⁺基于病毒参与HVEM的T细胞反应[9.］.因此，两种病毒在接种后一天的复制差异(0.5 log PFU/mL)不太可能解释粘膜召回反应的两倍以上差异。

对于我们的发现，另一种可能的解释是，在启动过程中，HVEM的参与特异性地改变了gb特异性的回忆反应，导致可能是hsv特异性的回忆反应，但涉及亚显性表位。与这种可能性相一致的是，我们观察到总的CD8⁺在回忆反应中，粘膜组织中的T细胞频率没有改变。然而，我们之前的研究发现急性CD8无差异⁺T细胞对gB的反应_496-503与HSV-2（333）/Δ7-15相比，致毒性HSV-2（333）/ GD攻击后，结合了解记忆响应部分取决于峰值响应[34，建议反对这种可能性。然而，我们不能完全排除这种替代解释与我们的数据。

HVEM是TNF受体家族成员，广泛表达于造血细胞[35那36］.通过HVEM的信号传导会在免疫细胞中产生不同的反应，这取决于它参与的环境[8.］.光或淋巴毒素对HVEM的作用α增加t细胞活化[35]，而BTLA [37那38]和CD160 [39与HVEM相互作用可减弱t细胞的活化和增殖。虽然淋巴细胞通常不被认为是单纯疱疹病毒感染的靶点体内，HSV GD对病毒包膜和感染细胞的相互作用可以通过与HVEM的相互作用调节淋巴细胞活性。HSV GD与相同膜 - 远端半胱氨酸的域中的HVEM结合（CRD1）[40]即BTLA [41]和CD160 [39]，可溶性gD竞争性地抑制BTLA-HVEM相互作用[38］.gD与HVEM的相互作用本身可以触发NF-κB激活(42］.此外，gD可能竞争性地抑制HVEM与BTLA或CD160的结合，其结果取决于HVEM-BTLA/CD160相互作用的效果。HSV gD与HVEM的相互作用也可能改变其他(非淋巴细胞)表达HVEM或其配体的免疫细胞的反应，如树突状细胞，其稳态依赖于HVEM和BTLA信号[43]和NK细胞，这些细胞可能被CD160的参与激活[44］.

已知HVEM和它的多个配体之间的结合，LIGHT和它的结合伙伴HVEM和淋巴毒素-之间的结合β受体(LT -βR)，以及在炎症反应中这些分子在不同细胞类型上表达的差异调节，gD改变上述任何相互作用以影响记忆t细胞反应的机制并不立即明显。先前对btla缺陷小鼠的研究显示naïve CD8的分化增加⁺在没有BTLA的情况下，T细胞进入中央记忆细胞[14，提示我们的结果可以用gD在急性感染过程中干扰HVEM-BTLA信号来解释。最佳Treg反应也依赖于HVEM-BTLA信号通路[17];在TCR刺激后通过效应T细胞上调HVEM和BTLA表明，在急性反应期间通过HVEM-BTLA的Treg信号传导至效应T细胞的效应T细胞水平的假设可以编程随后的存储器单元分化，控制数字或其他特征the memory cell population (e.g., migratory characteristics might be altered by effects on chemokine receptor expression). However, as other cell types also express HVEM and BTLA, including DCs and NK cells, a role for HVEM signaling by these cells in the shaping of the memory immune response is also possible.

一些证据表明，急性免疫反应所处的趋化因子和细胞因子环境可能会影响记忆细胞的产生和持久性。抗原CD4⁺T细胞最近被证明需要LIGHT和HVEM的表达才能作为记忆细胞存在[45］.DLNs中T细胞上趋化因子受体CXCR3的表达也与T细胞记忆的诱导有关[29］.gD对HVEM-LIGHT信号的任何调制都可能影响其中一个或两个通路。也有可能记忆细胞生成和持久性不受初始gD-HVEM交互影响,但随后的趋化因子生产或记忆细胞趋化因子受体表达的程序以某种方式的初始上下文HVEM信号,导致趋化因子的变化梯度在召回响应,改变了不同记忆淋巴细胞的相对浸润。在这些实验中，我们没有测量挑战期的趋化因子反应，而CXCR3的测量也没有揭示这种受体表达在我们观察到的反应中所起的作用。进一步确定我们观察的潜在机制的工作正在进行，包括评估不同的时间点和使用过继转移和HVEM敲除小鼠的实验。

据我们所知，本研究首次在HSV感染模型中显示HSV gD-HVEM相互作用对回忆免疫应答的影响。然而，根据先前的疫苗研究，gD-HVEM相互作用对记忆免疫的影响并非完全出乎意料[10-12］.在这些研究中，构建候选疫苗，表达不同的病毒抗原融合到HSV-1 gD的c端结构域，并肌肉注射给小鼠。这些结构体比那些缺乏gD融合或gD不能与HVEM相互作用的结构体诱导更强的免疫应答。作者认为这主要是gD干扰BTLA-HVEM天然相互作用的共抑制信号。

在我们的工作中遗留的许多问题中，有一个是操纵HVEM信号通路是否会给病毒带来任何好处。HSV进化到使用一种受体，与使用不同的受体相比，这种受体最终导致最初感染部位更强的回忆反应，这似乎是违反直觉的。一种可能性是，使用gD扰乱HVEM信号有利于感染的初始建立[9.］.如果在存在强召回响应的情况下，病毒也能重新激活和流动，则可能没有针对这种效果的显着选择压力。进一步调查HVEM在免疫力中的抗渗透功能可能会在这个问题上阐明。

最后，值得进一步评论这一观察对HSV疾病发病机制和可能的治疗方法(包括疫苗接种)的影响。人类三叉神经节和皮肤活检样本的研究强烈支持记忆CD8⁺t细胞反应对于控制复发性感染至关重要[46那47］.操纵HVEM信号以正确地引导这些反应对相关组织可能有利于治疗性疫苗策略[11］.也可能对疾病复发有影响。尽管对具有HSV特异性细胞免疫的个体的事先研究，但没有感染的血清学或临床证据未能识别改变病毒进入细胞的HVEM多态性[48， HVEM变异可能导致信号差异，在病毒再激活过程中促进或减少有效黏膜细胞免疫反应。一项类似的HVEM变异在频繁复发患者中的调查尚未完成。

5.结论

我们已经描述了HSV gD和HVEM在形成抗病毒CD8的初始相互作用的作用⁺粘膜T细胞回忆反应。需要进一步的研究来阐明这种效应背后的机制，以及它如何参与HSV发病机制，并可能影响治疗干预措施的设计，包括疫苗。

致谢

本文得到了美国国立卫生研究院过敏症与传染病研究所(批准号:。5K08 AI089942致W. J. Muller)，并获得美国传染病学会教育和研究基金会/国家传染病基金会青年研究员奖(致W. J. Muller)。作者还希望感谢Nanette Susmarski在病毒制备和滴度方面提供的细胞培养专业知识和帮助。他们也感谢帕特里夏·斯皮尔、理查德·朗内克、格雷戈里·史密斯、安妮·罗利、史蒂夫·米勒、约翰·贝希尔、安德鲁·卡拉巴以及朗内克和米勒实验室的其他成员提出的许多有益的意见和指导。这项工作得到了西北大学跨院系免疫生物学流式细胞术核心设施的协助。

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