HLA级别II缺陷在Burkitt淋巴瘤中：Bryostatin-1诱导的17kDa蛋白恢复CD4 + T细胞识别

抽象的

虽然HLA类I介导的AG介绍的缺陷由Burkitt淋巴瘤（BL）进行了充分的记录，但CD4 + T细胞也受HLA II类AG展示刺激差，而这种缺陷的原因尚未成为完全解决。在这里，我们表明Bl细胞缺乏它们通过HLA II类途径最佳地刺激CD4 + T细胞的能力。观察到的缺陷与低水平的BL表达的共刺激分子无关，因为添加外部共刺激未能导致BL介导的CD4 + T细胞活化。我们进一步证明了BL细胞表达了II类途径的组分，并且缺陷不是由于AG /类II相互作用的错误引起的，因为抗原肽与明显的BL相关的II类分子结合的抗原肽。用硼脂素-1处理B1，蛋白激酶C的有效调节剂导致BL中官能II类AG呈现的显着改善。免疫识别的恢复似乎与17kDa肽基丙烯酸丙烯基蛋白的表达增加了联系。这些结果证明了HLA类II介导的AG在BL中的特异性缺陷的存在，并且揭示了用苔藓抑素-1的处理可以导致免疫原性增强。

1.介绍

伯基特淋巴瘤(BL)是一种侵袭性非霍奇金b细胞恶性肿瘤，在疟疾高发地区的儿童中以地方性BL最为常见[1]．这种恶性肿瘤也可在世界其他地方发现，如散发性BL，在西方国家占所有淋巴瘤的1-2% [1]．BL的临床表现是多种多样的，有地方性BL的特征性颌骨肿瘤和散发性BL的肠道肿瘤[2- - - - - -4]．BL是人类恶性肿瘤中翻倍最快的肿瘤之一，而且经常与免疫缺陷有关[3.]．

除了与疟疾密切相关外，BL还与eb病毒(EBV)高度相关。然而，EBV感染并不是BL发生的必要条件，而与EBV的关联程度因BL的类型而异。在>中，90%的地方性BL病例发生EBV感染，10-15%的散发BL病例发生EBV感染，40%的人类免疫缺陷病毒(HIV)相关BL发生EBV感染[1]．虽然EBV在BL的发展中发挥的确切作用仍然很大程度上，但应当理解，EBV基因产物可能参与BL细胞的转化及其降低的免疫原性。EBV的其他证据具有在BL茎的开发中，来自EBV的各种其他淋巴瘤恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤，移植相关的B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病和天然杀伤细胞白血病（Angant杀手细胞白血病）5- - - - - -8]．虽然BL与疟疾和EBV有不同的关联，在某些情况下与两者都不相关，但所有BLs共有的一个特征是致癌转录因子的过表达c-myc.，该基因网络包含高达15％的所有已知基因的[9]．这种异常导致了易位的结果MYC导致其构成激活的免疫球蛋白位点基因[10- - - - - -12]．

已知BL在HLA i类介导的抗原(Ag)向CD8+ T淋巴细胞提呈方面存在缺陷[13- - - - - -15]．然而，HLA ii类介导的Ag呈递在产生BL免疫应答中的作用尚未完全阐明。I类缺陷已经得到了充分的研究，人们认为这是由于EBV核Ag 1 (EBNA1)免疫原性较弱所致，EBNA1通过I类途径处理和呈现较差[16- - - - - -18]．另一个EBV基因产物，gp42，通过与HLA II类相互作用介导病毒结合，据推测它可以阻断II类和t细胞受体之间的相互作用[19，20.]．虽然HLA i类介导的CD8+ T细胞活化导致肿瘤细胞的ag特异性裂解，但HLA II类反应对于持续免疫反应的产生至关重要[21.]．我们的实验室之前已经表明，b细胞淋巴瘤缺乏HLA ii类介导的Ag呈递[22.[这项研究在本研究中，我们探讨了B细胞相关分子在BL细胞CD4 + T细胞识别的恢复中的作用。

本发明介绍的研究表明，多种缺陷可能有助于BL的无法有效地通过HLA II类分子提供AG。我们在BL细胞和EBV-永生的B淋巴细胞细胞（B-LCL）中，证明转染的HLA类II等位基因的表达，并证明转染的HLA II类有效地结合外源递送的AG以形成II类肽复合物。然而，虽然B-LCL能够进行CD4 + T细胞刺激，但BL细胞缺乏它们的能力，并且添加外部共刺激的添加不足以克服这种缺陷。此外，用苔藓抑素-1部分恢复的II介导的AG展示治疗BL细胞。这种恢复与苔藓抑素处理的BL中17kDa蛋白的上调有关，该BL在未处理的BL中低水平表达，但在B-LCl中高度表达，表明该蛋白质可能在增强II类介导的AG展示中发挥作用．在其他研究中，已显示苔藓抑素-1在树突细胞中增加HLA II类表达，并在结肠直肠癌细胞中增加，但其对HLA II类表达和AG呈淋巴恶恶性肿瘤的作用尚未得到评估[23.，24.]．总的来说，这些结果表明BL具有多种缺陷，导致通过HLA II类Ag提呈刺激CD4+ T细胞的能力受损。这些缺陷可能为开发新的免疫疗法提供机会，导致更有针对性的治疗BL和其他淋巴细胞恶性肿瘤。本研究也为进一步评价苔藓虫素-1作为淋巴系统恶性肿瘤的治疗手段提供了理论依据。

2。材料和方法

2．1．细胞系

人BL细胞系Nalm-6、Ramos和Ous，保持在完整的rmi -1640中，添加10%的胎牛血清(Invitrogen, Carlsbad, CA)， 50 U/mL青霉素50μ.G / ml链霉素和1％L-谷氨酰胺（Mediatech，Manassas，VA）。OUS细胞系是Christian Munz博士（洛克菲勒大学）的礼物。人B-淋巴细胞系（B-LCL）6.16和FREV在补充有10％牛生长血清（Hyclone，Logan，UT），50 U / ml青霉素50的IMDM中维持 μ.g/mL链霉素和1%谷氨酰胺(Mediatech)。通过逆转录病毒转染Nalm-6、Ramos和6.16细胞，获得HLA-DR4 (DRB1*0401)的组成性表达，并与hygromycin和组氨酸耐药的连锁药物选择标记产生Nalm-6。DR4,拉莫斯。DR4和6.16。DR4 [22.，25.]．Frev不需要转染II类等位基因，因为它构成型表达HLA-DR4。使用dr4特异性单抗359-F10进行流式细胞仪分析，证实了转染者表面HLA-DR4的表达[22.，26.，27.]．6.16。DR4细胞再转染DMα.和DM.β对于HLA-DM分子的组成型表达产生6.16.DR4.dm [22.]．6.16.DR4上HLA-DM的表达。western blotting证实DM细胞。t细胞杂交瘤2.18a和1.21识别Igκ..分别通过如所述免疫DR4-转基因小鼠的残留物188-203和145-159。25.，28.]．t细胞杂交瘤17.9(大量由D. Zaller提供，默克研究实验室，Rahway, NJ)对人血清白蛋白(HSA)残留物64-76 K反应[29.]．这些T细胞杂交瘤较少依赖共刺激信号进行刺激。细胞培养于RPMI 1640与10%胎牛血清，50 U/mL青霉素，50μ.g / ml链霉素和50型 μ.米β- 巯基乙醇（Invitrogen）。

２．2.抗原，肽和其他试剂

人血清白蛋白(HSA)和人IgGkappa.(免疫球蛋白κ..)购自Sigma (St. Louis, MO)。肽(序列:VKLVNEVTEFAKTK)人IgG免疫显性肽（κ..我;序列:KHKVYACEVTHQGLSS)，亚显性肽（κ..二世;序列:KVQWKVDNALQSGNS)使用Fmoc技术和所述的应用生物系统合成器生产，在PBS中溶解，在−20°C保存直到使用[25.，29.，30.]．反相HPLC纯化和质谱法用于分析肽并显示出肽纯度> 99％。BROYOSTATIN-1购自SIGMA。

2．3．抗原呈现化验

B-LCL和BL分别与0μ.M，5 μ.M，10 μ.米,或20μ.M HSA Ag或HSA合成肽在37°C下在适当的细胞培养基中培养3-24小时，以确定用于抗原呈递试验的最佳抗原浓度[22.，25.]．在滴定之后，仅使用每种抗原的最佳浓度进行相同的测定。然后洗涤细胞并将T细胞杂交瘤17.9在37℃下共培养24小时。在并行测定中，用抗-CD3 / CD28刺激2.18A和1.21，在用NALM-6.DR4，Ramos.Dr4或6.16.Dr4.dm与κ..我或κ..二世(29.]．在共培养之后，ELISA定量了IL-2的T细胞产生[31.]．在报道的单一实验中，以一式三份重复测定以三份重复标准误差。

2．4．西方墨点法

对FREV的全细胞裂解物进行Western印迹分析，NALM-6.DR4,6.16.DR4.DM和RAMOS.DR4。如前所述分析HLA II类，II和HLA-DM的表达[32，33]．使用ChemIdoc XRS站（Bio-rad）进行密度测定法，其中使用一项4.6.3软件（Bio-rad）分析蛋白质带。将相对蛋白表达水平置于表达的特定蛋白质的比例/β-actin为每个样本。数据代表了至少三个独立的实验。

2.5。IL-2 ELISA

ELISA定量AG呈递测定上清液中的IL-2水平。在4℃下用纯化的大鼠抗小鼠IL-2（Sigma）涂覆96孔ELISA板过夜。然后将板洗涤并在室温下用2％BSA封闭30μm。洗涤后，将标准和样品涂布在适当的孔中并在室温下孵育2小时。使用从R＆D（Minneapolis，Mn）购买的重组IL-2产生标准曲线。洗涤板，加入生物素化大鼠抗小鼠IL-2（Sigma）并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入抗生物酰胺过氧化物酶（Pierce，Rockford，IL），并在室温下孵育30μm。洗涤板，将PNPP底物（Thermo Scientific，Rockford，IL）加入每个孔中，并在室温下孵育。读数每30米处以405纳米。样品孔中的IL-2水平以pg / ml表示，从标准曲线计算。 Assays were repeated in triplicate and expressed as mean IL-2 ± SEM.

2.6。肽结合化验

NALM-6.DR4，RAMOS.DR4,6.16.DR4.DM和FREV细胞固定在1％多聚甲醛中，然后用0孵育过夜 μ.M，10 μ.米,或20μ.在150mM CpB（pH7.4）中的M生物素化的HSA肽（B-HSA），用PBS洗涤，并在冰上裂解20分钟，含有0.15m NaCl和0.5％IgePal Ca 630（Sigma）的50mM Tris缓冲液（pH8）（Sigma）如上所述[30.，34]．将细胞上清液添加到之前涂有抗人II类抗体37.1(由L. Wicker, Merck Research Lab, Rahway, NJ)的板上(Costar, Cambridge, MA)。捕获的ii类肽配合物用铕标记的链霉亲和素(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)检测，使用荧光平板仪(Delfia, Wallac, Turku, Finland)。B-LCL/BL细胞中总DR分子数量如下所述[28.]．

2.7。苔藓虫素-1处理BL细胞

Nalm-6。DR4和拉莫斯。DR4用0、20或40 nM的苔藓虫素-1处理过夜。在孵育后，未经处理和苔藓虫素处理的细胞被用于含HSA肽的Ag提呈试验，随后进行ELISA IL-2定量，如前所述。在不同的实验中，拉莫斯。用40 nM苔藓虫素处理DR4过夜，然后在1%多聚甲醛中固定5分钟。固定后，用0μ.M，10 μ.m，或40 μ.在37°C下摇晃3 h。然后用1％Triton-X-100和蛋白酶抑制剂（PMSF和TLCK）洗涤细胞并裂解Hanks平衡盐溶液。将裂解物加入到抗HLA II型抗体的96孔板的孔中，37.1。使用链霉抗生物素蛋白过氧化物酶和BD Opteia TMB底物试剂（BD，San Diego，Ca）检测捕获的II类肽复合物。使用1M磷酸停止反应，并在450nm中读取所得的吸光度。

另外，通过SDS-PAGE蛋白分离评估了6.16.DR4.DM，未处理的NALM-6.DR4和BROYOSTATIN处理的NALM-6.DR4中的表面蛋白表达。将NALM-6.DR4细胞用40nm的苔藓抑素-1处理过夜。在孵育后，将6.16.DR4.DM，未处理的NALM-6.DR4和BROYOSTATIN处理的NALM-6.DR4用柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（CPB）洗涤，以洗脱细胞表面蛋白。然后将得到的洗脱液进行SDS-PAGE。从这些凝胶中切除17个KDA带，并通过MALDI TOF-TOF质谱法分析。CPB中的蛋白质从6.16.DR4.DM中通过电泳分离，在大型的凝胶上通过电泳分离。切除17个KDA带，通过在冰上的PBS中松开蛋白质。将Ramos.dr4细胞与HSA肽中的HSA肽在17kDa提取物中温育，以用于Ag呈递测定。量化IL-2的T细胞产生[31.]．

2.8。蛋白质提取和消化

CPB洗脱液取自6.16.DR4。DM,未经处理的Nalm-6。DR4和苔藓虫素处理的Nalm-6。如前所述的DR4 [22.]．浓缩萃取物，并测量蛋白质浓度，然后在非还原凝胶上运行，并用Coomassie蓝色染色。切除凝胶塞并置于Eppendorf管中。将每个塞子用50mM碳酸氢铵洗涤10分钟。接下来，在50％乙腈中使用25mM碳酸氢铵在50％乙腈中脱离15分钟。将塞子用100％乙腈脱水15分钟并以速度蒸发干燥。每个凝胶塞都覆盖着蛋白质组学级胰蛋白酶（Sigma），并在37℃下孵育过夜。将上清液收集在干净的干燥Eppendorf管中。将肽进一步用1洗涤25mM碳酸氢铵洗涤20分钟，三次洗涤5％甲酸，50％乙腈，每次20分钟。在每次洗涤后收集并汇集过度，然后在SpeedVac至〜1ul中干燥。 Prior to analysis, the samples were reconstituted with 10 uL of 0.1% trifluoroacetic acid. Samples were then concentrated with a C18 Ziptip (Millipore) and eluted with 0.1% TFA, 50% acetonitrile, and 7.0 mg/mLα.-氰基-4-羟基肉桂酸直接到MALDI目标上。

2.9。质谱分析(MALDI TOF/TOF)

在完全干燥斑点之后，将板装入应用的生物系统4800蛋白质组学分析仪中。在利用制造商的标准和协议分析样品之前进行外部校准。使用2000个激光镜头每光谱分析样品。首先，通过对800-3500的M / z范围内获得肽质量映射，通过平均2000扫描来定位肽来源的峰来优化M / Z 2000的延迟提取时间。下一个批处理运行执行MS-MS分析，以从MS分析中获取20个最丰富的峰上的序列数据。完成批处理后，将数据导出到GPS资源管理器数据处理系统中以进行解释和识别。吉祥物数据库搜索算法分析了数据并汇总了报告格式的结果。使用2个错过的切割和蛋氨酸氧化的一个差异改性进行数据库搜索。在分配自信的蛋白质标识之前，审查了前20个比赛。

结果

3．1．BL细胞显示减少HLA ii类介导的CD4+ t细胞刺激

虽然BL和B-LCL均表达HLA II类表面抗原，但我们通过转染这些细胞系来表达一个共同的II类等位基因，这样我们可以更直接地比较两种细胞类型之间II类介导的Ag呈递。在我们的BL (Nalm-6和Ramos)和B-LCL(6.16)细胞系上进行了DR4等位基因HLA DRB1*0401逆转录病毒基因转染。流式细胞仪分析证实了该等位基因在所有三种细胞系中转染和表达(数据未显示)。6.16。另外将HLA-DM转染DR4细胞生成6.16 DR4。与Nalm-6相比，DM细胞表达相似的HLA-DM水平。DR4和拉莫斯。DR4 [33]．然后对转染物进行分类，匹配表面DR4的表达，并与Ous和Frev一起在含HSA抗原或HSA肽的培养基中孵育。孵育后，细胞被洗涤并与t细胞杂交瘤(17.9)在37°C下共培养24 h。收集培养上清，ELISA检测IL-2水平。实验结果表明Nalm-6。DR4,拉莫斯。DR4和Ous缺乏通过ii类介导的HSA表位或HSA合成肽在17.9刺激IL-2产生的能力(图)1(一)- - - - - -1（d））.B-LCL行6.16.DR4。然而，DM和Frev刺激了高水平IL-2的产生(图1(一)- - - - - -1（d））.补充图1(见补充材料在线doi:10.1155/2011/585893)显示了用Nalm-6滴定整个HSA和HSA肽的结果。DR4,拉莫斯。DR4和6.16.DR4.DM。Nalm-6。DR4和拉莫斯。DR4在所有浓度的HSA或HSA多肽中都不能刺激IL-2的产生，而6.16 DR4。DM显示IL-2产生水平的剂量依赖性增加。这些结果表明，在HLA II型中，BL细胞在Ag向CD4+ T细胞的呈递中存在缺陷。

3.2。BL和B-LCL表达类似水平的HLA II类途径组件

在NALM-6.DR4，Ramos.Dr4,6.16.Dr4.dm和Frev中进行Western印迹分析，用于表达HLA II类，II，II和HLA-DM。来自这些分析的数据显示，BL和B-LCL都表达了这些免疫成分的可检测水平（图2（a））.作为野生型B-LCL，FREV表达比NALM-6.DR4，RAMOS.DR4和6.16.DR4.DM的较高水平的II途径组分，如密度测定法分析并纠正肌动蛋白加载控制（图2（b））.这些数据表明，在BL中观察到的II类介导的Ag呈递缺陷不是HLA II类加工和呈递途径缺陷的结果。

3．3．添加外部共刺激不足以克服ii类介导的Ag呈递中bl相关的缺陷

此前有报道BL细胞缺乏共刺激分子(CD80/86)的表达。为了确定这是否是BL中ii类介导的Ag呈递缺陷的原因，如所述，在存在外部共刺激信号的情况下进行了Ag呈递试验。在本实验中，t细胞杂交瘤用抗cd3 /CD28 +交联IgG处理，并与预孵育HSA肽的BL细胞共培养。添加外部共刺激对BL的II类Ag呈现几乎没有影响(图3.）.而6.16.DR4。DM刺激T细胞产生高水平的IL-2，无论是否有外部共同刺激，Nalm-6。DR4和拉莫斯。DR4对外部共刺激T细胞中IL-2产生的刺激没有显著增加。

3.4。HSA肽与BLA和B-LCL上的HLA类II类似的亲和力结合

在HLA II类AG呈现中评估BL相关缺陷的下一步是评估HSA肽与BL表达表面DR4的结合效率。NALM-6.DR4，RAMOS.DR4,6.16.DR4.DM和FREV在pH 7.4时与各种浓度的B-HSA孵育。然后使用铕标记的链霉抗生物素蛋白以ELISA格式检测II类肽复合物。数据显示了与具有相似，可测量的亲和力的每​​个细胞系粘合B-HSA肽的剂量依赖性响应（图4）.这些结果表明，BL通过HLA II类分子呈递Ag的能力减弱，并不是肽结合HLA II类分子受损的结果。

3.5。BL的苔藓抑素治疗BL增加了与HLA II类的肽结合，并恢复II类AG呈递和CD4 + T细胞识别

以前关于BROYOSTATIN-1的研究表明，它引起专业AG在呈现树突细胞中的HLA类II分子的上调，并导致这些细胞增加T细胞刺激[23.]．基于这一发现，我们试图确定BRYostatin-1治疗是否会影响BL的AG呈现。NALM-6.DR4和RAMOS.DR4细胞用苔藓抑素-1处理过夜，然后用如已经描述的HSA用于AG呈递测定。未处理的BL细胞显示出类似的T细胞刺激水平，而用苔藓抑素-1处理的细胞在20-40nm恢复的Ag呈递和T细胞刺激（图5(一个)）.拉莫斯。用苔藓虫素-1过夜处理DR4细胞，并测定肽与HLA II类的结合。拉莫斯。用40 nM苔藓虫素-1处理的DR4在10μ.M和40 μ.M b-HSA(图5 (b)）.

3.6。苔藓抑素治疗使BL中免疫刺激17kDa蛋白的表达上调

为了确定苔藓虫素-1处理后BL中II类呈现恢复的性质，CPB中Nalm-6的蛋白表达模式被洗脱。DR4和6.16.DR4。DM采用凝胶电泳(非还原凝胶)和考马斯亮蓝染色。本研究表明，一个17 kDa蛋白在BL细胞(Nalm-6.DR4)中持续低水平表达，而在B-LCL细胞(6.16.DR4.DM)中持续高水平表达(图)6(一)）.在用苔藓抑素-1进行BL细胞的过夜处理后，将该17kDA蛋白的表达恢复到与6.16.DR4.dm细胞相当的水平（图6(一)）.然后从凝胶中切割该蛋白质带，并通过MALDI TOF / TOF质谱法分析，露出肽基脯氨基蛋白（登录号：89058151）。为了进一步分析17kDa蛋白的功能，将CPB从6.16.DR4.DM细胞或苔藓抑素-1-处理的BL细胞中分离在大的非还原凝胶上，切除对应于17kDA蛋白的带，并且通过在冰上的PBS中超声萃取蛋白质。然后将Ramos.dr4细胞与HSA肽一起温育（10 μ.M)，然后与17.9个T细胞共培养。ELISA IL-2定量检测上清显示Ramos对IL-2产生的刺激显著增加。DR4细胞与HSA在17 kDa提取物的存在下孵育(图6 (b)）.这些结果表明苔藓苔素-1处理上调了BL中一个17kda蛋白的表达，该蛋白具有免疫刺激功能。

4。讨论

众所周知，BL在HLA i类介导的Ag呈递中存在缺陷，这是由于EBNA1蛋白的免疫原性较差。EBNA1拥有一个内部的Gly-Ala重复，破坏其蛋白酶体加工，导致CD8+ T细胞的微弱刺激[35]．这一缺陷虽然得到了充分的研究，但只涉及BL免疫应答的一个方面。关于HLA ii类介导的免疫应答对这一恶性肿瘤的作用，我们知之甚少。由于CD8+ t细胞具有直接杀死靶细胞的能力，研究通常集中在CD8+ t细胞应答上，但II类介导的CD4+ t细胞应答对于持久的免疫应答和记忆是必需的[36，37]．

在本研究中，我们发现，尽管BLs在其细胞表面表达可测量的II类蛋白，但它们不能通过提交HSA肽或表位来刺激CD4+ T细胞。我们进一步证明，当pH为5.5的缓冲液孵育时，BL细胞恢复了ii类介导的Ag呈递能力。用苔藓虫素-1治疗BL可恢复II类表现和CD4+ t细胞刺激。这种恢复部分是由于一种17 kDa的免疫刺激类肽基脯氨酸蛋白的上调，该蛋白通常在BL中表达量很低，但在B-LCL中高表达。

II类途径中II类(不变链)、HLA-DM和HLA-DO成分的表达水平可能部分影响II类介导的Ag呈呈CD4+ T细胞的效率[26.，33，38]．然而，我们没有观察到两种BL和两个B-LCL细胞系之间这些途径组分的表达水平的任何显着差异，从而为BL中观察到的缺陷判定出来。CD4 + T细胞活化也取决于由B细胞表达的共刺激分子，CD80 / 86递送的信号，已知BLS表达下层水平的较低水平[39]．BL相关的II类缺陷是合理的，其合作不足的结果。外部共刺激可以以抗CD28的形式提供给T细胞，其用作CD80 / 86的替代物。虽然我们的T细胞杂交瘤不需要共刺激，但我们仍然评估了共刺激分子的表达是否有助于BL缺陷。然而，即使在这些条件下，BL细胞也不能刺激CD4 + T细胞的激活。我们收集了进一步的证据表明，共刺激不是导致BL相关的类II缺陷从显示的分析表明BL细胞上的交联IgM未能导致CD4 + T细胞刺激（数据未显示）。

通过HLA呈递Ag对免疫系统检测病原体和转化细胞并对这些细胞产生免疫反应的能力至关重要。高效的Ag呈递依赖于多肽与HLA的有效结合。虽然共刺激不是BL不能通过II类表达Ag的原因，但BL表达的II类不能有效结合Ag，从而阻止t细胞刺激的可能性存在。然而，结合试验表明，BL和B-LCL都以相似的、可测量的亲和力结合肽。

Breosostatin-1，蛋白激酶C的有效调节剂，先前已经显示出刺激结肠直肠细胞系和树突细胞中HLA类II的上调，并增强树突细胞中的Ag呈递[23.，24.]．然而，到目前为止，在淋巴样恶性肿瘤中，其对HLA II类表达和Ag呈现的影响尚未得到评估。基于这些信息，我们试图确定苔藓虫素-1治疗是否足以使ii类介导的Ag呈现恢复到BL。我们发现BL细胞系Nalm-6。DR4和拉莫斯。在苔藓虫素-1治疗后，DR4确实恢复了HLA II类Ag的提呈能力。我们对拉莫斯的分析。DR4细胞显示，恢复HLA II类Ag提呈可能部分是由于苔藓虫素-1治疗后，HLA II类结合肽增加。此外，苔藓虫素-1处理后的蛋白表达分析显示Nalm-6中一个17 kDa肽基脯氨酸样蛋白显著增加。DR4，在未处理的Nalm-6中表达量非常低。DR4在6.16.DR4.DM中高水平表达。该蛋白提取并用于Ag呈递分析时，增强了6.16.DR4中ii类介导的Ag呈递。DM细胞。因此，苔藓虫素诱导的BL细胞中II类Ag表达的恢复是通过增加肽基脯氨酸样蛋白的表达来介导的。

BL是一种快速生长的恶性肿瘤，因此需要积极的化疗来控制其扩散。目前使用的化疗方案在成人和儿童中都取得了很高的治愈率，但治疗相关的毒性是有问题的。这一问题尤其引起了老年人和hiv感染者的关注，他们表现出较差的反应和治疗相关毒性耐受降低[40]．随着抗cd20单克隆抗体利妥昔单抗的使用，治疗成功得到了改善[41]．然而，毒性仍然存在问题，在hiv感染患者中使用免疫抑制剂是一个持续争论的主题[42，43]．虽然目前对BL的治疗表现出总体成功，但有明显的改善患者和艾滋病毒感染患者的治疗空间。我们未来的研究将继续评估BROSTOSTIN-1在BL中恢复II类介导的AG呈递中的作用，并确定肽基脯氨基蛋白的免疫刺激作用。更好地了解这些因素可能导致新型免疫疗法的发展，这可能增加，减轻或消除有毒化疗的需要。

作者的贡献

Azim Hossain和Jason M.上帝同样为本文贡献。

Acknowledment

我们感谢Janice Blum博士（印第安纳大学医学院）提供细胞系和试剂，以及用于质谱设施和技术援助的丹尼尔·克纳普（药理学系）。该工作得到了国家卫生研究院（5R01CA129560和CA129560-S1）到A. HAQUE的补助金。本文中提出的研究也部分地由组织生物研讨会和流式细胞仪共享资源作为南卡罗来纳医科大学的Hollings Cents中心的一部分，由癌症中心支持赠款P30CA138313资助。

补充材料

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