文摘

树突状细胞(dc)对胰岛炎及其发展为糖尿病NOD小鼠模型和人类。DCs中发挥关键作用的自身抗原和致糖尿病的T细胞的活化和IRF4 IRF8基因DCs的发展至关重要。因此,我们已经研究了这些基因的表达在脾DCs在点头小鼠糖尿病进展。我们发现IRF4表达调节脾细胞和脾CD11c⁺DCs点头小鼠相比BALB / c小鼠。相比之下,IRF8基因表达是点头小鼠的脾细胞,而其高表达于脾CD11c相似⁺DCs点头BALB / c小鼠。重要的是,IRF4和IRF8表达水平是低耐受性骨髓衍生DCs (BMDCs)生成与gm - csf相比,免疫原性BMDCs生成gm - csf和il - 4。脾DCs子集的分析表明,IRF4的高表达与CD4水平上升有关⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺DCs但不是CD4⁻CD8α⁺IRF8⁺CD11c⁺DCs在点头老鼠。我们的研究结果表明,IRF4表达上调点头老鼠和与CD4水平的增加有关⁺CD8α⁻DCs,表明IRF4异常可能参与DC功能在1型糖尿病小鼠点头。

1。介绍

树突状细胞(dc)是专业的抗原呈递细胞(apc),发挥关键作用的感应先天和适应性免疫1]。DCs通过模式识别受体识别各种病原体及其组件,如通常。捕捉病原体进行处理并显示在T细胞相关抗原肽MHC分子。因此,DCs / T细胞相互作用导致Th1、Th2反应诱导Treg分化和宽容。DCs抗原介绍之后的免疫反应的多样性是由于存在多个DCs子集(2,3]。至少6 DCs子集已确定小鼠脾脏包括传统CD11c^高DCs和CD11c^intB220⁺CD11b⁻血浆DCs(髓样)4]。传统CD11c^高分为三个不同的亚型,CD4⁺CD8α⁻CD11b^高,CD4⁻CD8α⁺CD11b^低,CD4⁻CD8α⁻CD11b^高(4- - - - - -7]。传统的淋巴CD8α⁺和骨髓CD8α⁻DCs是il - 12的主要生产商,而pDCs I型干扰素的生产商5- - - - - -7]。尽管有很大进步在理解DC的生物学,分子事件指定直流发展和功能并不完全理解。干扰素调节因子4和8 (IRF4和IRF8),两个世界宗教自由转录因子家族成员参与先天和适应性免疫的规定(8),已被证明有助于DCs发展和功能9- - - - - -13]。值得注意的是,IRF4已被证明是需要CD11b的发展^高CD8α⁻DCs子集(13),而需要IRF-8 CD11c分化⁺CD11b^低CD8α⁺DCs和pDCs子集14]。事实上,老鼠缺乏IRF4基因选择性脾CD11b缺陷^高CD8α⁻传统的DCs (13]而IRF8^−−/老鼠有一个缺陷在淋巴和血浆直流子集(14]。此外,CD8α⁺DCs和pDCs IRF8高水平表达的,但IRF4的低水平。相反,富含CD4 IRF4表达式⁺DCs和CD4⁻CD8α⁻CD11b^高DCs而IRF8表达很低。

Nonobese糖尿病(NOD)小鼠自发发展糖尿病年龄15到20周之间。疾病的发病之前一段时间的胰岛炎期间胰岛被autoreactive T细胞渗透和装甲运兵车15]。有趣的是,DCs细胞渗透到小岛(16前T细胞浸润[],17]。浸润DCs生成等细胞因子il - 12 (17),这表明他们的含义早期糖尿病的发病机理。此外,小鼠白介素点头结果的政府在加强DCs积累胰岛细胞和加速糖尿病发作(18]。虽然确切机制导致的故障容忍小岛抗原不是完全理解,DCs的功能缺陷和成熟点头老鼠已经提出(19]。几项研究已经显示一些异常BM-derived和脾DCs点头老鼠相比DCs diabetes-resistant老鼠的20.,21]。例如,据报道,脾CD8的数量α⁺DCs和CD8α⁻DCs NOD小鼠低的相比diabetes-resistant B10。BR和C57BL6J老鼠22]。这DCs可能导致人口减少他们的能力降低,清除死细胞(14和保持自我耐受性23]。

在目前的研究中,我们调查了IRF4和IRF8基因的表达在脾细胞和DCs diabetes-prone点头老鼠和比较结果diabetes-resistant也和BALB / c小鼠。我们发现一个调节表达IRF4点头小鼠的脾细胞总人口比BALB / c小鼠。增强IRF4表达式在CD11c被发现⁺脾DCs的点头而BALB / c小鼠。然而,IRF4 IRF8表达式只是增加BMDCs生成的il - 4和gm - csf而表达仅在BMDCs生成与gm - csf就很低。

2。材料和方法

2.1。老鼠

男性和女性的点头,也没有C57BL / 6 j、CD1、和BALB / c小鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。所有的老鼠被安置和培育内部特定的无菌条件下,根据指南的使用制度动物保健委员会大学的路易斯塔里夫。

2.2。细胞系和抗体

Anti-CD8α体育(克隆53 - 6.7),anti-CD4-FITC /生物素/ APC(克隆GK1.5) anti-CD11c-FITC /生物素(克隆HL3)抗体,streptavidin-PerCP(用于所有生物素结合的抗体)来自正欲(CA)圣何塞。anti-IRF4-biotin(克隆M17星云)和anti-IRF8-biotin(克隆C19)来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。antigoat-HRP抗体从R和D系统(明尼阿波利斯、锰)。

2.3。脾DCs隔离

DCs净化是利用Miltenyi antibody-coated磁珠进行研究(Bergisch格拉德巴赫、德国)之前(24]。简而言之,脾脏和胶原酶消化D(2或3的器官),沾anti-CD11c-coated珠子和按mac (Miltenyi研究)。CD11c纯度⁺DCs是> 85%,由流式细胞仪。

2.4。代的来源于DCs的骨头

BMDCs生成与gm - csf (5 ng / mL)单独或结合il - 4 (4.5 ng / mL) (Cederlane,伯灵顿)所描述的25,26]。7天,收集DCs进行进一步分析。

2.5。实时聚合酶链反应

从DCs使用试剂盒提取的总RNA试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。相反两个微克的RNA转录的互补使用上标二世(表达载体伯灵顿,)。定量PCR反应是使用Rotor-Gene执行3000 (Corbett生命科学,莫特,新南威尔士,澳大利亚)25μL 2组成的混合物μL (cDNA模板,2μL PCR缓冲,2μL(核苷酸(10更易/ L), 0.3μL(每个引物(20 pmol /毫升),0.5μL SYBR绿色Quantitect SYBR绿色qPCR工具包(试剂盒)和0.1μL聚合酶。最初的反应进行了变性5分钟在95°C,紧随其后的是40周期30年代在95°C, 30年代在58°C,和30年代在72°C。使用Rotor-Gene放大放大图生成软件v6.0 (Corbett研究)。产生HPRT作为参考来获取相对褶皱变化为目标样本使用比较C_T方法。使用的引物5′AATGGGAAACTCCGACAGTG3′(IRF4的感觉),5′TAGGAGGATCTGGCTTGTCG3′(IRF4反义)5′GATCGAACAGATCGACAGCA3′(IRF8意义),5′AGAGCACAGCGTAACCTCGT3′(IRF8反义)5′GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG3′(产生HPRT意义)和5′GATTCAACTTGCTCTCATCTTAGGC3′(产生HPRT反义)。

2.6。西方的屁股

BM-derived和脾DCs是收获,在寒冷的PBS,洗和resuspended裂解缓冲包含三50 mM,氯化钠0.15米,德勤1毫米,特里同x - 100 1% (v / v)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒。细胞溶解产物分离10% sds - page凝胶,转移到硝酸纤维素(Hybond-ECL Amersham生物科学,简化d 'Urfe, QC)和孵化隔夜主要抗体,其次是适当的二次抗体和揭示了增强化学发光(通用电气医疗、简化d 'Urfe, QC)。量化的西方乐队强度是由微x射线分析电影使用NIH图像软件(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)。

2.7。流式细胞术

细胞被洗一旦与PBS补充2.5%牛血清白蛋白(PBS-BSA)和孵化表示马伯的20分钟在4°C。IRF4的IRF8细胞内染色,细胞与4%多聚甲醛固定1 h在4°C, permeabilized与流式细胞仪缓冲区包含0.1%的皂苷和沾anti-IRF4 IRF8 Abs或antirat IgG2a 30分钟在4°C。细胞被洗两次PBS-BSA和流式细胞仪分析了使用CellQuest软件(BD生物科学)或FCS表达V3软件(新创软件、洛杉矶CA)。

2.8。统计分析

使用双尾未配对学生的两组进行比较测试。当两组比较,单向方差分析Dunnett使用多重比较的测试。时被认为是具有统计学意义的差异。数据报告这是代表2 - 3个独立的实验。柱状图和柱状图结果显示为均值±SEM。

3所示。结果

3.1。IRF4但不是IRF8点头小鼠的脾细胞基因表达增加

在第一系列的实验中,我们使用定量PCR (qPCR)评估基因表达IRF4和IRF8脾细胞与前驱糖尿病的糖尿病NOD小鼠以及控制diabetes-resistant句话也和BALB / c小鼠。我们发现IRF4的mRNA表达的水平略(但不显著提高)在三星期的老点头的脾细胞()小鼠的脾细胞相比diabetes-resistant BALB / c ()和()、C57BL / 6 (),或者CD1 ()小鼠(图1(一))。IRF4的水平mRNA表达明显()的脾细胞增加7 - 10,细致谨慎,老糖尿病NOD小鼠(和、职责)与3周相比老点头老鼠和老鼠diabetes-resistant(图1(一))。然而,IRF4的表达保持不变的脾细胞3 - 6 - 10 -,或提供旧也和BALB / c小鼠(数据未显示)。有趣的是,IRF4脾细胞基因表达的非糖尿病患者提供老点头小鼠显著降低(细致谨慎)比旧的糖尿病NOD小鼠(相比)(图1(一))。

IRF8基因表达分析显示类似的IRF8 mRNA水平脾细胞BALB / c和抓捕老点头老鼠(而不是)(图1 (b))。此外,IRF8基因表达明显()的脾细胞增加7 - 10,细致谨慎,老点头老鼠(图1 (b))。相比之下,IRF8基因表达相似的水平提供旧的非糖尿病患者和糖尿病NOD小鼠的脾细胞(而不是)(图1 (b))。

我们下决定是否改变IRF4的表达和IRF8基因匹配的蛋白质含量的变化。脾细胞的总蛋白提取准备点头BALB / c小鼠和IRF4的表达和分析了IRF8西方的屁股(图2)。结果表明,IRF4表达明显高于()在三星期的老点头小鼠脾细胞比在BALB / c小鼠(而不是)(数据2(一个)和2 (b))。IRF4表达式略而不显著()高7 - 10 -,提供旧的非糖尿病患者和糖尿病NOD小鼠(,,,、职责)相比IRF4表达式在抓捕老点头老鼠(数字2(一个)和2 (b))。相比之下,IRF8蛋白质含量的脾细胞3 -和7-week-old点头老鼠类似于BALB / c小鼠(,相比,)。IRF8蛋白质含量都明显高于()在10 -和20-week-old非糖尿病和糖尿病NOD小鼠(,,、职责)相对于BALB / c ()小鼠(数据2 (c)和2 (d))。在一起,这些结果表明,基因和蛋白质表达水平IRF4的调节diabetes-prone点头小鼠的脾而IRF8水平保持不变在3和7周的年龄,和略增加10到20周大的老鼠相比,BALB / c小鼠。

3.2。IRF4与增强CD4的表达增加⁺CD8α⁻CD11c⁺脾DCs NOD老鼠

确定微分表达式IRF4和IRF8脾细胞的老鼠居住在脾DCs点头,我们检查了IRF4的蛋白表达水平和IRF8 CD11c西方的屁股⁺纯化脾DCs 8-week-old点头和BALB / c小鼠。结果显示(图3(一个))IRF4的表达高于脾DCs点头的老鼠相比BALB / c小鼠()。相比之下,IRF8表达相似的两株小鼠的脾DCs(图3 (b))。自IRF4 IRF8已被证明对CD4的发展至关重要⁺CD8α⁻CD11c⁺和CD4⁻CD8α⁺CD11c⁺子集,分别9),我们决定是否改变IRF4和IRF8表达点头BALB / c小鼠脾DCs的影响这两个DCs子集的比例。流式细胞仪分析结果(图3 (c))在CD4的百分比显示没有区别⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺在DCs子集的质询点头和BALB / c小鼠的脾细胞(而不是,)。脾脏CD4的百分比⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺DCs子集明显()增加7 - 10 -和20-week-old点头老鼠(在7周,在10周在20周)相比3周大(点头)和BALB / c (老鼠)。此外,在脾脏CD4没有明显差别⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺DCs子集在7 - 10 -,20-week-old非糖尿病患者和糖尿病NOD小鼠。相反,一个缺乏差异指出在CD4的百分比⁻CD8α⁺IRF8⁺CD11c⁺DCs子集BALB / c小鼠的脾细胞和糖尿病或非糖尿病的老鼠(图点头3 (d))。在一起,这些数据表明,高表达IRF4点头老鼠与增强脾脏CD4有关⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺但不是与脾脏CD4 DCs子集⁻CD8α⁺IRF8⁺CD11c⁺DCs子集。

3.3。增加表达IRF8和IRF4 BMDCs点头的老鼠

缺陷在表型和耐受性的函数BMDCs点头老鼠还与糖尿病相关的20.,21]。我们有报道说,治疗的小鼠gm - csf点头恢复骨髓DCs的耐受性功能(24]。此外,BMDCs生成与低剂量的gm - csf具有耐受性函数相比,免疫原性BMDCs生成与gm - csf和il - 4 (27](Guindi et al .,未公开的数据)。因此,我们决定IRF4的表达式和IRF8 BMDCs点头老鼠的生成与gm - csf或gm - csf和il - 4的组合。BMDCs产生BALB / c小鼠作为控制。这两组实验条件下,95%以上的BMDCs CD8α⁻CD11c⁺细胞。结果表明,BMDCs生成与两株小鼠gm - csf表达了类似的水平IRF4由qPCR(图4(一))和免疫印迹(数字4(b)和4(c))。IRF4表达增加BMDCs生成与gm - csf和il - 4和显著提高()在点头而BALB / c小鼠(数字4(一),4(b)和4(c))。的表达IRF8 BMDCs相似的两株小鼠gm - csf(数据生成4(d),4(e)和4(f))。然而,BMDCs生成与gm - csf和il - 4表达明显()高水平的IRF8相比与gm - csf BMDCs生成。IRF8的重要的是,表达水平更高的免疫原性BMDCs生成与gm - csf和il - 4从点头的BALB / c小鼠(数字4(d),4(e)和4(f))。这些结果表明IRF4和IRF8高度表达的免疫原性BMDCs生成与gm - csf和il - 4的两株小鼠,而他们的表达显著降低的耐受性BMDCs生成与gm - csf。

4所示。讨论

在这项研究中,RNA基因表达和蛋白质分析被用来研究两个转录因子的表达谱IRF4和IRF8已知在DCs分化中发挥重要作用[9- - - - - -13]。我们发现IRF4的表达在脾DCs和增强免疫原性BMDCs但不耐受性BMDCs点头的老鼠。IRF4表达增加与CD4的比例更大⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺DCs但不是CD4⁻CD8α⁺IRF8^{- - - - - -}CD11c⁺DCs。相比之下,IRF8表达式保持不变在脾DCs的点头diabetes-resistant BALB / c小鼠虽然在免疫原性BMDCs但不显著增加耐受性BMDCs点头的老鼠。

1型糖尿病的发展在于一系列事件中基因表达的变化发挥了至关重要的作用从胰岛炎临床糖尿病进展28,29日]。微阵列技术的发展提供了一种新方法去理解糖尿病发病机制和识别基因管制在1型糖尿病包括点头老鼠(29日,30.]。IRF4是一个候选基因位于idd14易感性地区疑似扮演一个角色发展的1型糖尿病NOD小鼠(29日]。IRF8,另一个重要候选基因在调节Th2免疫反应,已建议糖尿病发病中发挥重要作用[29日]。在这里,我们发现高水平的mRNA和蛋白表达IRF4的脾细胞点头老鼠BABL / c小鼠相比。IRF4表达尤其发现增加7周以上点头小鼠胰岛已经发生炎症和糖尿病NOD小鼠。这些结果表明,老年病IRF4的表达可能在糖尿病发展发挥重要作用diabetes-prone点头老鼠。我们的结果不能被解释为对Th1反应引发免疫反应。在这一点上,几项研究已经报道,糖尿病NOD小鼠是一种Th1-mediated疾病和immuno-deviation向Th2反应有助于预防糖尿病的发展(31日- - - - - -34]。值得注意的是,IRF4已被证明是必不可少的Th2反应,和幼稚T细胞的老鼠缺乏IRF4破坏生产的il - 4和Th2细胞因子(35]。另外,增加IRF4表达式在点头小鼠胰岛炎和糖尿病发展可能也解释了IRF4的要求对生产和响应性IL-21和稳定的Th17表型(36- - - - - -38)已被证明是至关重要的发展1型糖尿病(39]。这个观察也可以解释IRF4的表达式在20-week-old非糖尿病的老鼠而不是点头20-week-old糖尿病NOD老鼠。相比之下,增加IRF8表达式diabetes-prone点头小鼠的脾脏可能的结果高干扰素的生产γ这是在巨噬细胞和T细胞诱导IRF8表达式(40]。

IRF4和IRF8发挥关键作用在分子程序调节DCs发展和功能(9- - - - - -13]。DCs已报告发育和功能异常与糖尿病有关人类和老鼠[点头20.,21,41]。在这里,我们发现,脾DCs的点头老鼠表达高水平的IRF4 DCs的非糖尿病患者相比,点头老鼠和BALB / c小鼠,而IRF8相似的表达在脾DCs点头BALB / c小鼠。IRF4的表达NOD小鼠与CD4的数量的增加⁺CD8α⁻IRF4⁺CD11c⁺DCs子集,从而确认IRF4 CD4的发展起到了推波助澜的作用⁺CD11c⁺DCs (9,42]。此外,我们的数据表明,增加和CD4 IRF4表达式⁺CD8α⁻CD11c⁺IRF4⁺DCs人口点头老鼠与DCs的功能异常diabetes-prone点头老鼠。一些研究也报道异常来源于DCs点头小鼠的骨生成的函数与gm - csf和il - 4的组合。例如,它发现autoreactive T细胞激活和增强能力IL-12p70产量的增加导致了糖尿病NOD小鼠的发展(43,44]。我们也观察到BMDCs点头老鼠,生成免疫原性与gm - csf低于BMDCs生成与gm - csf和il - 4 (Guindi等人提交)。这就促使我们比较IRF4的表达和IRF8 BMDCs生成与gm - csf和gm - csf和il - 4的组合。IRF4和IRF8少表达与gm - csf BMDCs生成而他们更表达BMDCs生成gm - csf和il - 4, IRF4和IRF8可能减弱差别表明对这些异常的免疫原性的函数BMDCs NOD老鼠。支持这个解释,几项研究已经报道,IRF8有助于生产的IL-12p70充当IL-12p35和IL-12p40基因的转录激活因子(45- - - - - -48]。因此,我们的研究结果的高表达DCs的IRF8点头老鼠可以解释他们的异常高IL-12p70的生产。我们的数据也表明,水平的提高IRF4 DCs贡献他们的异常功能点头老鼠。支持这个解释,IRF4的转录已被证明是由NF -κB元素位于IRF4启动子区域绑定Rel / NF -κB复合物(49]。在这种情况下,增加了NF -κB激活报道显示的基本功能BMDCs 1型糖尿病的发展(50]。因此,增强NF -κB激活的DCs点头老鼠导致hyperactivation可能导致从调节IRF4的表情。

我们的数据报道一个增强IRF4和IRF8 DCs功能参与1型diabetes-susceptible点头老鼠而不是控制,非糖尿病的老鼠。进一步调查IRF4的角色和IRF8糖尿病发展可能有助于确定IRF4和/或IRF8可能潜在目标在1型糖尿病的治疗干预。

缩写

DCs:	树突细胞
BMDCs:	骨骨髓来源树突状细胞
gm - csf:	粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
IRF:	干扰素调节因子。

确认

作者感谢anne - marie霍格动物保健和技术援助。这项工作受到了来自国际青少年糖尿病基金会的补助金。g .坞从协会奖学金的持有者de法语语言倒向我杜糖尿病et des疾病Metaboliques (ALFEDIAM)。美国Gaudreau是收件人的博士奖学金昏聩de la矫揉造作的魁北克en桑特(FRSQ)和加拿大健康研究所(CIHR)。答:领导是加拿大人糖尿病协会新的调查员和接受者的Chercheur Boursier FRSQ初级1和2。