文摘

背景。吸入的颗粒直径小于2.5μ米(PM2.5)在空气污染可能会导致肺损伤。Gu-Ben-Zhi-Ke-Zhong-Yao (GBZK)是一种传统的中药处方,对治疗有益影响慢性阻塞性肺疾病(COPD)。然而,在PM2.5-induced GBZK肺损伤的影响仍有待阐明。方法。我们建造了一个小鼠肺损伤模型通过PM2.5刺激同时执行GBZK填喂法治疗。4周后,小鼠的肺组织收集病理染色分析损伤的程度。的活动髓过氧化酶(MPO),丙二醛(MDA)和氧化应激相关因素(超氧化物歧化酶SOD;谷胱甘肽过氧化物酶、氧化酶)在肺组织被商业工具。此外,中性粒细胞的数量及相关炎症因素(interleukin-1, il - 1β;肿瘤坏死因子α肿瘤坏死因子-α;白细胞介素- 6 (il - 6)在支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清收集和测试来评估GBZK对炎症的影响。马森染色是用于检测小鼠肺纤维化的程度。HMGB1的激活(高机动组蛋白1)和NFκBp65(核因子k B)在肺组织评估免疫组织化学和免疫印迹。结果。结果显示,PM2.5诱发肺损伤,GBZK填喂法治疗浓度的方式可以减少损伤的程度在老鼠身上。GBZK治疗后,MPO活性、MDA含量、和小鼠的肺组织氧化应激水平下降。GBZK治疗之后,BALF和血液中炎性细胞因子的表达水平下降。也改善了肺纤维化小鼠GBZK治疗。此外,我们还发现,GBZK阻止HMGB1的老年病/ NF -κB轴小鼠的肺中。结论。这些结果表明,GBZK可能保护小鼠免受PM2.5-induced肺损伤通过抑制HMGB1 / NFκB通路,从而抑制炎症和肺纤维化。

1。介绍

空气污染主要是由于过度排放的工业废气和汽车尾气已成为呼吸系统疾病的主要原因之一(1]。其中,大气中的悬浮颗粒物(PM)被认为是最具代表性的空气污染物,特别是可吸入颗粒物(直径≤10μ米)直径和微粒(≤2.5μ米,PM2.5) [2]。长期接触环境中的可吸入颗粒物而遭到谴责可能对人类健康构成严重威胁3]。尤其是对PM2.5,它可以通过人的呼吸道进入肺泡,其中部分仍在肺部,引起呼吸道感染,另一部分通过血液循环进入人体,导致心血管疾病,系统性炎症,甚至肺癌(4]。当大量的PM2.5累积在肺部,反复肺上皮细胞受损,导致肺纤维化(5]。同时,肺泡巨噬细胞释放过度炎症因素导致肺损伤(6]。

Gu-Ben-Zhi-Ke-Zhong-Yao (GBZK)是一种中药配方由曹教授Enxiang根据病理特征的慢性阻塞性肺疾病(COPD),基于三种中药黄芪,Fangfeng,白术(7]。使用GBZK COPD患者的临床治疗非常有效,而且没有明显的副作用(8]。此外,动物实验也表明,GBZK有很好的影响维护气道壁的完整性,促进肺部炎症的修复(9]。然而,GBZK的监管机制在肺损伤,尤其是PM2.5-induced肺损伤,尚不清楚。

高机动组盒1蛋白质(HMGB1)是一种高度保守的核DNA结合蛋白,参与炎症反应(10]。晚期炎症细胞因子,老年病的HMGB1可能导致过度炎症反应通过刺激细胞产生炎性因子(11]。抑制HMGB1在急性肺损伤的表现证明减少炎症和组织损伤12,13]。抑制HMGB1的表达在急性肺损伤(Ali)被证明通过调节NF -减少炎症和组织损伤κB信号(14,15]。范Yu-Xiang等人的研究发现施马兴甘汤能抑制HMGB1体内和体外减少PM2.5-induced炎症和急性肺损伤(3]。然而,它还没有报道GBZK能否改善PM2.5-induced抑制HMGB1的急性肺损伤。

本研究旨在确认GBZK在肺损伤的疗效造成的pm 2.5及其可能的分子机制和开发一个新的肺损伤和安全的治疗方案由pm 2.5。

2。材料和方法

2.1。制备GBZK

巩固咳嗽的中药是由黄芪、果实毛皮,白术macrocephala、淫羊藿、柴胡、黄芩、基数Paeoniae和购买的中日友好医院。药物制成干燥提取了中日友好医院的准备室,北京,中国,包含4 g的药材每毫升。在实验中,它被配置为3种不同浓度的0.2、0.4、0.8 g药材/毫升。

2.2。购买和饲养动物和PM2.5-Induced肺损伤模型的建立

50个成年女性多嘴的人/ c小鼠(18-25g)从北京购买MaiDeKangNa生物技术公司。食物和水的育种提供了SPF级实验室根据饲养标准。根据实验要求,老鼠被分成5组:控制,PM2.5, PM2.5 + GBZK L(8克/公斤/天),PM2.5 + GBZK M (16 g /公斤/天),和PM2.5 + GBZK H (32 g /公斤/天)。

PM2.5样品收集从2021年3月到2021年4月使用空气取样器在公开10层楼的建筑屋顶的中日友好医院、北京。净化,过滤被预热到550°C。然后,他们平衡和稳定(20±0.5°C, 40±5% RH)在抽样之前。包含样本的过滤器切成1厘米×1厘米大小,沉浸在消毒ddH2O,筛选了超声冲击三次。洗出液是通过医疗纱布过滤,然后冷冻干燥在真空冷冻干燥器中脱和密封存储的−80°C。在使用之前,PM2.5颗粒在磷酸盐(PBS)的浓度为10毫克/毫升粒子悬浮。

除了对照组,其他四组的小鼠暴露PM2.5刺激通过连续4周的鼻内滴PM2.5(7.5毫克/公斤体重/天),并给予不同浓度的GBZK填喂法在同一时间为4周。对照组给予等量的生理盐水。

所有英汉动物实验已经通过中日友好医院的伦理委员会,北京,中国。

2.3。Hematoxylin-Eosin(他)染色分析

简而言之,肺组织的厚度不超过0.5厘米是放到preprepared固定剂(10%福尔马林,Bouin固定剂等)对组织固定。然后,我们使用不同浓度的酒精,二甲苯,石蜡脱水和嵌入,使石蜡组织块部分。然后,使用二甲苯脱蜡,部分与酒精和蒸馏水冲洗5次为5分钟,然后用苏木精染色。接下来,片与去离子水冲洗1分钟和伊红染色。片与乙醇脱水,然后,二甲苯是补充道。最后,幻灯片是固定的,在显微镜下的部分进行了分析。

2.4。肺湿干比(W / D)

小鼠肺组织收集并称重,组织是在烤箱干80°C 36 h,和干重是重。

2.5。MPO活性和MDA含量的分析

0.1 g从小鼠肺组织收集、MPO水平检测采用髓过氧化酶(MPO)荧光活动分析工具包(美国BioVision k745 - 100)根据指令。组织中的MDA含量检测使用丙二醛(MDA)含量检测设备(BC0020 Solarbio,中国)。

2.6。分析SOD和氧化酶活力

小鼠肺组织样本检测SOD活性使用总SOD活性检测设备(WST-8方法)(中国S0101S Beyotime)根据指令。老鼠谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)ELISA检测组件(中国JL20363 Laibio)是用于检测样品中的氧化酶活力。

2.7。BALF检测BALF细胞总水平和中性粒细胞的水平

3毫升血液从老鼠的腹主动脉受到2800 g和离心20分钟,和血清收集。通过小鼠气管插管,左肺洗3次,0.5毫升的冰PBS,然后,BALF收集。收集到的样本在800 g离心10分钟。细胞离心获得的颗粒在100年暂停了µL PBS,总细胞数与血细胞计数器测量(上海法,中国)。细胞被染色Wright-Giemsa(中国RBR00502 Rongbio) 10分钟。最后,通过一个光学显微镜不同的细胞数。

2.8。ELISA检测炎症因子

按照说明书的要求,炎症因子的水平被ELISA试剂盒检测。按照指令要求,炎症因子(il - 1的水平β肿瘤坏死因子-α鼠标(il - 1和il - 6)进行检测β酶联免疫试剂盒(SBJ_M0583 sbjbio,中国),小鼠肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)酶联免疫试剂盒(sbjbio sbj m0030 - 96 t,中国),和鼠标白介素6 (il - 6)酶联免疫试剂盒(SBJ-M0044 sbjbio,中国)。

2.9。马森污点

小鼠肺组织的石蜡切片deparaffinized。与去离子水冲洗后切片,切片与Regaud的苏木精染色染料溶液和蒸馏水冲洗5次后10分钟。然后接受马森的朱红色的部分酸性品红8分钟。后来,它被浸泡在2%冰醋酸水5分钟(棉酚)的解决方案,和1%的磷钼酸水溶液加入区分片。5分钟后,部分直接与苯胺蓝染色5分钟。最后,片0.2%棉酚水溶液中浸泡5分钟,然后用无水酒精,二甲苯,中性树胶,光学显微镜下观察到。

2.10。免疫组织化学

首先,deparaffinized小鼠肺组织的石蜡切片。8分钟的部分被孵化3% H2O2在室温下,然后用蒸馏水冲洗3次,浸泡在PBS为5分钟。然后,10%正常山羊血清用于阻止部分在室温下10分钟。节和初级抗体αsma(英国Abcam ab232784)和胶原蛋白我(英国Abcam ab270993)孵化一夜之间在4°C和PBS洗3次。然后,biotin-labeled二级抗体被加入到片和孵化为30分钟37°C。然后,它与PBS冲洗3次,部分与辣根enzyme-labeled孵化链霉亲和素在室温下为30分钟。最后,diaminobenzidine用于颜色的部分,部分与苏木精复染色。染色结果通过光学显微镜观察和记录。

2.11。免疫印迹

首先,小鼠肺组织细胞溶解了里帕裂解缓冲。Bicinchoninic酸(BCA)是用于检测总蛋白。然后,相同数量的蛋白质10% sds - page分离,和蛋白质乐队被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。洗后TBST缓冲区,它被5%的脱脂牛奶2 h,孵化主要抗体αsma (ab232784, Abcam,英国),胶原蛋白我(ab270993, Abcam,英国),HMGB1 (ab18256, Abcam,英国),p-NF -κAbcam Bp65 (ab 183559年,英国),ß肌动蛋白(英国Abcam ab8226)在4°C一夜之间,并与PBS洗3次。然后,它是孵化HRP-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体在室温下2小时。最后,一个增强化学发光(ECL)解决方案(美国微孔)的发展了。ImageJ 1.50被用于定量分析。

2.12。统计分析

所有数据显示从三个独立的实验中,平均±SD和GraphPad Prism 5.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)软件用于数据分析。单向方差分析(方差分析)是用于区别分析,和图基的事后测试是用于多个组之间的比较。 < 0.05在统计学上意义重大。

3所示。结果

3.1。GBZK减弱PM2.5-Induced肺损伤

首先,为了验证GBZK对肺损伤的影响,我们构建了一个肺损伤小鼠模型由pm 2.5。三种不同浓度(0.2,0.4,和0.8 ml / d)的GBZK被填喂法管理受伤的老鼠。4周后,小鼠肺组织收集因为他染色(图1(一))。所有肺结构在pm 2.5治疗组包括细支气管、肺泡,和肺血管受伤严重,主要表现为肺泡动脉外膜增厚,出血,肺水肿,而控制。GBZK随着处理浓度的增加,肺组织的病理改变逐渐减少。此外,在GBZK治疗组,肺损伤评分明显低于2.5 pm刺激组(图1 (b))。肺wet-to-dry比率的进一步测试发现pm 2.5治疗后肺水含量明显增加,而肺wet-to-dry GBZK治疗的比例减少,特别是浓度为0.8毫升/ d治疗是最重要的(图1 (c))。上述结果表明,GBZK pm 2.5 -诱导肺损伤减轻。

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图1
GBZK减弱PM2.5-induced肺损伤。PM2.5-induced肺损伤模型小鼠的构建,或者GBZK接受治疗。(一)肺组织损伤的评估他染色。(b)肺组织学损伤分数。(c)的影响GBZK PM2.5引起的肺wet-to-dry比率。n = 10, < 0.05, < 0.01, < 0.001。
3.2。GBZK减弱PM2.5-Induced氧化应激

我们进一步分析了氧化stress-correlative蛋白(MPO、MDA、SOD和氧化酶)对小鼠肺组织的影响评估GBZK在肺组织氧化应激的程度。pm 2.5诱导肺组织MPO和MDA活动的增加,和GBZK治疗后,MPO和MDA浓度的方式活动减少(数字2(一个)和2 (b))。最后,SOD水平和氧化酶被检测到,并表明,SOD的含量和氧化酶pm 2.5 -诱导组降低,SOD水平和氧化酶GBZK治疗后提出了数字2 (c)- - - - - -2 (d))。上述结果表明,GBZK减毒引起的肺组织氧化应激的pm 2.5。

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图2
GBZK减弱PM2.5-induced氧化应激。(a)的影响GBZK在肺组织MPO活性。(b) GBZK在肺组织MDA含量的影响。(c)的设备检测SOD的活性和(d)氧化酶的肺部组织。n = 10, < 0.05, < 0.01, < 0.001。
3.3。GBZK变弱PM2.5-Induced炎症反应

为了探索GBZK的调节小鼠肺组织的炎症反应,我们首先收集小鼠血液和BALF和计算总细胞水平和中性白细胞水平。总BALF中细胞和中性粒细胞的数量由pm 2.5增加,而GBZK治疗大大降低总细胞和中性粒细胞(数据的数量3(一个)和3 (b))。检测炎症因子(il - 1的水平β肿瘤坏死因子-αil - 6)在小鼠的血液,ELISA表明pm 2.5引起血液中炎性因子的表达,而炎症因子的表达水平降低GBZK治疗后的数字3 (c)- - - - - -3 (e))。炎症因子的表达水平的进一步检测BALF中发现,与血液中的水平一致,pm 2.5 BALF诱导炎性因子的表达水平,而GBZK治疗减少炎症因素(人物的血3 (f)- - - - - -3 (h))。总之,结果表明GBZK减点- 2.5 -诱导炎症反应在鼠标。

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图3
GBZK变弱PM2.5-induced炎症反应。小鼠血清和BALF收集。(一)——(b)的影响GBZK总BALF细胞水平和中性白细胞水平。(c) - (d) (e) ELISA检测血清il - 1的含量β肿瘤坏死因子-α,il - 6。(f) - (g) - (h) ELISA检测il - 1的水平β肿瘤坏死因子-α和BALF中il - 6。n= 10, < 0.05, < 0.01, < 0.001。
3.4。GBZK变弱PM2.5-Induced肺纤维化

我们进一步分析了影响GBZK pm 2.5 -诱导小鼠肺纤维化。首先,我们使用马森染色检测小鼠肺纤维化的程度。pm 2.5诱导小鼠肺组织纤维化,大量胶原纤维沉积和肺间质增厚(图4(一))。GBZK治疗后,pm 2.5 -诱导纤维化过程被抑制,和肺组织中胶原纤维的积累减少(图4(一))。纤维标记(α进一步免疫组织化学和免疫印迹分析SMA和I型胶原)表明,pm 2.5能够诱导小鼠肺组织的upregulation纤连蛋白的表达。然而,在肺组织纤维化标记蛋白质的表达抑制GBZK治疗后(数字4 (b)和4 (c))。总之,我们发现GBZK改善pm 2.5 -诱导肺纤维化。

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图4
GBZK变弱PM2.5-induced肺纤维化。马森(a)染色法检测小鼠肺纤维化的程度。(b)免疫组织化学染色检测的表达α我在肺组织sma和胶原蛋白。(c)免疫印迹检测的表达α我在肺组织sma和胶原蛋白。n = 10, < 0.05, < 0.01, < 0.001。
3.5。GBZK抑制PM2.5-Induced HMGB1 / NF-Κb通路

最后,我们测试了HMGB1表达水平和NF -的激活κB验证GBZK能否改进pm 2.5 -诱导肺损伤通过调节HMGB1 / NF -κB轴。免疫组织化学检测显示,pm 2.5诱导HMGB1的水平和NF -磷酸化κBp65亚基对小鼠肺组织。GBZK治疗显著降低pm 2.5 -诱导HMGB1表达和NF -κBp65磷酸化(图5(一个))。免疫印迹进一步验证,pm 2.5诱导HMGB1的水平和NF -磷酸化κBp65, GBZK治疗逆转这种效果(图5 (b))。简而言之,我们的测试显示,GBZK抑制pm 2.5 -诱导HMGB1 / NF -κB轴在小鼠的肺部组织。

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图5
GBZK抑制PM2.5-induced HMGB1 / NF -κB通路。(a)免疫组织化学染色法是用来检测HMGB1的表达和NF -的磷酸化水平κBp65在肺部组织。(b)免疫印迹检测HMGB1表达和NF -κ肺组织Bp65磷酸化水平。n = 10, < 0.05, < 0.01, < 0.001。

4所示。讨论

根据世界卫生组织的统计,2015年有380万人死于空气污染(16]。PM2.5和人类进入肺部吸入被污染的空气。一些PM2.5颗粒可能会导致各种各样的裂化反应产生自由基,这些自由基会导致细胞过氧化反应和炎症(17];另一方面,肺泡巨噬细胞释放炎性因子席卷PM2.5 (18,19]。这些原因直接导致炎症反应的发生,从而导致肺损伤(20.,21]。我们确认在老鼠实验中证实,pm 2.5引起肺损伤小鼠和诱导氧化应激,炎症,肺组织和肺纤维化。

GBZK在临床和动物实验中证实了改善肺损伤(7]。先前的研究已经证实GBZK的三个主要组成部分,黄芪,Fangfeng,白术可以显示保护和治疗效果在急性肺损伤大鼠22- - - - - -24]。特别是,它最重要的影响减少氧化应激和炎症因子与肺损伤大鼠。我们的研究在老鼠身上也进一步证实了GBZK pm 2.5的缓解的效果——诱导肺损伤。我们的研究不仅证实GBZK改善氧化应激和炎症因子的释放引起的小鼠的肺组织中pm 2.5还发现GBZK可以改善pm 2.5 -诱导小鼠肺纤维化。

HMGB1可能发布的巨噬细胞炎性因子或坏死细胞(25- - - - - -27]。HMGB1在细胞质中可能会导致肺损伤和癌症通过激活其下游炎症通路(28- - - - - -31日]。它一直声称,HMGB1和NFκB信号通路被激活的PM2.5刺激诱导的大鼠肺损伤组织(3]。NF -κB信号被证明促进促炎症基因的表达在炎症反应和免疫调节的关键途径[32]。HMGB1可以激活NF -κB途径直接或间接促进炎性因子的释放(33- - - - - -35]。在我们的研究中,我们不断发现pm 2.5感应可以促进HMGB1和NF -释放和激活κb . GBZK治疗后,小鼠肺组织HMGB1含量的减少,和NF -的激活κB被抑制。我们推测GBZK可能通过HMGB1 / NF -治疗肺损伤κB轴。

中药配方注重病人和增强人体的自然活动以辩证的方式。相比之下,西方医学关注疾病的症状。中药配方的力量在于个性化和全面考虑治疗。然而,中药配方通常是复杂的,包含多个组件。中药配方的弱点可能是目标识别的难度;此外,即使正在努力揭示中药配方的药理机制,机制可能并不容易,充分阐明。研究显示肺损伤保护作用的中草药配方,包括急性肺损伤和COVID-19 [36,37]。然而,他们中的大多数都集中在炎性细胞因子,氧化应激,炎症细胞浸润。此外,药理作用的物质基础antilung损伤应该澄清提供科学依据肺损伤的预防和治疗,中药配方。

总之,本研究表明,GBZK阻止pm 2.5 -诱导肺损伤通过抑制氧化应激,炎症因子的释放,肺纤维化的生产。GBZK和减轻的机制可能与抑制HMGB1 / NF -κB轴。我们的研究提供了一种新的策略,肺损伤的预防和治疗。

缩写

PM2.5: 颗粒直径小于2.5μ米
慢性阻塞性肺病: 慢性阻塞性肺疾病
GBZK: Gu-Ben-Zhi-Ke-Zhong-Yao
MPO: 髓过氧物酶
MDA: 丙二醛
BALF: 支气管肺泡灌洗液
HMGB1: 高机动组盒1蛋白质
国家卫生研究院: 美国国立卫生研究院的
BCA: Bicinchoninic酸
PVDF: 聚偏二氟乙烯
发射极耦合逻辑: 化学发光。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

所有英汉动物实验已经通过中日友好医院的伦理委员会,北京,中国。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81774265)和基础研究基金为中央大学(3332019115)。