文摘

背景。左西孟旦预处理可以减弱心肌细胞凋亡在动物模型。然而,左西孟旦后处理对心肌细胞凋亡的保护作用心肌梗塞(MI)后尚未进行评估。因此,我们调查的影响左西孟旦后处理对心肌细胞凋亡在心肌梗死大鼠模型。方法。在缺氧/复氧(A / R)模型,H9c2细胞被使用或没有左西孟旦后处理之后,评估他们的细胞凋亡率通过流式细胞术,RT-qPCR和免疫印迹分析。然后,有或没有执行后处理左西孟旦心肌梗死大鼠模型。Myocardiocyte凋亡是由超声心动图评估,TTC染色,TUNEL染色、免疫组织化学染色,RT-qPCR,免疫印迹分析。结果。左西孟旦后处理抑制H9c2 bcl - 2细胞凋亡/ R模型通过提升而抑制Caspase-3和伯灵顿mRNA和蛋白水平。此外,它改善心脏功能,减少左心室梗死区心肌梗死大鼠模型。MI组相比,左西孟旦后处理组心肌细胞凋亡率低。减少心肌细胞凋亡率的差别与对这些伯灵顿和Caspase-3以及upregulation bcl - 2 mRNA和蛋白水平。结论。左西孟旦后处理对心肌梗死大鼠模型的保护心肌细胞凋亡,这意味着这是一个潜在的策略防止心肌细胞凋亡在心肌梗死后的心脏功能障碍的治疗。

1。介绍

急性或慢性心肌梗死是由于冠状动脉阻塞后心肌细胞缺血,导致继发性心肌细胞坏死(1]。在全球范围内,心肌梗死与高死亡率和相当高的治疗费用(2,3]。心肌梗塞是冠心病的严重类型,这是由于急性或慢性心肌缺血后冠状动脉系统内腔或阻塞由于各种原因。此外,心肌坏死发生,从而导致心脏破裂,室间隔穿孔,乳头状肌破裂,心原性休克、心力衰竭,甚至死亡。因此,心肌梗死的诊断设备和药物治疗,以及预防机制研究如何提高心肌细胞的功能正在成为研究的重点。这是一个意义重大改善心脏功能和MI患者的存活率1,4]。

一种新型钙敏化剂,左西孟旦各种药理心血管益处,包括正性肌力与节能强心的作用,抗炎作用,和凋亡的影响5,6]。在心脏手术中,左西孟旦已成功用于治疗术前和围手术期心脏衰竭(7,8]。左西孟旦预处理预防心肌缺血性损伤和抑制心肌细胞凋亡在缺血-再灌注(I / R)模型(9- - - - - -13]。除了缺血再灌注损伤,临床上明显的患者出现心肌梗塞(MI)由于长期的急性冠状动脉闭塞。心肌梗死与心肌细胞凋亡有关,它的特点是一个不可逆转的丧失功能的心肌细胞,减少冠状流储备,和心脏障碍(14]。在正常治疗,应用左西孟旦急性心肌梗塞前可能是受限制的(15]。缺血后处理可以显著减少梗塞大小而发挥心血管效应(16- - - - - -19]。因此,MI患者可能受益于替代治疗策略包括后处理挽救缺血心肌,改善手术或生存的结果。最近的研究提出了左西孟旦后处理心肌梗死治疗。然而,尚未建立左西孟旦对是否对心肌梗死后心肌细胞凋亡保护作用。

左西孟旦已经使用在临床实践。阐明疗效的左西孟旦后处理心肌梗死后,我们研究它的凋亡效应在体外缺氧(A / R)模型。然后,我们建立了在活的有机体内急性心肌梗塞(AMI)模型,观察左西孟旦对心肌梗死后心肌细胞的影响。因此,我们将澄清一个点来确定这种治疗对心肌梗死后心肌细胞凋亡有保护效应。这种效应有积极意义,澄清相关的心肌细胞凋亡机制。

2。材料和方法

2.1。建立在体外缺氧-复氧H9c2细胞(A / R)模型

H9c2细胞培养在high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)和presaturated 1 h和N的95%₂/ 5%股份有限公司₂。确保(PO₂)≤4.0 kPa, O₂分压测量使用血液气体分析仪。此外,再氧化介质制备和presaturated 1 h O为95%₂/ 5%股份有限公司₂维持订单₂= 20.9 kPa。

H9c2细胞(上海生物科学研究所)在缺氧培养媒体3 h和离心机。然后,缺氧H9c2细胞放置在复氧媒体2 h的细胞悬液离心后获得的细胞。缺氧/ reoxygenated H9c2细胞分为两组:A / R和A / R +左西孟旦组(A / R +左旋的)。A / R组细胞培养在正常的媒体,而在A / R +左旋的组在正常培养媒体补充0.3µmol / L左西孟旦(齐鲁制药、中国)。另外,对照组细胞没有/ R培养在正常的媒体。24小时后,从每组H9c2细胞消化,离心机,收获,用于后续实验。

2.2。流式细胞术

一个FITC膜联蛋白V凋亡检测设备(美国BD)被用来测定凋亡H9c2细胞。在每个fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)管,100μl细胞悬液(1.0×10⁶细胞),100μl染色的缓冲区,和5μ添加了l的膜联蛋白V和propidium碘,之后样本孵化所指示的制造商。凋亡细胞被FACSCanto评估二流式细胞分析仪与FACSDiva 6.1.2软件(美国BD)用于数据分析。

2.3。RT-qPCR

从H9c2细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体),而一体化™合成第一链cDNA工具包(美国GeneCopoeia)是用于合成第一链cDNA指示的制造商。由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(罗氏公司、德国)和PikoReal 96孔系统(美国热费希尔)被用于RT-qPCR分析,表现在三个独立的实验。引物设计软件使用的引物5(加拿大总理Biosoft国际),与5-CTCTCGTCGCTACCGTCGC-3 5-TCCCCCAGTTCACCCCATC-3 Bcl2, 5-GGAACGAACGGACCTGTGGA-3 5-CGGGTGCGGTAGAGTAAGCA-3半胱天冬酶3,5-CCGGCGAATTGGAGATGA-3和5-AGCGAGGCGGTGAGGACT-3伯灵顿(所有引物被Sangon生物技术合成,中国)。的每个RNA样本归一化的老鼠glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH),内部控制。

2.4。西方墨点法

Caspase-3、伯灵顿和bcl - 2从H9c2提取细胞和他们的表达分析。H9c2细胞裂解后,蛋白质浓度测定用BCA分析工具包(Beyotime,中国)。蛋白质样品(40μg)被加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转移到硝化纤维膜。非特异性结合位点被封锁1 h使用脱脂奶粉5%。这些墨迹探测了伯灵顿(英国1:5000稀释,Abcam), Caspase-3(1: 2000稀释,Abcam,英国),和bcl - 2(1: 1000稀释,Abcam,英国)抗体。Goat-anti-rabbit免疫球蛋白(美国微孔1:5000稀释)和山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国微孔1:5000稀释)被用作二次抗体。增强化学发光的膜被孵化3 - 5秒(ECL)检测试剂(美国微孔)。的β肌动蛋白抗体(美国Sigma-Aldrich 1: 1000稀释)被用来作为内部标准。蛋白质乐队使用ImageJ软件进行了分析,与被估计的相对浓度β肌动蛋白。

2.5。在活的有机体内化验

男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(160 - 200克)是购买从昆明医科大学(中国昆明)。本研究昆明医科大学伦理委员会批准,所有动物程序依法执行国家卫生研究所(NIH出版85号- 23,2011年修订)指导实验室动物保健和使用的。老鼠被随机分为三组:sham-operated集团(虚假的集团),MI组和左西孟旦后处理组(MI +左旋的组)。

老鼠与腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(30毫克/公斤),气管插管,在操作和通风。心脏通过左侧开胸和pericardiectomy被曝光。然后,使用6.0缝线缝合,左前降支冠状动脉的识别并轻轻包扎过。虚假的组大鼠受到相同的程序,除了结扎左冠状动脉前降支。成功证实了MI观察心肌颜色变化从红色到苍白。MI后,大鼠心肌梗死+静脉注射左旋的组充满了左西孟旦(1.2μ克/公斤10分钟紧随其后的是0.2 /分钟μ1 h g / kg /分钟),而虚假的和MI组大鼠注射等量的5%葡萄糖溶液。

2.6。超声心动图

经胸廓的超声心动图检测进行7-day-old麻醉大鼠使用通用电气生动E9系统配备10.0 MHZ的调查。左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、和部分缩短(FS)。

2.7。氯化四唑(TTC)染色

心肌梗死后,所有老鼠都牺牲了7天。心被迅速删除,为30分钟洗净,放在冰−20°C。左心室的心肌组织切成2毫米部分,然后放在24-well盘子。TTC添加到井,在37°C和部分孵化30分钟,冲洗紧随其后。在左心室梗死区域标志和量化使用Image-Pro + 6.0软件。梗塞面积的百分比(%)= (/年代_e)×100%,梗塞区(白色)和吗年代_e是整个横截面积在同一层。

2.8。终端Transferase-Mediated dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色

从左心室心肌组织样本收集和固定在中性缓冲福尔马林。然后,脱水,清除,石蜡包埋,切片到5μ细胞凋亡分析部分。心肌细胞凋亡检测使用TUNEL分析工具包(罗氏公司、德国)。凋亡细胞的细胞核染色棕色,而正常细胞的细胞核染色蓝。此外,凋亡细胞的形态特征,包括karyopyknosis、核分裂和核溶解,进行评估。10个随机选择的字段(200×放大)在每个部分检查。凋亡率(%)=(凋亡细胞的数量/细胞总数)One hundred.

2.9。RT-qPCR

心肌组织总RNA提取冷冻样品使用试剂盒试剂(美国表达载体),按照制造商的指示。其余的程序类似于用于RT-qPCR H9c2细胞。

2.10。西方墨点法

bcl - 2蛋白水平的Caspase-3,伯灵顿,评价血清总蛋白提取心肌组织样本。其余的程序类似于免疫印迹分析执行H9c2细胞。

2.11。免疫组织化学染色

石蜡包埋的部分脱蜡、水化后,抗原检索。内源酶的灭活,部分被孵化H为3%₂O₂在去离子水37°C 10分钟。然后,一夜之间他们在4°C的环境存在anti-Bax(1: 100稀释,Abcam,英国),anti-Caspase-3(1: 100稀释,Abcam,英国),和anti-Bcl-2(1: 100稀释,Abcam,英国)主要抗体。biotin-labeled二级抗体(ZsBio,中国)补充说,其次是孵化在37°C 40分钟。然后,部分是沾diaminobenzidine (DAB) 5分钟,与苏木精复染色5分钟,脱水,变透明,与中性密封胶。布朗检测胞质颗粒,部分是由光学显微镜观察(德国蔡司)连接到一个先进的310图像处理系统(Motic、加拿大),获得的图像。

2.12。统计分析

美国IBM SPSS 13.0统计软件()是用于所有统计分析。数据是平均数±标准差。成对的学生的差异进行评估t以及。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

左西孟旦后处理抑制H9c2细胞凋亡在A / R模型通过提升bcl - 2和抑制Caspase-3 Bax mRNA和蛋白表达水平。

流式细胞术进行调查每组细胞凋亡水平H9c2 / R细胞模型(数据1(一)和1(b)和表1)。A / R +左旋的组凋亡细胞表现出明显低,相比/ R组(A / R +左旋的12.14±0.94与A / R为21.41±0.51, )。建立凋亡因素参与左西孟旦后处理的影响/ R H9c2细胞模型,RT-qPCR(图1(c)和表2)和免疫印迹(数字1(d)和1(e)和表3)进行确定信使rna和蛋白质水平的Caspase-3,伯灵顿,bcl - 2。A / R组相比,A / R +左旋的群体表现出显著抑制Caspase-3 (A / R +左旋的1.17±0.09与A / R为2.06±0.13, )和伯灵顿(A / R +左旋的1.91±0.03与A / R为5.67±0.34, )表达式在mRNA水平,而bcl - 2 mRNA水平明显升高(0.76±0.004 A / R +左旋的与A / R为0.32±0.006, )(图1(c)和表2, )。此外,如图1(d)和1(e)、bcl - 2蛋白水平显著调节(A / R +左旋的0.76±0.06与A / R为0.63±0.03, ),虽然Caspase-3 (A / R +左旋的0.12±0.02与A / R为0.26±0.04, )和伯灵顿(A / R +左旋的0.40±0.06与A / R为0.81±0.06, )蛋白质含量明显下调的A / R +左旋的集团相比/ R组(数字1(d)和1(e)和表3, )。与对照组相比,在A / R +左旋的集团,bcl - 2蛋白水平抑制(A / R +左旋的0.98±0.12,0.76±0.06与控制 ),虽然Caspase-3 (A / R +左旋的0.13±0.04,0.12±0.02与控制 )和伯灵顿(A / R +左旋的0.34±0.04,0.40±0.06与控制 )蛋白质含量升高。然而,差异表达水平控制和A / R组之间没有显著(图1(e)和表3, )。

3.1。左西孟旦后处理心肌梗死模型改善心脏功能

超声心动图测量表明,心肌梗死后第七天,老鼠接受左西孟旦后处理表现出改善心脏功能,相比MI组。此外,他们表现出显著提高LVEF和FS(表4, )。显示的显著降低LVEF和FS LVEDd升高,心脏的功能MI组明显减少,而虚假的组(表4, )。

左西孟旦后处理减弱心肌损伤和心肌保护MI-induced由升降bcl - 2 mRNA和蛋白水平的心肌细胞凋亡而抑制那些Caspase-3和伯灵顿。三十的老鼠,MI是成功建立了21个老鼠(70%的成功率)。其余9老鼠死于麻醉过量,心脏破裂,或其他原因。

如图2(a), TTC染色显示减少的区域左心室梗死心肌梗死+左旋的心肌梗死组(图2(a))。心肌梗死+左旋的组梗塞区域的比例较低,相比MI组(MI +左旋的MI 20.58±1.14, 18.03±0.47和 ,图2(b)和表5)。TUNEL染色法进行评估心肌梗死后心肌细胞凋亡(数字2(一)和2(c))。与对照组相比,心肌梗死和心肌梗死+左旋的群体表现出更多TUNEL-positive细胞核(布朗)(图2(a))。有趣的是,MI后,心肌梗死+左旋的群体表现出较低比例的凋亡心肌细胞(棕色),相比MI组(MI +左旋的MI 0.21±0.02, 0.15±0.01和 ,图2(c)和表6)。RT-qPCR分析显示bcl - 2 mRNA水平升高(MI +左旋的MI 0.23±0.07, 0.50±0.08和 )以及显著抑制Caspase-3 (MI +左旋的MI 5.73±0.45, 2.84±0.63和 )和伯灵顿(MI +左旋的MI 15.67±0.08, 7.91±0.03和p< 0.05)的mRNA水平MI +左旋的集团相比MI组MI(图2(d)和表7)。免疫印迹分析心肌组织从每组显示,MI组相比,心肌梗死+左旋的组有显著抑制Caspase-3 (MI +左旋的MI 0.46±0.04, 0.28±0.02和 )和伯灵顿(MI +左旋的MI 1.13±0.16, 0.76±0.06和 )蛋白质含量以及bcl - 2蛋白水平升高(MI +左旋的MI 0.69±0.05, 0.87±0.08和 )(数据2(e)和2(f)和表8)。的免疫组织化学染色结果Caspase-3、伯灵顿和bcl - 2符合RT-qPCR和免疫印迹分析结果(图2(a))。

4所示。讨论

左西孟旦预处理可以防止心肌细胞凋亡(9- - - - - -13]。此外,它对可比凋亡影响的器官如肝、肺和肾脏(20.- - - - - -24]。尽管最近的研究报道,药理后处理是一个潜在的方法来防止心脏损伤(25,26),左西孟旦后处理的研究很少,而左西孟旦预处理。一般来说,左西孟旦用于适当的临床适应症的情况下,如明确的MI (5,7,8]。基于从基础研究和临床实践发现,假设关于左西孟旦对MI-induced后处理心肌细胞凋亡的影响提出了。然而,这个机制levosimendan-conferred心脏保护尚不清楚。在这项研究中,一个在体外/ R模型,这是一个合适的细胞缺氧模型,使用(27,28]。在A / R细胞模型中,左西孟旦后处理H9c2凋亡细胞的数量减少,与对照组相比。它提供更强大和更左西孟旦对再灌注损伤保护作用的直接证据在临床应用。

据报道,凋亡途径之一是严格监管由b细胞蛋白质lymphoma-2 (bcl - 2)家族,如bcl - 2,它能够延长细胞存活通过抑制细胞凋亡(29日]。另一方面,伯灵顿,bcl - 2家族的一个成员,促进细胞凋亡(30.]。Caspase-3,半胱氨酸蛋白酶家族的一员,是一个关键的凋亡中介和有能力导致细胞死亡,细胞溶解产物的存在(即可见一斑31日]。在A / R模型在这项研究中,左西孟旦后处理增强bcl - 2 mRNA和蛋白水平,同时抑制Caspase-3和伯灵顿。这些发现可能解释了为什么左西孟旦后处理减毒H9c2细胞凋亡。此外,左西孟旦后处理对H9c2 / R细胞产生保护作用。

基于结果在体外实验中,我们假设左西孟旦可以抑制心肌细胞凋亡在活的有机体内心肌梗死后心肌梗死大鼠模型中,控制治疗相比,左西孟旦后处理心肌梗死后心肌细胞凋亡的数量显著降低。值得注意的是,它调节bcl - 2 mRNA和蛋白水平的同时抑制Caspase-3和伯灵顿在心肌梗死大鼠模型中,与对照组相比。组织学检查左西孟旦后处理与降低左心室梗塞面积,而控制治疗。此外,它在第7天部分改善心肌梗死后心脏功能。因此,减少心肌细胞凋亡的数量和左西孟旦后处理后proapoptotic蛋白质水平的差别明显对这些有利因素在减少左心室梗死区和部分改善心脏功能。尽管这一发现表明,治疗效果观察在我们的研究不足以完全反向MI造成的损害,我们的研究结果表明左西孟旦后处理对心肌细胞凋亡的保护作用。换句话说,虽然有些MI-induced凋亡或坏死的心肌细胞不可逆的,我们的研究结果显示,左西孟旦后处理可以减弱心肌细胞凋亡,改善心脏功能。由于可行的心肌细胞的数量对心脏功能的改善至关重要,左西孟旦后处理,产生心血管效应通过抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡,改善病人的预后,从而替代策略干预或手术治疗。

5。结论

左西孟旦H9c2 / R细胞模型中抑制细胞凋亡。除此之外,体内,左西孟旦后处理心肌梗死大鼠模型赋予心脏保护通过抑制心肌细胞凋亡,改善心脏功能。

数据可用性

仿真实验数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

应谢和镇江兴co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

应谢和镇江兴了同样的工作。

确认

这部分工作是支持基金云南省先进医疗技术项目(没有。h - 2018028),云南省自然科学基金科学系(号。202102 fe001 aa310003-12和2018年- 276年),和卫生科技项目昆明(2018 - sw - 06号和2020-04-02-001)。