文摘
小分子核糖核酸(microrna)作为一种小而非编码RNA,已被卷入各种pathobiological过程监管的癌症,包括胰腺癌的进展和在其他人类癌症。先前的报道表明胰腺癌被报道为癌症相关死亡的主要原因之一,还有一些因素,包括致癌基因和环境参与肿瘤发生。在我们的研究中,我们发现微rna - 146 a (mir - 146 - a)显然是胰腺癌组织和细胞中表达下调。mir - 146 a的超表达明显减少细胞增殖和肿瘤发生体外,MTT比色作为分析、集落形成分析,EdU分析和细胞周期的实验。在这里,我们发现肿瘤抑制决定性别的地区Y-box 7 (SOX7) mir - 146 a的直接目标。mir - 146 a的超表达明显抑制SOX7表达,促进细胞增殖和肿瘤发生。可拆卸的mir - 146——增加SOX7表达式。抑郁症mir - 146 a和SOX7促进细胞增殖和肿瘤发生在体外,确认mir - 146抑制SOX7监管胰腺癌细胞增殖。总之,我们发现mir - 146细胞增殖的减少通过针对SOX7胰腺癌。在目前的研究中,我们演示了mir - 146的功能在胰腺癌和可能提供一个新的目标治疗胰腺癌。
1。介绍
胰腺癌(PC)被定义为在消化道恶性肿瘤,阴险的起始、迅速发展(1,2]。此外,它已成为一个重大的健康问题,因为它是最常诊断肿瘤之一在人类和人类癌症死亡的重要原因。在很长一段时间3]。2020年全球癌症统计报告,胰腺癌仍是一个重要的全球癌症和负责超过4.5%的2020年全球550万个肿瘤死亡,死亡率全球排名第七(4]。因此,由于缺乏有效的干预措施和患病率高,我们需要一个更好的理解的个人电脑发展的分子机制。
小分子核糖核酸(microrna)是小非编码rna负调控靶基因的表达通过绑定到目标的3′未翻译区(utr) mrna (5]。微rna扮演不同的角色在不同的癌症类型。给出证据证明microrna能影响生物行为如增殖、分化、凋亡[6]。先前的研究已经证明了mir - 146作为一个特定的抑制microrna在多种肿瘤行为压抑proliferation-associated癌症基因的表达或抑制肿瘤转移7,8]。然而,mir - 146 a是否影响胰腺癌发展尚未报道。实际上,dbDEMC数据库显示,mir - 146 a是胰腺癌明显下调。进一步探索mir - 146 a是否可以作为一个有前途的预后标志物和发现其功能在电脑,我们发现mir - 146 a是一个肿瘤抑制PC细胞系。mir - 146 a的超表达明显降低PC细胞系增殖能力。
Sox基因编码转录因子具有强大的同源性高机动组(HMG盒),这是一个家庭的转录因子,它能有high-mobility-group dna结合蛋白域(HMG盒),他们已报告在胚胎发生(扮演重要角色9]。至少有30袜成员表达了在许多不同的细胞和组织,在多个阶段发展。决定性别的地区Y-box 7 (Sox7),连同Sox17 Sox18,属于袜F组亚科(10]。Sox7编码一个转录因子的HMG盒,已经涉及到壁内胚层分化(11]。
一项研究表明,SOX7 mRNA的表达经常被许多人类癌症细胞系和肿瘤组织中表达下调(12]。袜家族的一些成员是WNT-b-catenin-TCF的负调控因子信号通路(13]。成员SOX7子群F SOX17和SOX18,调节造血和cardiogenesis最初报道。此外,伴随着越来越多的证据表明,特别是SOX7也被发现是一个肿瘤抑制的人类癌症(12]。例如,在差别的对这些从卵巢肿瘤,胃,肺14]。功能,研究证明,过度SOX7能抑制肝癌细胞生长,与G1 S期被捕。shRNA-mediated SOX7沉默在nontumorigenic乳腺细胞增殖增加,迁移和入侵15]。相反,异位SOX7表达抑制增殖、迁移和入侵乳腺癌细胞体外和体内肿瘤的生长16]。虽然它的精细解释作用是在多种人类癌症,可以由microrna在癌症细胞,是否可以由SOX7 mir - 146 -尚未在胰腺癌。
我们的研究证实,癌症细胞增殖调控积极通过SOX7 mir - 146 a胰腺癌细胞增殖。在目前的研究中,我们调查了mir - 146的作用——在PC和解决机制如何mir - 146 a调节SOX7在电脑。这项研究可能为诊断和治疗提供新的分子目标的电脑。
2。材料和方法
2.1。细胞系,细胞培养
人类胰腺癌细胞系BxPC3, SW1990 Panc-1 PCI-35, jf - 305和正常人类胰管上皮细胞HPC-Y5从美国购买类型文化收集(写明ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞系分别在孵化RPMI 1640和DMEM(美国纽约GIBCO,大岛)补充10%胎牛血清(美国UT Hyclone, Logan)的氛围中95%的空气和5%的二氧化碳在37°C。
2.2。病人和组织标本
共有52个人包括26个患者被诊断出患有胰腺癌(病理确诊为胰腺癌)和26控制在本研究从医院招募。的患者都没有收到任何放疗或化疗前抽样。这项研究是获得医院伦理委员会的批准,和书面知情同意了提前从所有参与者。
2.3。细胞转染
105Panc-1 PCI-35细胞分别播种在转染前6-well板块。mir - 146 a是购自基因制药(中国上海)mir - 146 a的超表达。采用miR-NC作为控制向量。慢病毒,这可能表示SOX7 (len-SOX7),结构化的表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。慢病毒空载体(len-NC)被作为控制向量。当细胞长大后大约70%的6-well盘子,Lipofectamine 3000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)是用于转染分析根据制造商的协议。转染过程持续了48 h。稳定细胞转染细胞培养基中选择含有0.4毫克/毫升Geneticin(嘌呤霉素;英杰公司)。一个月以后,puromycin-resistant mir - 146 a upregulation稳定细胞系(Panc-1和PCI-35)。 RNA interference of SOX7 and NC which were transfected into PCI-35 were designed and synthesized by Gene Pharma Biotech, Shanghai, China. Oligonucleotides used for SOX7 knockdown were as follows: ACGCCGAGCTGTCGGATGG.
2.4。蛋白质提取和免疫印迹
转染细胞细胞溶解与预冷Radio-Immunoprecipitation分析裂解缓冲补充了蛋白酶抑制剂(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)30分钟在冰上。离心后的上层清液收集在14000 rpm, 20分钟4°C。蛋白质浓度由bicinchoninic酸蛋白质浓度测定工具包(RTP7102、实时生物技术有限公司,北京,中国)。样品(20µg)受到10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜(微孔,贝德福德,MA)。沾上污渍的膜被封锁的3%牛血清白蛋白(BSA;北京Solebo生物技术有限公司、北京、中国)在室温下2 h,潜伏在4°C的一个主要抗体一夜之间,与TBST洗了三次,然后用二次抗体探测在室温下2小时。β肌动蛋白被用作加载控制。蛋白质的水平观察化学发光检测系统。主要的抗体anti-SOX7(1: 000、研发系统,美国)β肌动蛋白(WeiAo 1: 1000年,中国)。二次抗体是HRP-conjugated山羊anti-rabbit抗体(WeiAo 1: 3000年,中国)和山羊anti-rat抗体(WeiAo 1: 3000年,中国)。
2.5。RNA提取
从血清样本中提取总RNA进行使用试剂盒试剂(美国卡尔斯巴德英杰公司)的互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成装备(美国沃尔瑟姆热)随机启动根据制造商的协议。rt - pcr反应产物是量化。β肌动蛋白是内部控制。
2.6。中存在
分析mir - 146 a和β肌动蛋白表达,我们采用两步中存在特定的引物。使用棱镜7300序列执行实时RT - PCR检测系统(应用生物系统公司,CA),每一个反应(20 ul)包含10 ul PCR大师混合(Ambion TX)和2.5 ul RT产品,并分析了每个样本一式三份。PCR在95°C进行了10分钟,其次是40周期放大在95°C 15年代和60年代60°C。结果是两个独立的化验的代表。不同的细胞系使用比较Ct(2计算- - - - - -△△Ct)方法。qPCRs列在表中使用的引物1。
2.7。EdU化验
EdU成像探测设备(凯基生物生物技术,中国)已被用于EdU染色试验。总之,在48 h posttransfection prewarmed EdU染色方案的最终浓度10μM是添加到每个细胞单位和孵化为2 h 37°C。中被丢弃,这些细胞被固定为4%多聚甲醛(化学试剂国药控股有限公司,中国)在室温下15分钟。然后细胞包含3% BSA与PBS洗两次。0.5% Triton x - 100(上海商报生物技术有限公司、上海、中国)在PBS被添加到每个在室温下和孵化20分钟。这些细胞被洗两次包含3% BSA与PBS。点击它反应的解决方案是添加在室温下,在黑暗中孵化了30分钟。这些细胞被沾染了赫斯特33342染色溶液稀释1:2000 15分钟,拍摄下激光扫描共焦显微镜(LSM780NLO;蔡司)。
2.8。细胞增殖
简而言之,1000细胞增殖,细胞被播种在96孔板。每组的目的是与5复制井。执行转染细胞转染方法的使用技术。细胞生长在一个孵化器,收获在不同时间点(0小时、24小时、48 h, h, 72和96 h)。CCK-8 (Beyotime中国)10μL是添加到每个细胞,然后孵化1 h在37°C。每个在450 nm的OD值是由一个微型板块分光光度计测量(美国BIOTEK elx - 800)。
2.9。流式细胞术
PCL-35-control和pcl - 35 - mir - 146 - a -超表达细胞周期测定使用细胞周期检测设备(凯基生物生物技术,中国)。简而言之,转染的细胞聚集48 h后,与PBS洗两次,在310 g离心5分钟。预冻一夜之间增加了70%的乙醇和固定在4°C。与PBS固定细胞被洗两次,浮在表面的被丢弃。π/核糖核酸酶染色的解决方案(RnaseA:π= 1:9)和混合添加了在室温下在黑暗中30 - 60分钟。立刻,细胞进行了分析通过流式细胞分析仪(NovoCyte,究其生物科学,Inc .,美国)。
2.10。双荧光素酶报告实验
野生型和突变体SOX7 30翻译区(3′UTR)序列和结扎被聚合酶链反应扩增到pMIRREPORT荧光素酶向量(美国Ambion、奥斯汀、TX)收益率pMIR-SOX7 30-UTR (SOX7 30-UTR)。HEK293细胞被播种到six-well盘子和允许融合达到60 - 80%。野生型和突变体的细胞被cotransfected SOX7 30-UTR和miR-9mimic / miR-NC使用Lipofectamine 2000。24小时后,细胞是收获和细胞溶解。荧光素酶报告实验Dual-Luciferase记者试验系统上执行(WI Promega,麦迪逊,美国)根据制造商的指示。萤火虫荧光素酶活动规范化Renilla荧光素酶活性。
荧光素酶检测进行了如下所述。短暂,细胞与荧光素酶cotransfected记者构造,microrna并使用Lipofectamine RenillaTM2000(表达载体),萤火虫和Renilla荧光素酶活动测量48 h后Dual-Luciferase_Reporter试验系统使用光度计(Promega)。
野生型(wt) SOX7序列含有结合位点和mir - 146 a或突变类型(傻瓜)形成的序列,不包含它们。前序列被插入到pmirGLO向量(WI Promega,麦迪逊,美国)。mir - 146 - a -超表达或控制与向量cotransfected PCL-35细胞,和荧光素酶活动被发现使用Dual-Luciferase记者分析系统(WI Promega,麦迪逊,美国)。我们使用Renilla荧光素酶活性作为归一化控制。
2.11。统计分析
所有统计分析进行了使用GraphPad棱镜8 (GraphPad) Mac OS。实验重复3次,除非另有说明,代表结果显示。定量数据表示为±SEM。小动物——一张长有t以及用于识别显著差异比较,除非另有说明。统计分析,意义是在0.05的水平。
3所示。结果
3.1。mir - 146 a是胰腺癌表达下调
首先,我们发现mir - 146 a显然是在胰腺癌组织中表达下调与肿瘤邻近组织(图1(一))。图1 (b)表明,mir - 146在五个不同的胰腺癌细胞中表达,如BxPC3, SW1990, Panc-1, PCL-35,和jf - 305 l,与正常的人类胰管上皮细胞HPC-Y5存在化验。我们发现mir - 146 a是胰腺癌细胞RNA表达下调。此外,我们发现mir - 146 a的超表达电脑更好的预后效果几个月后操作造成临床结果(图1 (c)。
(一)
(b)
(c)
3.2。mir - 146抑制胰腺癌细胞的增殖
虽然我们知道了mir - 146在胰腺癌表达下调,确认mir - 146的功能——在胰腺癌细胞系,我们建立了稳定lentiviral-mediated过Panc-1 mir - 146 a和PCL-35细胞(数字2(一个)和2 (b))。我们发现mir - 146 a的超表达明显抑制,抑制胰腺癌细胞的增殖。最初,mir - 145对扩散的影响Panc-1 PCL-35细胞使用CCK-8试验(数据进行调查2 (c)和2 (d))。此外,数据2 (e)和2 (f)显示过度mir - 146 a Panc-1和PCL-35细胞的增殖抑制EdU化验。为了探索mir - 146 a的作用在细胞周期中,我们发现mir - 146 a的超表达逮捕了Panc-1 PCL-35细胞S期(图2 (g))。综上所述,mir - 146 a超表达抑制胰腺癌细胞体外增殖和肿瘤发生。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.3。SOX7 mir - 146的直接目标是在胰腺癌细胞
之前的研究已经证实,mir - 146 a的超表达抑制胰腺癌细胞增殖。为了探索机制,我们寻找的目标基因mir - 146 a。这是预言SOX7可能是一个潜在的直接mir - 146 a的分子生物信息学网络分析软件,TargetScan 7.2数据库(http://www.targetscan.org/vert_71/)(图3(一个))。然后我们合成wt或傻瓜SOX7荧光素酶向量根据之间的结合位点3′utr区域SOX7和mir - 146 a。荧光素酶记者化验表明,活动可以减少mir - 146 wt组而不是傻瓜组或miR-NC组(图3 (b))。此外,存在发现mir - 146 a mRNA水平可以显著减少了mir - 146 a(数字3 (c)和3 (d))。此外,免疫印迹分析表明,超表达mir - 146 a可以减少SOX7蛋白质水平(数字3 (e)和3 (f))。因此,这些数据表明,SOX7 mir - 146 a的目标,这是消极监管Panc-1 mir - 146 a和PCL-35细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。mir - 146 a抑制胰腺癌细胞增殖的表达下调SOX7
我们发现细胞增殖标记蛋白质Ki67表达明显减少和伯灵顿凋亡标记蛋白表达增加当mir - 146在PCL-35调节免疫印迹(图4(一))。此外,我们发现细胞Ki67蛋白表达显著降低,伯灵顿蛋白表达增加PCL-35 SOX7时调节免疫印迹(图4 (b))。为了确认mir - 146低迷的细胞增殖和肿瘤发生在体外通过抑制SOX7,我们在PCL-35细胞中过表达SOX7 mir - 146超表达。图4 (c)表明,mir - 146 a的超表达抑制Ki47蛋白质表达和抑制细胞增殖在PCL-35 SOX7超表达的增加。此外,mir - 146 a的影响可以逆转SOX7 upregulation(图4 (c))。综上所述,SOX7 mir - 146 a的目标基因在胰腺癌细胞。mir - 146抑制细胞增殖和肿瘤发生在体外通过抑制SOX7。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
的差别在目前的研究中,我们观察到对这些mir - 146——在人类胰腺癌细胞系测试(BxPC3, SW1990, Panc-1 PCI-35, jf - 305)与正常人相比胰管上皮细胞HPC-Y5,以及胰腺肿瘤组织的临床结果。我们还发现,过度mir - 146 a的胰腺癌细胞抑郁胰腺癌细胞增殖和逮捕了Panc-1 PCL-35在S期细胞流式细胞术分析。因此,我们得出结论,mir - 146 a的超表达降低胰腺癌细胞增殖和可能是一个潜在的治疗目标在胰腺癌。
以前,研究表明,mir - 146 a发挥了重要作用的抑癌表达下调多个癌基因的表达水平在肿瘤17]。感应mir - 146 a的多发性骨髓瘤细胞间充质基质细胞刺激protumoral活动。此外,据报道,mir - 146基因表达下调NF -κB,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,因此可能作为有效的肿瘤抑制(18]。mir - 146 - 5 - p / TRAF6 NF-kB p65轴调节胰腺癌药物抗性(19]。Upregulation mir - 146 -有助于抑制胰腺癌细胞的入侵。我们的研究发现mir - 146抑制胰腺癌进展。
完善,SOX7影响多种癌症恶化。在最近的一项研究中,郭等人证明了SOX7基因表达下调在胰腺腺癌的47%,由启动子甲基化和肿瘤特异性失活SOX7被发现在48%的原发性胰腺肿瘤检测(20.]。这些作者还建议SOX7 b-catenin函数作为一个独立的检查点在胰腺和结肠上皮细胞(21,22]。此外,许多研究表明,SOX7可以监管影响癌症恶化或凋亡的microrna [23]。击倒mir - 935增加紫杉醇敏感性通过调节SOX7在非小细胞肺癌。mir - 935由针对SOX7促进胃癌细胞增殖和mir - 935促进肝癌细胞增殖和迁移的目标SOX7 [24,25]。
在目前的研究中,一个重要的分子mir - 146 a和SOX7之间的联系了。首先,生物信息学分析表明SOX7可能的潜在目标之一mir - 146 a。随后,它被发现mir - 146 - PC组织明显下调,这与以前的研究一致。更重要的是,一个重要的负相关观察mir - 146 - a和SOX7表达式在PC组织,和SOX7的表达减少PCL-35伴随着细胞抑制细胞增殖overexpressing mir - 146 a时,表明mir - 146 a可能参与调节SOX7在电脑。这个假设被荧光素酶活性测定,进一步支持的数据表明,mir - 146 a能够直接目标3′UTR SOX7和结合位点与TargetScan预测的种子区域是相一致的。这些数据表明,mir - 146 a可以抑制细胞增殖的电脑针对SOX7。
总之,我们在本研究建立mir - 146的作用——在PC和SOX7目标基因。我们还澄清了机制,mir - 146 -目标SOX7胰腺癌。mir - 146 a可以诱导胰腺癌细胞凋亡和抑制细胞增殖,这可能是通过抑制SOX7表达式。这份报告中给出的数据代表试图披露mir - 146 a的作用在抑制胰腺癌,这可能是有用的在新的胰腺癌治疗策略的发展。
数据可用性
数据用于支持本研究的发现可以以合理的要求相应的作者。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。