文摘

糖尿病肾病(DKD)是最常见的一种并发症糖尿病(DM),没有合适的治疗,最终导致终末期肾脏疾病(esrd)。此外,有越来越多的证据证明长非编码rna (lncRNAs) DKD的发展也起到关键作用。我们的RNA序列数据显示一大群差异表达lncRNAs DKD肾组织,其中lncRNA ENSG00000254693 (lncRNA 254693)大幅改变。在这项研究中,我们发现,254693年lncRNA的表达增加DKD病人和high-glucose-induced人类足细胞。5/ 3种族和北部污点分析被用来找到的全部长度lncRNA ENSG00000254693 558核苷酸和nonisoform存在于人类的足突细胞。Downregulation lncRNA 254693显著逆转的炎症、细胞凋亡,足细胞损伤引起的高葡萄糖。然后,我们通过RBPDB做了生物信息学分析,发现lncRNA 254693可以结合,户珥RNA结合蛋白。同时,免疫荧光法和原位杂交双染色法被用来证明colocalization的存在。有趣的是,户珥lncRNA 254693户珥水平下降的击倒,而击倒也减少了lncRNA 254693及其稳定的水平。之后,RNA免疫沉淀反应分析结果再次证实了它们之间的绑定关联。此外,我们发现,户珥在高glucose-induced足细胞增加,户珥的沉默可以减轻足细胞损伤,炎症和细胞凋亡。这些结果共同表明小说之间的反馈调节lncRNA 254693户珥可能涉及在足细胞损伤,可能作为预测目标DKD疗法。

1。介绍

近几十年来,糖尿病患者的数量急剧增加,2019年估计有4.63亿人患有糖尿病,到2030年将上升到5.78亿(2019年国际糖尿病联合会)。DKD患者的发病率和数量也显著增加,这发生在20 - 40%的糖尿病患者,威胁人类健康和社会发展严重[1]。与此同时,越来越多的证据表明,长非编码rna (lncRNAs)参与的开发和发展一些疾病,如心血管疾病、前列腺癌,脂肪肝,DM, DKD [2- - - - - -5]。lncRNAs被定义为非编码记录超过200个核苷酸长度没有蛋白质编码能力,调节靶基因的表达(6]。最近,一些研究表明,不同lncRNAs调节DKD通过刺激肾脏炎症的发展(7),加速肾间质纤维化(8),促进增殖,epithelial-mesenchymal过渡(9),等等。然而,lncRNA 254693病理过程中所扮演的角色DKD在很大程度上仍是个未知数。

最近的研究发现,lncRNAs调解DKD与蛋白质和蛋白质的丰度是由lncRNAs调制(10,11]。生物信息学分析发现lncRNA 254693可以用人工抗原结合R(虚)。户珥,胚胎致命的一员视力异常(ELAV) rna结合蛋白家族12),被发现参与许多疾病,如肝癌和结直肠癌,通过调节信使rna剪接,交通、和稳定13,14]。据报道,户珥可以接触各种各样的RNA,包括编码和非编码RNA转录(15]。户珥可以稳定lnc-Sox5调节舌癌的致癌作用16]。鉴于我们推测lncRNA 254693年可能与户珥调节足细胞损伤和DKD交互,因此,需要全面的调查。

足细胞终末分化上皮细胞,肾小球的表面和发挥重要作用在维持肾小球滤过屏障的通透性,实现选择性过滤(17,18]。足细胞损伤是早期一步DKD进展,这可以通过podocyte-related蛋白质的表达水平来估计肌间线蛋白和ZO-1等。此外,不同的研究概述,足细胞损伤和炎症和细胞凋亡是两个特征DKD的发病机制中扮演关键的角色。因此,该研究的潜在机制lncRNA 254693足细胞损伤,炎症和凋亡将有助于找到新的治疗目标DKD的治疗和预防。

在这项研究中,我们调查的表达254693年lncRNA DKD病人样本和人工培养的足细胞表达和功能。与此同时,254693年lncRNA预测结合户珥。因此,我们继续调查lncRNA 254693户珥,之间的相互作用及其潜在功能DKD治疗DKD发展可能提供一个新奇的想法。

2。材料和方法

2.1。病人和样品

人类血清样本从DKD收集病人的肾脏学山东省级医院,和正常对照组的血清样本从体检中心。从每个病人知情同意了。这项研究是临床研究伦理委员会的支持下山东省医院。

2.2。细胞培养

人类永生的足细胞培养在RPMI 1640中(美国Gibco)补充10%胎牛血清(美国Gibco)和1% penicillin-streptomycin宽容的条件下33°C公司为5%₂在湿润的气氛中在扩散阶段和未来培养37°C公司为5%₂孵化器7 - 14天诱导分化。然后,手持电脑可用于相关实验。根据不同的条件,手持电脑是培养中含有低葡萄糖(葡萄糖LG集团5.5毫米),高葡萄糖(HG, 30毫米葡萄糖),和hyperosmolality (HO葡萄糖+ 24.5毫米5.5毫米甘露醇)。

2.3。细胞转染

足细胞的转染了( 细胞/在6-well板)表示siRNAs使用Lipofectamine3000试剂(美国表达载体)8 - 12 h。手持电脑治疗后与HG 24-36 h,目标核或小干扰rna转染成数控。不需要的细胞转染核与LG的控制治疗。lncRNA ENSG00000254693核(5 - - - - - -GGCAGAAGCUUCACUUUAU-3 ),小干扰rna(5户珥 - - - - - -GCUCAGAGGUGAUCAAAGATT-3 ),小干扰rna(负控制)和数控从Genomeditech购买。

2.4。荧光原位杂交(FISH)

日博™lncRNA鱼探针组合(红色)(中国RiboBio)是利用标准协议。封面的眼镜被放置,足细胞接种到6-well板在不同条件下,直到细胞密度达到了大约70%。足细胞固定在4%多聚甲醛10分钟,其次是0.5% Triton x - 100为5分钟,然后用prehybridization缓冲区阻塞为30分钟37°C。丢弃prehybridization缓冲,缓冲加入了含有探针杂交,然后孵化一夜之间在37°C。洗后SSC缓冲区,足细胞添加DAPI染色细胞核。图片是荧光显微镜下观察和捕捉(德国徕卡)。

2.5。实时定量PCR(存在)的分析

足细胞在不同条件下的总rna提取使用试剂盒试剂(表达载体、钙、美国)。总rna提取患者的血液样本使用个人小传cfRNA容易工具包(BIOG,中国)。NanoDrop 2000分光光度计(热费希尔科学、美国)是用于检测提取的总RNA浓度和纯度。然后,1000 ng从每个样本反向转录成RNA互补DNA(互补)使用PrimeScript®RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类,中国)。目标基因的引物设计和合成了Biosune(上海,中国),和它们的序列表中列出1。PCR扩增进行使用SYBR®预混料Taq交货(豆类,中国)根据LightCycler®480实时PCR系统(美国罗氏公司)。β肌动蛋白作为内部参考基因和靶基因的相对数量的计算方法。

2.6。免疫印迹分析

从足细胞总蛋白提取里帕裂解缓冲(Beyotime,中国)含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Solarbio,中国)。平等蛋白质是由sds - page分离和转移到PVDF膜(美国微孔)。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下1 - 2 h和孵化一夜之间在4°C以下主要抗体anti-desmin(1: 5000年,16520 - 1 - ap, Proteintech,中国),anti-ZO-1 (pa5 1: 1000年- 85256年,英杰公司,美国),anti-IL-6 (1: 1000、66146 - 1 - ig Proteintech,中国),anti-TNF -α(1:1000、60291 - 1 - ig Proteintech,中国),anti-cleaved-caspase-3(1: 1000年,19677 - 1 - ap, Proteintech,中国),和anti-HuR(1: 100年,11910 - 1 - ap, Proteintech,中国)。洗后与TBST三次每次5分钟,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 5000年,SA00001-2 Proteintech,中国)和辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mice免疫球蛋白g(1: 5000年,SA00001-1 Proteintech,中国)在室温下1 h,分别。蛋白质被曝光与ECL试剂(美国微孔)和Amersham成像仪680(美国通用电气)和分析ImageJ软件。β肌动蛋白(1:5000、66009 - 1 - ig Proteintech,中国)作为一个内部参考。

2.7。免疫荧光分析(如果有)

足细胞在6-well镀板在不同条件下,然后用4%多聚甲醛固定。普及率0.1% Triton x - 100后,细胞被封锁在室温下5% BSA 30分钟。接下来,细胞在4°C隔夜孵化主要抗体:anti-desmin(1: 200年,16520 - 1 - ap, Proteintech,中国),anti-ZO-1 (pa5 - 85256 1: 200年,英杰公司,美国),和anti-HuR(1: 100年,11910 - 1 - ap, Proteintech,中国)。然后,细胞被孵化的荧光二次抗体:山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石®488)(美国Abcam 1: 200年,ab150077)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石®594)(美国Abcam 1: 200年,ab150080) 1 - 2 h在37°C远离光线。用DAPI孵化后10分钟,荧光显微镜下观察和捕捉图像(德国徕卡)。

2.8。Transwell迁移分析

600年μL RPMI 1640中含有10%的边后卫低添加到商会Transwell(美国康宁公司); 细胞/毫升HPC在200年μ无血清培养系统L RPMI 1640中被添加到参议院。细胞被孵化下37°C公司为5%₂48 h,然后用4%多聚甲醛固定15分钟,渗透Triton x - 100 5分钟,0.1%和noninvading细胞被移除。接下来,入侵细胞与苏木精染色,使用分级乙醇脱水。最后,细胞光显微镜下观察和捕捉(德国徕卡)。

2.9。RNA免疫沉淀反应(RIP)

RNA免疫沉淀反应分析是由麦格纳把RNA结合蛋白免疫沉淀反应工具包(美国微孔)根据制造商的指示。总之,细胞被收集在RIP裂解缓冲和离心机。少量的上层清液保存为积极的控制输入,和残余上层的孵化anti-HuR抗体和兔免疫球蛋白在一夜之间在4°C。相关的RNA分离沉淀,然后纯化。输入RNA和免疫沉淀反应RNA检测到使用特定的引物lncRNA 254693中存在。

2.10。统计分析

所有的实验进行至少三次。GraphPad棱镜8和SPSS 19.0分析实验数据并绘制统计图表。值被显示为 。两组之间的统计学意义由正反和未配对 - - - - - -测试和意义在多个团体由单向方差分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。254693年lncRNA调节DKD病人样本

据报道,表情的变化lncRNA DKD的发展相关联。因此,我们使用RNA序列和数据分析来筛选差异表达lncRNAs DKD肾组织,以paracarcinoma肾组织为控制。我们选择lncRNA 254693在DKD调节本研究的目标。来验证这个结果,我们研究了lncRNA 254693年肾组织的表达水平和血清DKD鱼和存在,分别。结果表明,254693年lncRNA的表达显著增加在DKD伴随着podocin缺失的情况下,一个podocyte-specific蛋白质(图1(一))。与此同时,我们发现254693年lncRNA DKD精华素的表达水平高于正常控制血清(图1 (b))。

3.2。沉默lncRNA 254693足细胞的抑制炎症和凋亡

足细胞是至关重要的功能细胞DKD,不能再生的发展;因此,我们在本研究专注于足细胞。最初,254693年lncRNA足细胞的分布被鱼检测,表明lncRNA 254693年位于细胞核和细胞质中,但主要在细胞核(图2(一个))。执行中存在确定254693年lncRNA表达式,结果表明,治疗后血糖高48 h, lncRNA 254693的表达显著增加而低葡萄糖(图2 (b))。然后,我们lncRNA 254693年5/ 3快速放大cDNA结束(5/ 3 - - - - - -足细胞实验竞赛)。比对结果表明,全长lncRNA 254693 588个核苷酸(图2 (c))。和北部污点实验证明没有存在亚型lncRNA 254693年的足细胞(图2 (d))。

炎症和细胞凋亡是两个关键事件对足细胞损伤。随后,免疫印迹结果表明high-glucose治疗显著促进了促炎细胞因子il - 6和TNF的表达水平α和apoptosis-related蛋白质裂解caspase-3(图2 (f))。随后,探讨254693年lncRNA高glucose-induced足细胞的功能,我们转染lncRNA 254693核足细胞和可拆卸的效率与统计差异(图所示2 (e))。lncRNA 254693击倒降低il - 6的水平,TNF -α,裂解caspase-3(图2 (f))。一致,存在结果证实il - 6和TNF -的交替变化α再次表达(图2 (g))。因此,这些数据都表明,lncRNA 254693积极调节炎症和细胞凋亡在足细胞。

3.3。254693年lncRNA沉默抑制足细胞损伤

大量的研究表明,足细胞损伤是早期DKD发展的一步。基于上述发现,我们因此研究肌间线蛋白的表达和ZO-1,两个著名podocyte-typical标记。首先,免疫印迹试验和免疫荧光试验表明,肌间线蛋白的蛋白质含量增加,ZO-1减少,而lncRNA 254693沉默显著抑制肌间线蛋白的表达和ZO-1(数字的表达增加3(一个)和3 (b))。与此同时,也存在了,肌间线蛋白mRNA表达的减少,ZO-1增加了可拆卸的lncRNA 254693(图3 (c))。此外,我们发现足细胞的迁移能力和观察到击倒lncRNA 254693反足细胞的迁移能力,显著增强的高葡萄糖(图3 (d))。这些结论lncRNA 254693沉默抑制足细胞损伤引起的高葡萄糖。

3.4。lncRNA 254693年可能绑定与户珥和调节户珥的核质穿梭

一般来说,通过绑定到目标基因lncRNAs工作;因此,我们做了生物信息学分析找出lncRNA 254693 -结合蛋白有关。我们发现lncRNA 254693可以通过RBPDB结合户珥。首先,户珥的表达在HG-induced足细胞升高,明显,击倒lncRNA 254693压抑(户珥的蛋白质和mRNA表达数据4(一)和4 (b))。然后,根据免疫荧光原位杂交双重染色,我们观察到lncRNA814.1能够colocalize与户珥和HG推广户珥航天飞机从细胞核到细胞质中,但254693年lncRNA击倒抑制这一过程(图4 (c))。随后,进一步证明有一个互动lncRNA 254693户珥,我们撞倒了户珥在足细胞通过使转染核(数字4 (d)和4 (e))。有趣的是,结果表明,表达下调户珥lncRNA 254693(图的表达下降4 (f))。然后,足细胞转染与户珥siRNA对待放线菌素D阻止RNA合成。我们发现的半衰期lncRNA 254693户珥击倒细胞(t1/2 1.5 h)低于负控制细胞(t1/2 3 h)(图4 (g))。此外,足细胞RNA进行免疫沉淀反应测定使用户珥抗体来验证户珥和lncRNA 254693之间的交互。lncRNA 254693被发现优先富集户珥抗体捕获的沉淀与免疫球蛋白控制相比,这是更明显的high-glucose条件(图4 (h))。

3.5。Downregulation户珥的抑制汞引起的足细胞的损伤

我们进一步检查的影响户珥在足细胞损伤引起的高葡萄糖和发现的蛋白质水平ZO-1增强肌间线蛋白的水平,il - 6,裂解caspase3减少户珥击倒后high-glucose条件(图5(一个))。一致,免疫荧光染色显示交替的肌间线蛋白和ZO-1expression足细胞(图5 (b))。此外,户珥的沉默可以减少足突细胞迁移的能力比HG组(图5 (c))。因此,我们有理由相信254693年lncRNA可以调节通过积极的反馈与户珥足细胞损伤。

4所示。讨论

最近的证据表明,lncRNAs许多生物过程是必不可少的,如染色质修饰、转录调节、RNA的转录后的调控,细胞增殖,分化和细胞凋亡19,20.];这被认为是一个至关重要的监管机构通过绑定到相应的基因mrna和DKD病理生理学中起着重要的作用。考虑到只有少数lncRNAs DKD的研究,我们使用RNA序列,一种广泛使用的方法进行转录组分析,筛选差异表达lncRNAs DKD转录组的肾组织。越来越多的证据证实RNA序列可以调查lncRNAs的功能和生物学模式,寻找候选目标,和生物标志物的研究(21,22]。随后,我们选择lncRNA 254693显著高表达在DKD的生物学功能和分子机制研究的目标和254693年lncRNA DKD仍然未知。在我们的研究中,我们发现,与常规控制相比,254693年lncRNA表达式在DKD显著增加,无论如果病人的组织或血清,表明lncRNA 254693参与DKD的进展。亚细胞分布分析表明,254693年lncRNA位于细胞核和细胞质中,这意味着潜在的广泛的功能在不同的生物过程。

足细胞是一个关键组成部分的肾小球滤过屏障DKD[的发病机制中扮演着重要的角色23]。连续high-glucose刺激导致脚抹杀和炎症过程,导致细胞分离,这是一个终端事件在足细胞损伤,进一步加速肾小球损伤和DKD[的发展24,25]。现有的证据表明,炎症和细胞凋亡是关键特征,与足细胞的分离和加重他们的伤害26]。在这项研究中,我们发现,促炎细胞因子il - 6和TNF -α和apoptosis-related蛋白质裂解caspase-3调节引起的高葡萄糖。同样,Hameed等人发现,il - 1β、il - 6和TNF -α表达式中增加DKD [27]。此外,据报道,肾小球滤过屏障功能的丧失DKD有关podocyte-specific蛋白质的表达水平的变化如podocin、肌间线蛋白,ZO-1 [28]。足突细胞损伤的一个标志,肌间线蛋白是一个中间丝蛋白在细胞骨架蛋白,这是表示在肾小球足细胞是受伤的29日]。紧密连接蛋白,ZO-1是负相关与足细胞损伤。一致,我们的结果表明,较低的血糖控制,肌间线蛋白水平的提高和水平ZO-1 high-glucose-treated足细胞减少。

有趣的是,254693年lncRNA击倒了il - 6、TNF -α,裂解caspase-3、肌间线蛋白和ZO-1表达变化和减少high-glucose-treated足细胞的迁移能力。以上表明,抑制lncRNA 254693年high-glucose-induced炎症有保护作用,细胞凋亡,足细胞损伤和针对lncRNA 254693年DKD可能会造成一系列的影响,这可能是一本小说DKD治疗的目标。

研究发现,lncRNAs可以与蛋白质和规范的表达,尤其是证据表明lncRNA-RBP交互相关的蛋白质相互作用调控基因表达(30.,31日]。据报告,lncRNA ASB16-AS1与rna结合蛋白户珥和监管转译后的[户珥的表达式15]。lncRNA Airn足细胞免受DKD条件通过与Igf2bp2交互、rna结合蛋白,促进Igf2和Lamb2翻译(32]。在我们的研究中,生物信息学分析结果显示,户珥lncRNA 254693可以结合可以绑定记录在mrna AU-rich元素和稳定目标。有趣的是,我们发现,户珥水平下调254693年lncRNA抑制时,和254693年lncRNA表达下调的表达和稳定当户珥被抑制。此外,RNA免疫沉淀反应试验再次验证lncRNA 254693户珥之间的关系。从我们的结果来看,我们认为lncRNA 254693户珥可以相互作用,形成一个反馈回路。

一般来说,户珥主要是局部细胞核及其函数往往与它的细胞易位从细胞核,细胞质中33]。因此,户珥的易位从细胞核到细胞质中,我们观察到在这项研究通过免疫荧光原位杂交双重染色,是保护目标信使rna降解的关键步骤(34]。铃木等人发现,户珥可以调节炎症的mRNA稳定因素(il - 6、TNF -α)和apoptosis-related基因(35- - - - - -37]。同样,我们发现,il - 6和裂解caspased-3表达水平下调表达户珥的减少和穿梭击倒后户珥。同时,户珥被报道调节DKD进展(12]。在我们的研究中,我们发现,肌间线蛋白的表达水平降低,ZO-1户珥击倒时增加。因此,我们推测,户珥对DKD发展很重要,和可拆卸的户珥可以减少high-glucose刺激造成的损害。考虑lncRNA 254693户珥的角色一起将DKD研究的新方向。

5。结论

我们的研究提供了证据证明lncRNA 254693参与的发展DKD和充当足细胞损伤的主要监管机构通过与户珥交互。之间有一个积极的反馈回路lncRNA814.1户珥;因此,抑制lncRNA 254693户珥可以减轻炎症、细胞凋亡,足细胞损伤引起的高葡萄糖。这些发现提供了新的见解和治疗目标DKD的预防和治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

群Yu和林建工贡献了同样的工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(格兰特:82070744,82070744,81770723),山东第一医科大学学术推广计划(2019号ql022),和山东的泰山学者计划(Nos. ts201712090, tsqn201812138)。