文摘

背景。本研究旨在探索的关键基因和由肥胖引起的心脏损伤的可能机制。方法。我们分析了GSE98226数据集。首先,差异表达基因(度)被确定在肥胖和正常小鼠的心脏组织。然后,我们分析了度使用基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析。第三,我们构建了一个蛋白质交互(PPI)网络和关键模块和搜索中心的基因。最后,我们通过组织病理学观察病理变化与肥胖有关。结果。763度被发现,其中包括629调节和134个基因表达下调。富集分析表明,这些度主要是相关转录的规定,dna模板、核酸绑定,和金属离子结合。KEGG路径分析显示,富集度在长期抑郁,缝隙连接和鞘脂类信号通路。DKC1中,最后,我们发现UTP14A DDX10, PinX1, ESF1中心基因。组织病理分析表明,肥胖增加胶原纤维的数量和减少的数量增加微血管内皮细胞的增殖和血管内皮细胞损伤,进一步导致心脏微循环障碍。结论。UTP14A DKC1中,DDX10、PinX1 ESF1已经被确认为中心基因obesity-induced病变的心脏和心脏损伤可能参与obesity-induced影响心脏microcirculatory函数。

1。介绍

肥胖是体内脂肪的代谢病与过度积累。它是一个独立的心血管疾病危险因素,代谢性疾病,和2型糖尿病1]。随着生活质量的提高,肥胖的人的数量在增加,尤其是在发达国家2]。BMI常被用来衡量肥胖,这是由世界卫生组织定义为拥有一个 (3]。肥胖被认为是心血管疾病的一个独立危险因素的增加发病率和死亡率(4,5]。肥胖是异常脂质积累的本质和体内炎性因子的增加,这将不可避免地增加工作量和损害心脏和肺的功能。此外,炎症因素影响心脏的代谢,损害心脏功能(6]。对于一些肥胖病人、睡眠呼吸暂停综合症、高血压,血糖是心脏损伤的危险因素(7]。

obesity-induced心脏功能障碍的机制尚未完全阐明,(8]。先前的研究显示,肥胖导致心脏心肌细胞的能量代谢改变,特别是脂肪酸代谢(9,10),和分析表明,酰coa合成酶长链家庭成员1 (ACSL-1)成员和葡萄糖转运蛋白4 (GLUT-4)可能是负责心脏损伤的关键蛋白质(11]。其他的研究发现,肥胖会导致体内慢性炎症状态和干扰各种代谢过程(12]。在这种背景下,代谢紊乱将不可避免地导致心脏的异常代谢,以及心脏微循环障碍中扮演着很重要的角色在心血管疾病的发生和发展13,14]。然而,目前,诊断和治疗心脏微循环的不成熟。

氧化应激在肥胖及其并发症中发挥着重要作用,可以影响血管生成,所以氧化应激,肥胖,血管生成密切相关。血管生成被认为是最重要的变化在肥胖的发病前的过程15]。血管生成是一个多步过程参与受损组织的愈合,器官修复和胎儿发育在生理条件下,而在病理情况下,它可以促进多种癌症和多种血管并发症的发展(16,17]。对于心血管系统,显著增加了肥胖主要从事微循环障碍的急性心肌梗塞和可能性。微循环功能障碍是肥胖患者的心脏损伤的病理变化,失衡的血管生成调节机制中起着重要作用。

在这项研究中,我们进一步揭示GSE98226 obesity-induced心脏损伤的生物标志物分析基因表达分析和免疫组织化学分析肥胖老鼠的心脏组织。关键基因和通路的识别有助于更好地了解疾病的病理生理机制的发展,并提供新思想为肥胖病人的心血管保护。

2。材料和方法

2.1。微阵列数据

基因表达数据用于这项研究(GSE98226)从NCBI下载基因表达综合(地理;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。数据是基于GPL21163平台(安捷伦- 074809 SurePrint 3 g鼠标GE 28 v x60k微阵列),和它来自心脏组织的三个老鼠正常饮食和三个小鼠高脂饮食。

2.2。筛选差异表达基因

GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在线工具在GEO数据库应用筛选差异表达基因(度)在正常和hyperlipidemic老鼠心脏组织。度的确定标准进行调整 值< 0.01和 。Benjamini和业务(错误发现率)方法用于计算调整 价值。研究基因探针不对应名称删除,取而代之的是平均为多个探测器的一个基因的名字。初步处理后,我们输入度数据到Excel进行进一步分析。

2.3。去KEGG通路富集度的分析

研究一个在线数据库申请注释,可视化和综合发现(大卫)(https://david.ncifcrf.gov)基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析。数据整理,结果可视化使用在线工具生物信息学(http://www.bioinformatics.com.cn/)。

2.4。PPI网络建设

我们建造了一个PPI网络的度通过字符串(http://www.string-db.org),一个在线数据库,以确定蛋白质的相互作用。交互得分等于或大于0.7的定义是有蛋白质之间的相互作用,而其余选项设置为默认值。

2.5。模块分析和基因选择的中心

PPI交互地图导入Cytoscape软件,和MCODE插件用于提取和可视化网络中主要的模块。我们筛选关键基因网络中通过三个算法(最大社区组件(跨国公司),最大密度附近组件(DMNC)和最大小团体中心(MCC))的插件CytoHubba。

2.6。老鼠和组

具体无菌雄性C57BL / 6小鼠从河北Yiweiwo生物技术有限公司购买六C57小鼠随机分为正常食物的饮食(非传染性疾病, )和高脂肪饮食(HFD )适应性喂养后1周。接下来24周的老鼠根据他们的团体,他们的体重是每周监测。我们评估肥胖建模的结果通过比较高脂肪组小鼠的体重与对照组。建模可以被认为是成功的,如果体重小鼠高脂组是20%或高于对照组。所有的老鼠在一个舒适的和无菌环境和具体条件如下:湿度45% - -65%,温度20 - 24°C,时间晚上比第一天:1,足够的食物和水供应,和床上用品改变每周两次。批准了这个实验动物伦理协会的河北综合医院。

2.7。组织样本的准备

完全麻醉和老鼠放在完成采血的冰箱。胸腔被打开了,心脏组织解剖。血管被切断来自心底,和心脏是收获,与生理盐水冲洗。多余的血液挤出滤纸和表面抽液,然后,心脏组织在4%多聚甲醛固定,供以后使用。

2.8。他和马森染色

心脏组织浸泡在多聚甲醛和嵌入在石蜡切片。片被安置在苏木精解5分钟,由1%的酒精5秒钟,添加0.5%伊红30秒,在自来水冲洗。然后,以95%的酒精和100%的酒精脱水,分别为5分钟;然后,浸泡在二甲苯和中性树胶封平板电脑。

在马森染色,常规石蜡包埋和部分进行治疗。部分被放置在苏木精为5分钟,马森复合染色解决方案5分钟,5分钟,磷钼酸1% 2%亮绿色染色溶液5分钟,1%的磷钼酸5分钟。进一步治疗包括酒精脱水,二甲苯治疗,和中性密封胶,我们使用显微镜观察到的部分。

2.9。免疫荧光分析

研究了心脏组织利用CD34免疫化学测定心脏血管的密度。常规治疗后心脏组织被切割和孵化第一和二次抗体。血管密度计算后在显微镜下观察。

为了确定肥胖老鼠的心血管功能的变化,研究测量了vWF心脏组织的因素。vWF的表达是由显微镜观察心脏组织切片和孵化后的第一和第二抗体,分别。

研究发现心脏内皮细胞的增殖的双重免疫荧光染色和CD31和ki - 67双染色法应用于检测心脏内皮细胞的增殖。所有操作进行严格按照制造商的说明和图片使用Image-Pro + 6.0软件进行评估。

2.10。统计分析

所有数据了 。数据分析使用GraphPad软件,和独立样本 - - - - - -测试执行。 意味着结果具有统计学意义, 意味着结果非常显著。

3所示。结果

3.1。的识别度

763度被确定在高脂小鼠的心脏组织,其中包括629调节基因和134个表达下调基因。图1和补充文件1显示所有的火山块度的热图前50度。

(一)
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(b)
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(c)
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图1
度的筛查和可视化。(一)实验工作流程。非传染性疾病的心和HFD老鼠收获度分析和病理检查( )。(b)火山块度。度的筛选标准 和 。(c)度的热图。前50名度非传染性疾病和HFD之间。红色:更大的表达式;蓝色:更少的表达式;度:差异表达基因;非传染性疾病:正常饮食;HFD:高脂肪饮食;:基因本体;KEGG:京都基因和基因组的百科全书;PPI:蛋白质相互作用。
3.2。去富集分析

本研究进行的浓缩度分析的基础上,大卫数据库和筛选浓缩与调整 值< 0.05。如图2和补充文件2,结果包含60浓缩。生物过程(BP)主要富集在转录调控,dna模板,mRNA加工、和RNA拼接;蜂窝组件(CC)是主要富集在细胞内,细胞核和中心体;分子功能(MF)主要是富含核酸绑定,金属离子结合,保利(A) RNA绑定。

(一)
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(b)
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图2
去条款和KEGG通路富集分析。的 - - - - - -轴代表每个功能性组基因的褶皱浓缩。的 - - - - - -轴代表不同的官能团。点的大小表明基因中含有不同官能团的数量,和点的颜色反映了不同范围的 。的基因数量越大,点越大。梯度从绿色到红色代表的变化 值从大到小。去分析度分为三个功能组:BP (a), CC (b),和MC (c)。(d)十大KEGG通路富集度的分析。:基因本体;KEGG:京都基因和基因组的百科全书;英国石油(BP):生物过程;答:细胞组成;MF:分子功能;度:差异表达基因。
3.3。KEGG途径分析

图2显示了前10名KEGG浓缩度的途径,并补充文件3显示所有路径信息。主要途径包括长期抑郁、缝隙连接和鞘脂类信号通路。

3.4。PPI网络建设和模块分析

研究了PPI网络更好地理解度的生物学特性。图3显示了PPI网络的细节和相应的模块。有584个节点和316年这个网络边缘。三大模块被网络导入Cytoscape生成。


图3
PPI网络的度分析的结果。圆圈代表基因;基因之间的线代表了PPI,圈内的图片代表蛋白质结构。线的颜色代表了PPI证据水平。PPI:蛋白质相互作用;度:差异表达基因。
3.5。基因选择和分析中心

基于关键模块,我们筛选基因通过应用中心从Cytoscape cytoHubba插件。三个算法,MCC DNMC,跨国公司,被用来识别基因十大中心,和五个中心相比,肥胖老鼠基因识别控制:UTP14A, Dkc1中,DDX10, PinX1, ESF1,如表所示1和图4。

表1
基于cytoHubba中心基因。
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(d)
(d)
图4
蛋白质交互模块构建基于度(a - c)。圆的大小和线的厚度代表重要性的程度;圆和厚越大,这是更重要的。颜色代表的程度值。橙色意味着最小的程度值,蓝色意味着最大的程度值。(d)共同基因中心的维恩图基于三种方法。度:差异表达基因;DMNC:最大密度附近组件;MCC:最大小团体中心;跨国公司:最大邻域组件。
3.6。肥胖老鼠的一般条件

喂养24周后,小鼠的体重高脂肪组明显高于对照组。与高脂组相比,对照组有更快的动作,平滑和深色头发,小的心,和更少的心外膜脂肪。HFD集团小鼠的心脏重量的价格相比明显高于非传染性疾病组( )。结果如图所示5。

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图5
高脂肪饮食对小鼠的影响。(一)比较的非传染性疾病和HFD老鼠。(b)小鼠高脂饮食对体重的影响( )。(c)的代表宏观图像的心。(d)之间的心脏重量比较两组的老鼠( )。使用独立的样本数据进行处理 - - - - - -测试。 代表 。非传染性疾病:正常饮食;HFD:高脂肪饮食。
3.7。心肌组织病理学

他染色结果显示,对照组的心肌细胞排列简洁有序的细胞外基质,而肥胖组的心肌细胞增大和轻微无序与更多的细胞外基质。马森染色显示,对照组是苗条的胶原组织有序的分布,以及胶原组织肥胖组明显增加,屋里很乱,且分布不均,在血管和炎症细胞,如图6。

(一)
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图6
他和马森每组大鼠心肌组织的染色(200 x)。他在每组大鼠心肌组织的染色(a, b)。马森每组大鼠心肌组织的染色(b, c)。图的左边代表正常组,和右边代表了高脂肪组。
3.8。肥胖对心脏的影响血管生成、增殖和功能

确定肥胖对心血管的影响血管生成,我们测量老鼠心脏组织的毛细血管密度。与对照组相比,心肌毛细血管密度略减少肥胖的老鼠,但没有统计学意义( )。随后,我们观察到轻微的vWF因子表达增加肥胖老鼠的心。双重免疫荧光染色法显示,内皮细胞的增殖能力的肥胖老鼠降低与对照组相比,但两组之间没有统计学差异( ),如图7。UTP14A的表达水平,DKC1中,DDX10 PinX1, ESF1明显与受损的心脏血管生成(补充文件4)。

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(c)
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(d)
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图7
比较心脏血管生成,血管内皮细胞增殖和损伤NCD-heart和HFD-heart之间。(a) Immunofluorescent Ki67的染色和CD31在非传染性疾病检测内皮细胞增殖和HFD心;(b) CD34免疫荧光染色确定心脏微血管的数量。(c) VWF免疫荧光染色确定内皮细胞损伤的比例。(d)的比较cd34多细胞/高通滤波器之间的非传染性疾病和HFD心(& , )。(e)的比较vWF-positive细胞/高通滤波器之间的非传染性疾病和HFD心(& , )。(f)的百分比的比较Ki67-positive细胞之间的非传染性疾病和HFD心(& , )。非传染性疾病:正常饮食;HFD:高脂肪饮食;高通滤波器:大功率领域。

4所示。讨论

全球心血管疾病死亡的主要原因,及其患病率继续增加。的主要风险因素包括血脂异常、胰岛素抵抗和2型糖尿病。肥胖是与这些危险因素密切相关(18,19]。因此,肥胖的人更容易得到心血管疾病和死亡率比体重正常的人。对于肥胖病人,异常增加脂肪组织可以增加细胞因子的释放和生物活性介质,如瘦素、il - 6、TNF,可以激活炎症机制和影响心脏的正常代谢20.]。心脏微循环心脏代谢中发挥着重要作用,内皮是微循环的主要细胞类型。因此,当微循环的低炎症引起的肥胖相关胰岛素抵抗和细胞因子释放的脂肪细胞,它就不可避免地导致内皮功能障碍(21,22]。在这项研究中,我们演示了通过免疫细胞化学肥胖对心脏微循环的影响。结果表明,肥胖可导致血管内皮功能障碍,增加细胞损伤,减少细胞增殖。

血管生成是维护正常生理功能所必需的。众多研究表明,肥胖促进血管生成在不同的肿瘤和脂肪组织(23- - - - - -25]。然而,心脏的病理生理学微脉管系统处于肥胖状态仍然是值得探索。研究表明,肥胖老鼠心脏微血管密度明显高于正常小鼠,但它会随着疾病的进展。人类心脏组织的另一项研究表明,肥胖显著降低微血管的数量(26- - - - - -28]。在这项研究中,病理检查的结果显示,肥胖可以增加心肌细胞的直径,增加胶原纤维,降低微血管的数量。

确定遗传机制肥胖对心脏微循环的影响,我们GSE98266分析数据,发现763度,其中包括629个调节基因和134个基因表达下调。富集分析表明,这些度主要是与转录的规定,dna模板、核酸绑定,和金属离子结合。KEGG路径分析显示,富集度在长期抑郁,缝隙连接和鞘脂类信号通路。DKC1中,最后,我们发现UTP14A DDX10, PinX1, ESF1中心基因在两组之间。

U三个蛋白14 (UTP14A)是一个小的核仁的RNA与蛋白质14同系物的U 3,属于UTP14家庭,扮演一个关键的角色在核糖体的合成和18 s rRNA [29日]。在病理状态下,UTP14A发挥其作用主要是通过促进血管生成。已经指出,UTP14A参与结肠癌的发展通过促进血管生成,而抑制UTP14A可以改善患者的预后30.,31日]。的upregulation UTP14A与食道癌的发展(32]。同样,PIN2 / TRF1-interacting端粒酶抑制剂1 (PinX1)是参与癌症的发展通过血管生成33]。在这项研究中,UTP14A和PinX1被确定为关键基因在肥胖老鼠的心脏,这可能是参与与肥胖相关的心脏的病理生理学效应通过调节心脏微脉管系统的平衡,但是没有相关的研究来验证这一点。

的角化病congenita 1 (DKC1中)基因位于X染色体中xq28,首次被发现,因为基因发生突变,导致角化病congenita [34),以及各种癌症和肺纤维化(35,36]。研究表明,DKC1中可以通过促进血管生成和参与癌症恶化与氧化应激密切相关(37,38]。死/ H盒RNA解旋酶10 (DDX10)与各种癌症和血液系统疾病(39,40]。然而,在ESF1研究很少,它的作用还不清楚。

本研究发现obesity-induced心脏损伤的关键基因和相关通路通过基因芯片。DKC1中,值得注意的是,UTP14A和PinX1都在各种疾病与血管生成密切相关,所以我们推测这三个可能影响心脏血管生成在肥胖,但他们在心脏组织血管生成作用尚不清楚。此外,我们证明,肥胖可以增加心肌细胞的大小,增加心肌胶原纤维的矩阵,并减少心脏微血管数量,减少内皮增殖可影响心脏的微循环,导致心脏功能受损。这还需要进一步实验验证。

5。结论

UTP14A DKC1中,DDX10、PinX1 ESF1可能参与影响血管生成obesity-induced心脏损伤的心脏。

数据可用性

使用的数据来支持这项研究的结果可以从第一作者。

伦理批准

动物实验过程是动物河北综合医院伦理委员会批准。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了河北省中央领导地方科技发展基金项目(206 z7702g)。

补充材料

GSE98226数据集从地理下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。补充文件1:度。补充文件2:富集分析。补充文件3:KEGG途径分析。补充文件4:相关性UTP14A DKC1中,DDX10, PinX1, ESF1表达式和心脏血管生成。(补充材料)