文摘

作为一个活跃的形式的维生素D (VD), 1, 25-dihydroxyvitamin D (1,25 (OH)₂D₃)是参与许多代谢疾病的发展,如糖尿病、自身免疫性疾病和肿瘤。而前瞻性流行病学研究一直牵连VD缺乏葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的规定,具体机制仍不清楚。在这里,我们生成的1α(OH) ase-null老鼠体内25 -羟维生素D(靶向消融的1α羟化酶酶),发现这些老鼠肝葡萄糖生产过剩,葡萄糖耐受不良,肝胰岛素抵抗伴随着减少Sirtuin蛋白1 (Sirt1)表达式。染色质免疫沉淀反应(芯片)和荧光素酶记者化验显示,1,25 (OH)₂D₃激活VD受体(VDR)直接与VD响应元件(VDRE) Sirt1启动子转录上调Sirt1,引发一连串的丝氨酸/苏氨酸激酶(激酶)磷酸化在S473 FOXO1 S256磷酸化。这种磷酸化级联gluconeogenic基因的表达减少,最终衰减肝葡萄糖生产过剩。此外,信号通路被发现调节糖质新生涉及船舶、Sirt1, Rictor (mTOR复杂2 [mTorc2])的一个组成部分,一种蛋白激酶,FOXO1, Sirt1和FOXO1被当成糖质新生特异表达的关键调节器由于VD缺乏症。

1。介绍

2型糖尿病是由遗传和环境因素的结合。长期观察研究一直缺乏维生素D (VD)或VD相关受体(VDR)基因多态性葡萄糖代谢(1- - - - - -4),尽管皮塔饼等人在2019年报道,补充额外的VD并不有助于预防糖尿病不管基线血清人体内25 -羟维生素D水平(5]。除了少量的VD被小肠吸收,VD的主要来源是合成的皮肤。人体内25 -羟维生素D VD形式作用下的25-hydroxylase肝脏,然后转化为VD的活性形式,1,25-dihydroxyvitamin D₃(1,25 (OH)₂D₃),1的作用α在肾脏羟化酶酶。1,25 (OH)₂D₃核激素,调节基因转录和施加其影响通过其受体直接绑定,论述,形成一个复杂的视黄酸受体(RXR)作用于各种VD响应元素(VDR)位于基因启动子6]。2型糖尿病的主要特征是异常肝醣类和胰岛素抵抗;然而,VD的机制调节糖质新生在生理条件下应进一步调查。

FOXO1,主要通过其磷酸化调节转录因子在多残留,扮演重要的角色在糖质新生的调制和肝糖分解通过胰岛素/ Akt信号(7,8]。喂养可以调用在肝脏胰岛素信号通过激活的磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(激酶)和下游FOXO1,结果在排除FOXO1离原子核,诱导的转录抑制fasting-induced glucose-6-phosphatase (G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (PCK1),从而减少糖质新生(9]。FOXO1报道调解VD deficiency-induced在骨骼肌胰岛素抵抗[10];然而,VD信号之间的机械连接,糖质新生,在肝脏胰岛素抵抗仍不明朗。酶Sirtuin蛋白1 (SIRT1) Sirtuin蛋白家族中的一员负责脱去乙酰基的蛋白质细胞调节的关键(11,12),其获得的功能增加能源效率和防止糖尿病小鼠(13]。据报道,肝脏特异性删除Sirt1上调G6Pase的表达和PCK1损害mTorc2 / AKT FOXO1通路,从而增加肝葡萄糖生产和慢性高血糖症(14]。我们的初步实验表明,1,25 (OH)₂D₃有缺陷的小鼠Sirt1的表达下调表达。然而,VD缺乏是否会影响肝脏中糖质新生和胰岛素抵抗通过调节Sirt1表达式和AKT / FOXO1信号尚不清楚。

在这里,我们调查的影响,1,25 (OH)₂D₃缺乏与删除糖质新生1α日月光半导体(哦)在活的有机体内而在VDR-knockdown HepG2细胞在体外。我们的研究结果表明,1,25 (OH)₂D₃积极监管Sirt1的表达,一个重要的脱乙酰酶参与调节葡萄糖和脂质代谢,通过绑定到其受体。减少Sirt1水平1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠表达下调Rictor的表达,一个关键组成部分mTorc2复杂,受损的一种蛋白激酶的磷酸化S473 FOXO1 S256,和增加的表达G6pase PCK1,导致肝葡萄糖生产过剩,肝胰岛素抵抗,最终,慢性高血糖症。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

的压力在我们的研究中使用的所有小鼠C57BL / 6 j。1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠生成和特征如前所述,熊猫等。15]。年龄和sex-matched 1α日月光半导体(哦)^{- / -},1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg和野生型(WT)的同胞被随机分为四组(> 10老鼠每组)。为了避免激素的影响,本研究中使用的老鼠都是男性。断奶后,男性WT, 1α日月光半导体(哦)^{- / -},1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg老鼠分为下列不同群体之一:(1)WT老鼠与救援饮食(RD)(含2.0%钙、磷1.25%,和20%乳糖),(2)1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠RD, (3) 1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠与正常饮食(ND)(含1.0%钙和磷0.67%)和皮下注射1,25 (OH)₂D₃(σ,# 705942的正常饮食+ 3周皮下注射1,25 (OH)₂D₃在一个剂量的1μ克/公斤鼠标),(4)1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg老鼠RD。所有的动物实验动物保健和使用委员会批准的南京医科大学。

2.2。测量血清钙和磷的水平

血清钙和磷含量分析与autoanalyser(日本日立7180)使用相应的工具从MedicalSystem生物技术有限公司有限公司

2.3。葡萄糖测量

老鼠喂养或禁食条件下维护。实验测定的血糖水平与血糖仪(拜耳)和对应的血糖测试条(拜耳)。

2.4。丙酮酸耐量试验(PTT) /葡萄糖耐量试验(GTT)

禁食16小时后,测量体重和血糖水平,和20%的丙酮酸(PTT、σ# 792500)/ 20%葡萄糖(GTT)注入每个鼠标ip 100μL / 10 g的体重。血糖水平与血糖仪监测在15 - 30分钟间隔超过2小时。同时,血液收集(0),15日在GTT葡萄糖注射液和120分钟后,测量和胰岛素水平。

2.5。胰岛素耐量试验(ITT)

在测量体重和血糖水平,胰岛素注入小鼠禁食4小时ip为0.8μL /公斤体重。的血糖水平是衡量GTT / PTT。

2.6。酶联免疫吸附试验

小鼠血清1,25 (OH)₂D₃和胰岛素水平被酶联免疫吸附试验化验用鼠标1,25 (OH)₂D₃酶联免疫试剂盒(Cusabio # CSE-E1369m)和鼠/鼠标胰岛素酶联免疫试剂盒(微孔,# EZRMI-13K)制造商的指示。

2.7。细胞培养

人类肝癌细胞HepG2获得Cobioer生物科学(中国南京)培养在high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)含10%胎牛血清(Gibco), 100国际单位/毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。

2.8。RNAi转染

控制核(si-NC)和si-VDR (si-VDR1 si-VDR2)购买了VDR击倒GenePharma公司(上海,中国)。核目标序列5 - - - - - -GUGCCAUUGAGGUCAUCAUTT-3 。细胞被镀在6-well盘子和增长到70%的细胞密度。然后,执行瞬时转染使用Lipofectamine RNAiMAX(表达载体,# 13778 - 075年)根据制造商的指示。

2.9。VD和盐酸SRT1720治疗

HepG2细胞生长与high-glucose含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)没有或10⁷米1,25 (OH)₂D₃(# 705942)Sigma-Aldrich 48小时。此外,转染48小时后,HepG2细胞维持high-glucose DMEM含有10%的边后卫在100 nM SRT1720盐酸(选择性SIRT1激活,谢立克,# S1129)之后的另一个6小时葡萄糖生产与上层的测定。

2.10。葡萄糖生产试验

HepG2细胞培养48小时,洗在PBS去除葡萄糖,葡萄糖生产然后孵化缓冲区(2毫米丙酮酸和乳酸20毫米(σ,# 1614308)在PBS)。然后,100纳米胰岛素被加入到文化和孵化前30分钟样本收集。后来,葡萄糖浓度测定6小时后葡萄糖检测设备(表达载体,# A22189)。葡萄糖浓度计算的基础上,区别在乳酸/ pyruvate-free培养基培养细胞和培养在丙酮酸/ lactate-supplemented媒介。

2.11。西方墨点法

西方墨点法进行了使用抗体与Tiangen VDR (Proteintech, # 67192 - 1 - ig), Sirt1(细胞信号技术,# 9475),Rictor(细胞信号技术,# 9476),FOXO1(细胞信号技术,# 2880),FOXO1磷酸化在S256(细胞信号技术,# 84192),一种蛋白激酶(细胞信号技术),一种蛋白激酶磷酸化在S473(细胞信号技术,# 4060),G6pase (bios, # bs - 4044 - r), PCK1 (Abcam ab70358)和GAPDH (Proteintech, # 60004 - 1 - ig)。按照标准程序进行免疫沉淀反应。

2.12。免疫组织化学

免疫组织化学染色在S256 FOXO1磷酸化,AKT在S473磷酸化,并使用avidin-biotin-peroxidase Sirt1是复杂的技术与FOXO1磷酸化抗体S256(细胞信号技术,# 84192),一种蛋白激酶磷酸化在S473(细胞信号技术,# 4060),和Sirt1 (Abcam # ab189494)。

2.13。实时定量PCR(存在)

肝组织总RNA分离或HepG2细胞试剂盒试剂(表达载体,# 12183555)。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript RT试剂(豆类,# 639506)逆转录工具包。使用SYBR绿色PCR定量rt - PCR进行主(应用生物系统公司,# 4309155)和混合使用ABI 7500实时PCR系统分析。使用的引物补充表所示1。

2.14。荧光素酶检测

Luc-SIRT1和VDR超表达的质粒转染293 t细胞。两个VDR结合位点和一个RXR绑定网站SIRT1及其相应的特点结合主题被用于设计点突变。Luc-SIRT1-mut1的质粒,Luc-SIRT1-mut2 Luc-SIRT1-mut3放大了PCR使用内Q5点突变的方法。Luc-SIRT1的质粒和VDR过度或VDR核转染293 t细胞,所以Luc-Sirt1-mut1, Luc-Sirt1-mut2, Luc-Sirt1-mut3质粒与VDR超表达质粒。孵化后48小时,荧光素酶活性与dual-luciferase试验系统评价(Promega # E2920)。这个试验中使用的引物补充表所示2。

2.15。染色质免疫沉淀反应——(芯片)qPCR化验

HepG2细胞治疗10⁷米1,25 (OH)₂D₃和培养24小时收集和1%甲醛交联(σ)15分钟,和芯片进行anti-VDR (Proteintech, # 67192 - 1 - ig)抗体。执行中存在如前所述。这qPCR试验中使用的引物补充表所示3。

2.16。统计分析

学生的 - - - - - -测试是用于比较分析样本之间的差异。的值 被认为是具有统计学意义。数据表示为 。GraphPad Prism 6.0应用画图表。

3所示。结果

3.1。高钙和磷的作用膳食补充剂在纠正低钙血症引起的1,25 (OH)₂D₃缺乏

的水平血清钙、磷酸、和1,25 (OH)₂D₃在1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠用ND明显低于WT同窝出生的。排除可能的低钙血症对葡萄糖体内平衡,富含钙和磷的RD是用来喂养WT和1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠直到6个月大的时候。没有发现显著变化在血清中钙、磷水平(数字1(一)和1 (b)),而血清1,25 (OH)₂D₃是检测不到1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠(图1 (c))。这些结果表明,高钙磷饮食可以纠正低钙血症引起的维生素D缺乏活跃,排除这个因素的影响发展和进展的葡萄糖代谢障碍引起的维生素D缺乏活跃。

3.2。1,25 (OH)₂D₃缺乏增加肝醣类

澄清VD的角色在葡萄糖代谢,血液葡萄糖水平检测,结果显示明显较高的血糖水平1α日月光半导体(哦)^{- / -}比WT同窝出生的老鼠喂食和禁食条件下(图2(一个))。随后,PTT进行阐明是否升高血糖水平在1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠是由肝脏中葡萄糖生产过剩造成的。结果表明:1α日月光半导体(哦)^{- / -}丙酮酸后小鼠显示出较高的血糖水平管理(图2 (b))。一致,G6pase的表达和PCK1 gluconeogenetic基因,会增加2 - 3重mRNA和蛋白水平(数字2 (c)和2 (d))。1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠还在GTT葡萄糖耐受不良(图显示2 (e))。然而,我们并没有发现显著差异在胰岛素分泌1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠和WT同窝出生在GTT(图2 (f))。一致,HepG2细胞与VDR击倒(图2 (g))产葡萄糖约2倍高于控制细胞(图2 (h))。G6Pase mRNA和蛋白表达水平和PCK1 VDR-knockdown集团(数据也显著增加2(我)和2 (j))。总的来说,这些结果说明可以增强肝脏糖质新生1,25 (OH)₂D₃缺乏或击倒的受体。

3.3。1,25 (OH)₂D₃缺乏提高糖质新生和肝胰岛素抵抗可能通过影响一种蛋白激酶的磷酸化和FOXO1

肝脏对胰岛素的反应是至关重要的转录抑制葡萄糖生产降低下来PCK1和饭后G6pase在正常生理条件下16,17]。澄清是否1α(OH) ase删除会降低胰岛素敏感性,ITT进行,但结果显示没有区别之间的血糖水平下降在胰岛素注射1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠和控制老鼠(图3(一个)),表明正常的外围胰岛素反应1例α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠。胰岛素可以抑制大多数肝基因,大部分是通过磷酸肌醇介导3-kinase (PI3K)途径18- - - - - -20.]。进一步测试肝胰岛素敏感性,控制和变异动物,禁食6小时服用胰岛素,并收集他们的肝脏30分钟后。结果表明胰岛素明显刺激一种蛋白激酶的磷酸化在S473 WT在突变小鼠的肝脏,但未能这样做,以西方墨点法(图3 (b)(图)和免疫组织化学(包含IHC)3 (c)在1),表明肝胰岛素抵抗α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠。与此同时,HepG2细胞转染si-VDR也未能表现出insulin-mediated FOXO1 / AKT信号激活在体外(图3 (d))。

鉴于上述研究结果,AKT的机制调节G6pase的表达和PCK1进一步调查。AKT调节糖质新生直接通过磷酸化FOXO1 S256,导致其核排斥(21,22]。数据3 (b)和3 (c)显示,极大地降低了表达式的p-FOXO1 S256肝脏的1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠老鼠相比WT(数字3 (b)和3 (c))。一致,insulin-induced磷酸化的FOXO1 S256也减少HepG2细胞与VDR删除控制HepG2细胞相比,所揭示的西方墨点法(图3 (d))。

肝脏的1α(OH) ase-deletion老鼠,减少的磷酸化FOXO1 FOXO1 S256建议增加活动,已被证明能提高G6pase和Pepck基因的转录23,24]。在HepG2细胞,FOXO1激活的异位表达PCK1使用荧光素酶启动子记者PCK1基因(图的构造3 (e))。符合上面的调查结果显示,1,25 (OH)₂D₃缺乏提高FOXO1的活动,VDR的siRNA的消融,连同FOXO1的过度表达,增强协同(图上面的效果3 (e))。我们一起发现的转录G6pase PCK1增加1,25 (OH)₂D₃缺乏小鼠肝脏,我们推测,激活FOXO1负责葡萄糖生产过剩观察肝脏的1α(OH) ase-knockout老鼠。因此,可以得出结论,VD信号受损可能诱发肝醣类和肝胰岛素抵抗通过衰减AKT的活动/ FOXO1轴。

3.4。Sirt1介导的影响1,25 (OH)₂D₃缺乏一种蛋白激酶/ FOXO1信号通过影响Rictor转录和葡萄糖代谢失调

的潜在机制1,25 (OH)₂D₃调节AKT / FOXO1活动进一步探索。Sirt1是积极调节AKT / FOXO1信号通路(14]。我们确定了三个论述在不同地区(图Sirt1的启动子的生物信息学分析4(一));因此,我们调查了VD是否可以改变Sirt1在肝脏转录水平的活动。Sirt1的mRNA和蛋白表达水平的肝脏1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠表达下调WT同窝出生(数据相比4 (b)- - - - - -4 (d)),也观察到类似的结果HepG2细胞VDR一直沉默(数字4 (e)和4 (f))。先前的研究已经表明,Rictor mTorc2复杂不可或缺的组成部分,可以负调节肝葡萄糖生产和AKT mTorc2复杂可以在S473磷酸化的反应刺激生长因子(25,26]。见王的研究et al ., SIRT1控制的表达Rictor通过交互NRF1 Rictor NRF1-binding网站的推广,从而调节葡萄糖代谢和胰岛素敏感性通过一种蛋白激酶/ FOXO1轴(14]。因此,Rictor是否参加的规定减毒活动FOXO1 / AKT通路的肝脏,25 (OH)₂D₃缺乏小鼠进一步调查。结果表明,Rictor的mRNA和蛋白表达明显下调的肝脏1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠与其WT的同胞相比(数字4 (g)和4 (h));一致的趋势有关Rictor表达式也观察到HepG2-si-VDR细胞(数字4(我)和4 (j))。与此同时,mTOR2蛋白表达显示上述组之间没有差异,暗示Rictor功能有效的单元。进一步测试Sirt1的角色在这个轴,我们培育1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg老鼠来指定是否过度Sirt1可能正常化葡萄糖耐受不良中观察到1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠。相比那些从1α日月光半导体(哦)^{- / -}小鼠肝脏样本1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg老鼠增加了Sirt1和Rictor蛋白表达(图5 (c)),1的公差α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg老鼠丙酮酸刺激(图5(一个))和葡萄糖(图5 (b))部分改善,揭示了PTT和GTT。与此同时,1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg小鼠肝脏增强pAKT-S473展出和pFOXO1-S256表达肝脏的胰岛素相比,1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠(图5 (d)),这表明过度Sirt1恢复受损的肝脏胰岛素信号通路诱导1,25 (OH)₂D₃缺乏在活的有机体内。

此外,图5 (e)显示明显海拔Sirt1 HepG2细胞表达处理100海里SRT1720HCL 6小时相比,控制细胞(图5 (e))。因此,与100 nM SRT1720HCL HepG2细胞治疗,丙酮酸的变化——而且lactate-stimulated葡萄糖生产和相关基因表达被观察到。一致的结果中观察到的动物,管理SRT1720HCL增强Rictor的表达以及FOXO1目标基因G6pase PCK1,以存在(图5 (g))和免疫印迹(图5 (h))。与此同时,增加刺激的一种蛋白激酶磷酸化S473和FOXO1 S256(图5(我))和丙酮酸,减少lactate-stimulated葡萄糖生产也观察到HepG2细胞治疗SRT1720HCL(图5 (f))。因此,这些发现表明,Sirt1和下游Rictor所需VD-mediated感应FOXO1核控制肝醣类和葡萄糖代谢的排斥。

3.5。VDR积极监管Sirt1的表达通过绑定的VDRE Sirt1的启动子

1,25 (OH)₂D₃核激素,调节基因转录和施加其影响通过绑定它的受体,VDR [27]。确定VD施加其影响通过绑定受体直接调节Sirt1表达式,进行荧光素酶报告基因分析,结果表明,VDR超表达显著增强Sirt1的活动发起人而VDR消融siRNA反过来抑制,表明积极的调控之间VDR Sirt1(数字6(一)和6 (b))。3船舶被确定在不同地区的Sirt1发起人通过生物信息学分析,我们下一个探索一个主要功能。位点突变后VDR RXR Sirt1子地区的结合位点,VDR超表达仍然可以显著提高Sirt1-mut3启动子,但水平没有显著增强影响Sirt1-mut1和Sirt1-mut2启动子(VDR)(图6 (b)),这表明mut3序列(RXR)并不是一个功能区域。同时,ChIP-qPCR HepG2细胞化验证实VDR当时身体丰富Sirt1启动子区域(图6 (c))。因此,上述研究结果表明,VDR积极调节Sirt1在转录水平的表达通过绑定的VDRE Sirt1的启动子。根据上述发现,1,25 (OH)₂D₃不足或抑制VDR的损伤导致Sirt1-mTOR2-AKT / FOXO1信号通路在活的有机体内和在体外。因此,我们所知,这些研究结果首次表明Sirt1,目标的VDR基因,直接介导的影响VD信号受损的肝葡萄糖生产和胰岛素敏感性。

3.6。补充和1,25 (OH)₂D₃逆转1的表型α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠

随后,1,25 (OH)₂D₃1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠与管理1,25 (OH)₂D₃探索是否补充和1,25 (OH)₂D₃可以逆转的葡萄糖代谢表型1,25 (OH)₂D₃有缺陷的老鼠。GTT和PTT透露的改善对丙酮酸的反应(图5(一个))或葡萄糖(图5 (b))刺激。免疫印迹显示政府的1,25 (OH)₂D₃增强了VDR的肝脏和Sirt1表达1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠和;此外,Rictor表达显著调节,而糖质新生的关键基因的表达G6Pase和PCK1明显下调比1的水平α日月光半导体(哦)^{- / -}同窝出生的RD(图5 (c))。此外,胰岛素未能使磷酸化AKT S473和FOXO1 S256肝脏的1α日月光半导体(哦)^{- / -}小鼠肝脏的但可以做1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠补充1,25 (OH)₂D₃(图5 (d)),这表明1,25 (OH)₂D₃政府改善了受损的肝脏胰岛素信号通路。一直在HepG2细胞处理1,25 (OH)₂D₃,存在(图5 (g))和免疫印迹(图5 (h))还透露FOXO1目标基因的表达G6pase PCK1。与此同时,刺激的一种蛋白激酶磷酸化水平在S256 S473和FOXO1磷酸化(图5(我))增加,pyruvate-stimulated葡萄糖产量显著降低(图5 (f))。上述观察结果表明,增强VDR信号1,25 (OH)₂D₃促进FOXO1磷酸化和核积极排除肝细胞通过调节SIRT1表达式,随后激活mTOR2-AKT / FOXO1通路(图7)。

4所示。讨论

流行病学调查已经证明,VD缺乏呈正相关,与代谢综合征的发生和发展28]。然而,具体机制1,25 (OH)₂D₃缺乏导致高血糖症和胰岛素抵抗仍然遥遥无期。异常肝葡萄糖生产一直牵连一些人类疾病的主要因素,如肝硬化、胰岛素抵抗和2型糖尿病。此外,Sirt1在肝脏活动影响糖质新生和胰岛素抵抗14]。然而,是否VD-deficient信号在肝脏增加糖质新生和胰岛素抵抗或触发Sirt1活动的失调是未知的。我们的研究结果表明:1α日月光半导体(哦)^{- / -}增强小鼠糖质新生和肝胰岛素抵抗和减少Sirt1在肝脏的表情。相比之下,增强VDR信号,1,25 (OH)₂D₃1调节Sirt1的表达式α(哦)^{- / -}老鼠和HepG2细胞。Sirt1表达式的VD3-dependent激活VDR是撞倒时消失。这些结果表明,Sirt1介导1是一个主要的目标α(OH) ase-null信号在肝脏。管理Sirt1兴奋剂SRT1720 HCL规范化糖质新生和肝胰岛素敏感性和阻止了丙酮酸和葡萄糖耐受不良发生在1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠。这些新的发现表明抑制Sirt1的表达在肝脏可能负责增强糖质新生,肝胰岛素抵抗,和葡萄糖代谢的1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠。

肝脏胰岛素信号在糖质新生和葡萄糖代谢中发挥着关键作用。FOXO1介导VDR是一个关键的目标信号的骨骼肌(10]。在生理条件下,胰岛素抑制FOXO1活动通过激活胰岛素受体(IR) / phosphatidylinositol-3-kinase PI3K / AKT信号通路,导致的磷酸化FOXO1及其运输到细胞质和退化,减少G6Pase和PCK1表达,减少肝葡萄糖生产,提高糖原合成(9,29日,30.]。然而,在VD不足的情况下,gluconeogenesis-related基因的表达G6pase PCK1增加1,25 (OH)₂D₃缺乏小鼠和HepG2细胞与VDR击倒,证明受损VD信号(1α(哦)ase删除或VDR击倒)可能会增加肝脏糖质新生,从而导致高血糖症。此外,我们的研究结果表明显著减少一种蛋白激酶的磷酸化(S473)和FOXO1 (S256) 1的肝脏α日月光半导体(哦)^{- / -}原子核中的老鼠,增加FOXO1积累,提高下游PCK1和G6Pase的表达。我们的研究结果清楚地表明,1,25 (OH)₂D₃负调节FOXO1表达式和活动在肝脏(图3)。1,25 (OH)₂D₃激活一种蛋白激酶/ FOXO1轴,提供机制连接糖质新生FOXO1的证据。

多项研究表明,减少胰岛素/ PI3K / AKT信号抑制FOXO1磷酸化在三个地点(T24, S256 S319),提高后续FOXO1核易位和活动,诱导胰岛素抵抗[8]。VD和insulin-mediated AKT通路收敛,共同努力促进一种蛋白激酶磷酸化S473和后续FoxO1 S256磷酸化。如图3 (b),1α日月光半导体(哦)^{- / -}小鼠受损的一种蛋白激酶磷酸化胰岛素治疗。然而,如图3(一个),ITT没有表现出显著差异在胰岛素耐量WT KO小鼠,这表明insulin-induced损伤的一种蛋白激酶磷酸化在1α日月光半导体(哦)^{- / -}老鼠不能影响胰岛素的活动。此外,没有检测到异常血清胰岛素水平在正常和突变组,表明增强肝引起的糖质新生1,25 (OH)₂D₃缺陷可能不会导致小鼠全身胰岛素抵抗年龄6个月;然而,我们不能排除这种可能性,骨骼肌和脂肪组织也将展示在肝脏胰岛素抵抗与1,25 (OH)₂D₃有缺陷的老鼠长大。研究探讨VD的生物机制调节肝脏糖质新生正在摆脱胰岛素。

先前的研究已经表明,Sirt1调节葡萄糖和脂类代谢的一个重要基因,可以调节水平的一种蛋白激酶/ FOXO1磷酸化通过中介Rictor [14,31日]。鉴于1,25 (OH)₂D₃缺乏表达下调Sirt1的表达和Rictor,我们进一步培育1α日月光半导体(哦)^{- / -}Sirt1^Tg老鼠,发现这些老鼠的宽容为葡萄糖和丙酮酸提高相比WT同窝出生的,建议恢复葡萄糖代谢,减少葡萄糖的生产。值得注意的是,VD信号通路的激活1,25 (OH)₂D₃或通过Sirt1的upregulation Sirt1的^Tg或化学由Sirt1激活受体激动剂(盐酸SRT1720)归一化葡萄糖生产过剩和葡萄糖代谢在活的有机体内和在体外通过移植的一种蛋白激酶磷酸化S473 S256 FOXO1磷酸化,从而减少表达PCK1和G6Pase。然而,这还有待阐明受损VD / VDR信号抑制Sirt1转录直接绑定到VDR Sirt1子元素,间接绑定通过一些连续的DNA转录因子,或间接调制的其他基因。

VDR,核受体超家族的一员,可以调节基因的转录,绑定VD-responsive元素在目标基因的启动子区域。在大多数情况下,船舶和RXR形成一个复杂的服务积极调节基因的表达(32]。因此,VDR芯片分析Sirt1的启动子区域,执行和结果显示VDR浓缩VDRE Sirt1的启动子和证实了积极监管之间VDR Sirt1,证明VDR可以直接调节Sirt1基因表达在转录水平。与此同时,我们的研究结果表明,VDR是绑定到VDRE Sirt1 Sirt1转录启动子和增强,这符合VDR基因表达的积极作用。研究报道,年轻小鼠肝脏特异性Sirt1-knockout患有高血糖症,逐步开发一个受损的胰岛素反应,因为他们长大了,最后展示全身胰岛素抵抗[33- - - - - -37]。与这些结果相一致的是,我们的研究表明,1,25 (OH)₂D₃删除负面监管mTOR2 / AKT通路通过直接抑制Sirt1的转录和随后Rictor,从而提高肝葡萄糖生产,导致高血糖症以及葡萄糖代谢功能障碍。这些新发现表明,Sirt1减少肝脏可能负责肝胰岛素抵抗和葡萄糖代谢的1,25 (OH)₂D₃有缺陷的老鼠。虽然我们的研究结果表明,VDR在转录水平调节Sirt1,我们不能排除这种可能性,Sirt1的转录后的修改。杂种狗et al。38)报道,长期缺VD引起肝胰岛素抵抗通过损害PI3K-AKT-FOXO1通路而VD改善上述障碍GSK3通过激活一种蛋白激酶/β和AKT / FOXO1信号通路,这与我们的研究结果是相一致的。然而,他们没有进一步调查VD不足之间的潜在机制和受损AKT-FOXO1通路的激活。在我们的研究中,我们首次发现VDR-Sirt1关键基因调节病理和下游关键规范FOXO1 / AKT通路。

审查的清汤et al .,有几个报告,调查了维生素D信号对葡萄糖代谢的影响(39]。一些报告显示积极的结果,而另一些是负的。我们的研究显示,小鼠的血清胰岛素水平较低的钙和维生素D缺乏造成的低磷没有显著减少与野生型小鼠相比,当美联储与高钙和磷的食物,这可能是相关的低钙由于缺乏VD的摄入量。此外,VDR-null老鼠通常用于缺VD模型的建立在先前的研究。这里,我们生成的纯合子小鼠目标1的删除α(OH) ase表达仍有VDR基因在细胞尽管VDR水平下降,这是符合人类VD的生理缺陷。1的主要病理表现α(OH) ase-null小鼠肝脏中葡萄糖生产过剩和胰岛素抵抗在目前的研究中,虽然在1血清胰岛素没有出现异常,25 (OH)₂D₃有缺陷的老鼠。

5。结论

总之,我们的研究表明,VDR RXR形成蛋白质复合体,结合VDRE Sirt1的启动子,积极调节Sirt1的表达式。1α(OH) ase删除Sirt1的表达和Rictor下降,导致减少在S473一种蛋白激酶的磷酸化。这个事件保持FOXO1核本地化和诱发转录和翻译的增加G6pase PCK1,两个gluconeogenetic基因,导致肝脏中葡萄糖生产过剩和高血糖症和发现机制VD不足最终导致慢性高血糖症和肝胰岛素抵抗。通过理解1,25 (OH)₂D₃删除刺激G6PC和PCK1转录抑制的Sirt1-mTOR2 / AKT FOXO1轴和确定Sirt1在VD deficiency-induced损害胰岛素敏感性和葡萄糖耐受不良,我们提供关键证据对一个重要的代谢途径参与了2型糖尿病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

七元,Ridong张贡献同样这个手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81400789)和中国江苏省自然科学基金(没有。BK20140459)。

补充材料

补充表1:存在引物。补充表2:引物用于荧光素酶检测。补充表3:ChIP-qPCR引物。(补充材料)