文摘

背景。病理新血管形成,包括中断在病理条件下血管生成和抗血管新生因子之间的平衡,是许多眼内疾病的基础。色素epithelium-derived因子(PEDF)是一种有效的自然,内源性抑制剂的新血管形成,因为其反血管增生和神经保护的好处。然而,其应用受到不稳定,半衰期短。本研究旨在调查PEDF-loaded聚乙二醇纳米颗粒的细胞毒性和抗血管新生的影响(NP-PEG-PEDF)高分子人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。方法。在这项研究中,NP-PEG-PEDF是捏造的首次使用多重乳液的方法。HUVECs在高浓度葡萄糖培养(30更易与L d -葡萄糖),模拟糖尿病条件。抗血管新生的影响血管内皮生长因子(VEGF)、纯PEDF,和NP-PEG-PEDF增殖、迁移和管形成。VEGF分泌高分子HUVECs进一步体外测试。结果。NP-PEG-PEDF HUVECs表现出较低的细胞毒性。我们的研究结果表明,在体外,NP-PEG-PEDF减毒diabetes-induced HUVEC增殖、迁移和管形成和抑制VEGF的分泌。的细胞凋亡diabetes-induced HUVECs发生在剂量依赖性的方式,显示一个统计上的显著差异与PEDF相比治疗组。结论。我们的研究是第一个证明NP-PEG-PEDF发挥抗血管新生的影响高分子HUVECs和有可能减轻微血管功能障碍。这些数据表明,NP-PEG-PEDF交付系统可能提供一个创新的治疗策略,防止底部的血管新生。

1。介绍

病理(NV)眼底血管新生,如视网膜脉络膜的NV和NV,许多眼内疾病的基本病理变化,如年龄相关性黄斑变性(AMD) [1],病理性近视[2)、增生性糖尿病视网膜病变(PDR) [3]。NV的形成的原因尚不清楚,但它涉及的中断血管生成和抗血管新生因子之间的平衡在病理条件下,如缺氧和炎症(4,5]。在过去的十年里,抑制血管内皮生长因子已经成为治疗脉络膜新生血管形态,尽管相当数量的病人是耐火材料抗vegf治疗(6]。此外,发现抗vegf治疗也会影响生理血管和组织引发了担忧,关于这种疗法的长期不利影响(7]。开发新的抗血管新生药物来达到提高疗效和减少副作用是另一个选项来解决这些问题。

色素epithelium-derived因子(PEDF),这是由视网膜色素上皮(RPE)分泌的抗血管新生,anti-vasopermeability,和antineurotrophic功能,这是一个潜在生物标志物可能抑制糖尿病性视网膜病变(DR)的发展(8- - - - - -10]。根据目前的研究,PEDF被认为是一种很有前途的眼部保护代理能够阻止脉络膜血管生成和维护视网膜血管分布状态是一个重要的贡献者通过其抗氧化特性11- - - - - -13]。然而,难以维持在一个活跃的状态和缺乏适当的交付系统限制其应用程序作为抗血管新生药物在临床实践中。

聚乙二醇(PEG)是一种有助于实现mucoadhesive surface-modifying剂,稳定,隐形纳米粒(14- - - - - -16]。据报道,一个优化的聚乙二醇纳米脂质载体(缴送工作)可能是物理和化学稳定作为水分散体(至少一个月17]。在这项研究中,我们制定PEDF-loaded聚乙二醇纳米颗粒(NP-PEG-PEDF)和评估他们的体外细胞毒性和抗血管新生的影响高glucose-treated人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。我们的研究结果提供了一个潜在的治疗策略NV的眼底通过NP-PEG-PEDF药物输送系统。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

HUVECs得到来自美国组织培养收集(写明ATCC USA)和杜尔贝科修改鹰的培养基培养(DMEM) 10%胎牛血清(的边后卫;Hyclone、大岛屿,美国纽约)37°C湿润孵化器有限公司为5%2的气氛。

2.2。制备NP-PEG-PEDF

卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-FA(包含叶酸挂钩导数),和PEDF在氯仿/甲醇溶液混合的质量比1.7:2:1.7:1。有机溶剂是通过旋转蒸发,磷脂形成的薄膜在墙上的圆底烧瓶。超纯水是添加到混合物中。VCX130超声波破碎机是用于ultrasonicate混合物2分钟20 kHz的频率和功率130 W的水合物。纳米颗粒在过滤先后通过200 nm和100 nm聚碳酸酯过滤器的5倍,紧随其后的是三轮Amicon Ultra-4离心(美国微孔)。

2.3。表征NP-PEG-PEDF

NP大小(直径、海里),多分散性指数和表面电荷(电动电势,mV)被quasielastic激光光散射测量使用ζ朋友动态光散射(DLS)检测器(美国圣地亚哥贝克曼库尔特)25°C。分散的NPs之前被超纯水稀释到适当的浓度测量。NPs的形态是由透射电子显微镜(TEM)观察。NP悬浮液(2毫克/毫升)沾2% ( )磷钨酸,然后,他们都中了200 -网铜网格上涂上一层碳,在室温下干燥,观察到TEM仪器在100 kV (jeol - 1230、日本)。

2.4。HUVEC可行性分析

HUVECs被用来检测VEGF的血管生成作用和抗血管新生的影响NP-PEG-PEDF和纯PEDF在体外使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium (MTT)细胞增殖工具包(Sangon、上海、中国)测定。HUVECs被结合在DMEM high-glucose浓度(30更易/ L)的密度 每一夜之间在96孔板细胞没有的边后卫。HUVECs孵化了VEGF (20 ng / mL)或不同浓度的NP-PEG-PEDF PEDF(10、100和1000 ng / mL) 24、48和72 h。添加MTT试剂之后,这些细胞被孵化在37°C为另一个4 h。中虽曾小心翼翼地从每个,150μL (DMSO(σ,圣路易斯,密苏里州)添加到溶解甲瓒,最终产品,吸光度是使用一盘读取的波长540 nm的读者。细胞治疗中只设置为100%,和其他实验群体使用以下公式计算: 。

研究的血管生成抑制作用NP-PEG-PEDF VEGF的刺激下,20 ng / mL VEGF是添加到培养基中。PEDF同时NP-PEG-PEDF不同浓度测试上面孵化24,48岁和72 h,如前所述。在6井和执行每个实验至少重复三次。

2.5。流式细胞术分析HUVEC细胞凋亡

细胞凋亡测定用FITC膜联蛋白V凋亡检测设备(Beyotime科技有限公司有限公司、上海、中国),根据制造商的指示。总之,HUVECs被播种到6-well板块和孵化DMEM高葡萄糖(30更易/ L)包含10%的边后卫,VEGF (20 ng / mL), NP-PEG-PEDF(10、100和1000 ng / mL),或PEDF(10、100和1000 ng / mL) 24日,48和72 h。细胞被收集用0.25%胰蛋白酶和彩色propidium碘(π)和膜联蛋白V为30分钟37°C。早期的(膜联蛋白V+/π- - - - - -)和后期(膜联蛋白V+/π+)凋亡细胞被fluorescence-activated细胞分类排序(流式细胞仪)(BD生物科学,圣地亚哥,CA)。

2.6。抓伤口愈合试验

HUVECs ( 细胞每)被播种到12-well盘子和对待DMEM包含10%的边后卫。一旦细胞达到大约80%融合,单层使用无菌p200挠吸管小费。独立的细胞被温和的洗涤。随后,在细胞治疗与高葡萄糖DMEM(30更易/ L)含有2%的边后卫和补充VEGF (20 ng / mL), NP-PEG-PEDF (10 ng / mL和100 ng / mL),或PEDF (10 ng / mL和100 ng / mL) 24 h。细胞成像在0 h和24小时在倒置显微镜下。下面的公式是用来计算伤口闭合率: ,在哪里 代表了最初的伤口面积和面积 代表其余的伤口面积为24小时。

2.7。管的形成研究

VEGF的抗血管新生势,NP-PEG-PEDF PEDF测试使用管形成试验在高葡萄糖(30更易/ L)。整除(150μL)的基底膜基质(BD生物科学)解决方案投入24-well盘子和孵化在30分钟37°C的5%的股份有限公司2孵化器。HUVECs对待VEGF (20 ng / mL), NP-PEG-PEDF (10 ng / mL和100 ng / mL), PEDF (10 ng / mL和100 ng / mL),或控制被播种在人工基底膜和在DMEM培养8 h。人工基底膜的网络从五个随机选择的字段数,在显微镜下拍摄的。所有实验进行了一式三份。

2.8。VEGF通过酶联免疫吸附试验检测

HUVECs被播种到96孔板( 每口井)高葡萄糖(30更易/ L)和孵化一夜之间在37°C。删除DMEM之后,NP-PEG-PEDF (10 ng / mL和100 ng / mL)或PEDF (10 ng / mL和100 ng / mL)被添加到井。48和72 h孵化后,细胞培养上清液的收获,细胞碎片被离心分离去除。HUVECs VEGF蛋白分泌的培养基测定使用VEGF酶联免疫试剂盒购自博士德中国(武汉)根据制造商的指示。

2.9。统计分析

数据分析使用占据统计软件(版本15.0;StataCorp LLC)。所有数据了 并为常态分布进行评估。使用方差分析差异进行评估,其次是Student-Newman-Keuls测试多个比较和学生的 - - - - - -测试两两比较。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。表征NP-PEG-PEDF

数据1(一)和1 (b)显示,透射电子显微镜(TEM) NP-PEG-PEDF形象和大小分布,和NPs通常是球形的形状具有良好的单分散性。NP-PEG-PEDF的电动电势和水动力的大小 和 分别为0.183的多分散性。药物封装效率(EE)和药物加载效率(LE) NP-PEG-PEDF观察46.25%和7.23%这是临床应用的关键。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
(一)透射电子显微镜NP-PEG-PEDF的形象。(b) NP-PEG-PEDF大小分布。
3.2。NP-PEG-PEDF对HUVEC增殖的影响

HUVEC增殖研究被用来评估NP-PEG-PEDF和纯PEDF体外抗血管新生的影响在高葡萄糖(30更易/ L)。HUVECs被孵化24、48和72 h在不同浓度(10、100和1000 ng / mL)。如图2和表1,NP-PEG-PEDF-treated组在统计学上不同于PEDF-treated组浓度和时间点。进一步评估对VEGF NP-PEG-PEDF刺激的抑制作用,我们添加了20 ng / mL VEGF对细胞培养基,发现NP-PEG-PEDF也表现出更好的对HUVEC增殖抑制作用(图3和表2)。


图2
PEDF的影响和NP-PEG-PEDF HUVECs扩散一般培养基在高葡萄糖(30更易/ L) 24日,48和72 h。有效浓度(1000 ng / mL)在不同时间点所示。 。
表1
总结扩散效应和PEDF NP-PEG-PEDF-treated HUVECs在高葡萄糖(30更易/ L)。

图3
PEDF的影响和NP-PEG-PEDF HUVECs扩散与VEGF在高葡萄糖刺激(30更易/ L) 24日,48和72 h。有效浓度(1000 ng / mL)在不同时间点所示。 。
表2
摘要PEDF的扩散效应和NP-PEG-PEDF结合VEGF-treated HUVECS在高葡萄糖(30更易/ L)。
3.3。NP-PEG-PEDF对HUVEC细胞凋亡的影响

流式细胞仪是用来评估早期和晚期凋亡的影响。如表所示3和图4孵化后,PEDF与NP-PEG-PEDF加上10%的边后卫在高葡萄糖(30更易/ L) 24日,48岁和72 h,早期和晚期凋亡HUVECs显示显著差异在10,100,和1000 ng / mL-treated团体,凋亡细胞的百分比(UR + LR)明显高于那些在PEDF-treated细胞( )。

表3
流式细胞术资料概述细胞凋亡测定的膜联蛋白V和π。

图4
PEDF与NP-PEG-PEDF对HUVEC细胞凋亡的影响在高葡萄糖(30更易/ L)。DMEM + 10%的边后卫控制设置为100%。 。

我:左下方;LR:右下角;UL:左上角;你:右上角。

3.4。NP-PEG-PEDF对HUVEC迁移的影响

HUVEC细胞迁移是由划痕试验在高葡萄糖(30更易/ L)。如数据所示5和6,百分比伤口闭合的膜NP-PEG-PEDF-treated HUVEC组(10 ng / mL)明显低于在PEDF (10 ng / mL)和VEGF (20 ng / mL)治疗组( )。


图5
细胞划痕试验结果。PEDF与NP-PEG-PEDF对HUVEC挠伤口愈合的影响在高葡萄糖(30更易/ L)。

图6
统计结果的百分比伤口关闭(%)在不同的治疗方法。 。
3.5。NP-PEG-PEDF对HUVEC管形成的影响

在我们的研究中,PEDF和NP-PEG-PEDF-treated细胞表现出一种能力受损常规网络,如预期,HUVECs不能形成空腔(两组数据7和8)。NP-PEG-PEDF——尽管没有显著区别和PEDF-treated团体(10 ng / mL)的内腔形成,在NP-PEG-PEDF-treated HUVECs显示长度的统计差异与PEDF-treated组织和呈现圆形态没有分支机构,而PEDF-treated组倾向于形成管。


图7
PEDF的影响和NP-PEG-PEDF HUVEC管形成。NP-PEG-PEDF-treated HUVECs呈现圆形态和没有显示出细胞分支试图形成网络。

图8
管的长度形成的统计结果在不同的治疗方法。DMEM + 10%的边后卫控制设置为100%。 。
3.6。NP-PEG-PEDF对HUVECs VEGF分泌的减少

如图9和表4治疗48和72 h后,VEGF表达下调的PEDF和NP-PEG-PEDF团体在高葡萄糖(30更易/ L)。NP-PEG-PEDF (100 ng / mL)治疗细胞显示VEGF分泌比PEDF组在两个时间点( )。


图9
PEDF的影响和NP-PEG-PEDF治疗在HUVECs VEGF的分泌。NP-PEG-PEDF-treated组(100 ng / mL)表现出显著抑制VEGF分泌48和72 h ( )。
表4
总结VEGF分泌(pg / mL) PEDF——NP-PEG-PEDF-treated HUVECs。

4所示。讨论

视网膜或脉络膜的NV同源的眼底的一些眼部疾病的病理基础,包括PDR和AMD。目前的研究表明,葡萄糖代谢影响的平衡proangiogenesis博士和抗血管过程参与的发展(18,19]。因此,抗血管新生治疗,特别是intravitreal注射vegf抗体,仍然是全世界最有效的治疗策略。然而,它的副作用,如眼内炎、眼内炎症,眼部出血,视网膜脱离,血栓形成,和心血管事故,促使我们寻找新的替代产品(20.- - - - - -22]。PEDF已经证明是一个重要的治疗管理的兼职影响视觉疾病引起的血管通透性增加。

PEDF, 50 kDa内生分泌糖蛋白(时23),是一个多才多艺的保护一些眼部疾病的血管生成抑制剂(24- - - - - -26]。表示在许多不同的细胞在胎儿和成人的眼睛,包括角膜细胞、晶状体和视网膜。它是一种新型的代理可以帮助抑制的发生新的脆弱的血管在视网膜上27,28]。有很多提议机制PEDF可能减少新血管形成和减弱新生血管性渗透率:通过抑制VEGF通路下调增殖kinase-mediated低氧诱导因子1激活[29日),通过增强γ-secretase-dependent乳沟糖磷酸化的VEGF受体1 (30.,31日),激活细胞凋亡调节多个通路的p38乳沟caspase-dependent[紧随其后32,33]。

此外,PEDF在神经营养和保护作用。PEDF可以防止移植神经细胞凋亡的B细胞淋巴瘤2 (bcl - 2)的表达蛋白质,当氧化应激损伤发生在PDR (34,35]。PEDF的增加可以减少H2O2全身的破坏线粒体功能和细胞死亡的RPE细胞通过减少氧化应激(36]。此外,体内和体外研究显示,PEDF神经保护是通过稳定光感受器变性通过减少细胞内钙和抑制凋亡和炎症通路(37,38]。此外,PEDF可以区分新生血管性内皮细胞与正常血管内皮细胞通过Fas-FasL受体,实现选择性破坏异常的新血管建立在不损害正常的视网膜血管,并保护和维护健康的眼部组织的状态(12,34,35]。

因为它的抗血管新生和神经保护的好处,PEDF已经用于治疗眼部NV。调查人员评估virus-coded PEDF由intravitreous或视网膜下注入脉络膜的NV动物模型。他们发现过度的PEDF可以抑制新血管形成的脉络,提高感光细胞的生存39- - - - - -42]。白等人探讨PEGylated-PEDF阻止HUVECs和体内血管生成(43]。结果显示,聚乙二醇PEDF抑制HUVEC增殖、迁移和管形成剂量依赖性的方式,减少视网膜新生血管形成intravitreous注入oxygen-induced视网膜病变小鼠模型。然而,没有任何研究糖尿病模型。PEDF的不稳定和短半衰期限制其应用。近年来,nanoparticulate剂型已成为一个有前途的水溶性差的化合物,因为他们的眼部平台提供增强precorneal保留和改进渗透眼部组织(16]。此外,纳米医学都有自己的属性,和良好的物理化学特性(包括高表面体积比44]。通常用于纳米粒子改性挂钩。美国食品和药物管理局已批准使用的挂钩在药物修改好几年由于其低毒性、低成本、和溶解度增加45]。然而,目前还不能确定如果PEGylation的过程和形成PEDF-loaded纳米脂质改变PEDF的稳定和有毒的活动。

在当前的研究中,我们开发了NP-PEG-PEDF首次和评估high-glucose培养HUVECs的细胞毒性和抗血管新生的影响。我们的研究结果表明,NP-PEG-PEDF抑制HUVEC增殖,迁移,管形成,VEGF分泌和诱导HUVEC细胞凋亡在糖尿病条件下剂量依赖性的方式。

5。结论

总之,我们的研究发现,第一次PEDF-loaded聚乙二醇纳米粒子有效抑制NV高分子HUVECs体外。因为PEDF的神经营养和抗血管新生的影响,它可能是利用更有效的治疗治疗视网膜或脉络膜的将来NV。我们的数据表明,聚乙二醇PEDF交付系统可以是一个非常有前途的长期治疗PDR或AMD。NP-PEG-PEDF似乎是一种安全有效的药物输送系统,和它的使用可能是一个创新的方法为未来的治疗策略对病态血管渗透性增加参与一些眼部疾病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突有关的出版。

确认

科技项目支持的研究是广州(202102080085)和广东医学科学基金(B2021210)。