文摘
目标。糖尿病伤口炎症不足导致溃疡发展和最终截肢和残疾。我们先前的研究表明,myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)积累在炎症,促进慢性伤口愈合通过Kruppel-like因子4 (KLF4)的监管。在这项研究中,我们旨在调查MDSCs的潜在角色和KLF4糖尿病伤口愈合。方法。ob / ob鼠标压力溃疡(PU)模型被用来评估伤口愈合的过程。KLF4的表达水平和IL-17A被实时PCR、测量和人口MDSCs Th17细胞流式细胞仪测定。细胞因子的水平决定了免疫抑制试验。结果。KLF4糖尿病PU模型中的不足导致MDSCs积累减少,增加Th17细胞扩张,并显著延迟伤口愈合。相反,由apto KLF4激活- 253加速伤口愈合伴随着MDSC人口增加和减少Th17细胞的数量。MDSCs已被证明通过细胞因子调节Th17细胞分化,和我们在体外数据显示,高架KLF4表达MDSCs导致Th17细胞数量减少,因此,减少对Th17细胞分化的细胞因子水平不可或缺的。结论。我们的研究揭示了以前未报告的功能KLF4-regulated MDSCs糖尿病伤口愈合和确定apto - 253作为一个潜在的代理来提高压疮的愈合。
1。介绍
伤口愈合是一种多因素疾病,病理生理的重叠离散时间过程表现为四个阶段:止血,炎症扩散,装修1]。皮肤损伤后急性炎症激活不同的生长因子和细胞因子,促进随后的扩散阶段。然而,在糖尿病患者伤口通常会停滞在一个持续的炎症状态导致无法愈合溃疡。这些伤口引起的截肢和残疾是2型糖尿病最常见的并发症之一,而且,由于中国成人人口中大约10.9%的糖尿病患病率(2),潜在受害者的数量是巨大的。管理无法愈合伤口的炎症,因此,将为治疗的发展,提高患者的预后和生活质量。
Kruppel-like因子4 (KLF4)是一个转录因子维持表皮渗透屏障的关键(3),它被发现调解皮肤伤口愈合在小鼠毛囊干细胞(4]。Myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)是一个异构的骨骨髓来源的细胞表型可塑性,携带单核细胞标记(5),和促进伤口愈合6]。我们之前的研究表明,通过中介KLF4促进伤口的愈合的单核细胞的MDSC招聘和这些细胞成纤维细胞的分化7对糖尿病的影响),但KLF4-mediated MDSCs伤口仍然未知。
大量文献报道,炎症介质是高度相关的免疫改变慢性炎性疾病的起始与发展(8,9]。白介素- 17 (IL)介导炎症早期伤口修复阶段,可能会阻碍正常的治疗(10)就是明证IL-17抑制抗体的应用,能够延迟伤口关闭leptin-deficient ob / ob老鼠[11]。Th17细胞主要IL-17-producing细胞,细胞和细胞因子是高度多样化的人类自身免疫性疾病的发病机制,包括炎症性肠病、牛皮癣、和风湿性关节炎(12,13]。最近,几项研究已经确定了MDSCs和Th17细胞分化在不同疾病之间的联系上下文,如实验性自身免疫性脑脊髓炎和自身免疫性关节炎(14,15),而Th17中介的直接证据幽门螺旋杆菌全身的消化性溃疡链接IL-17通过抑制粘膜屏障功能受损的调节性T细胞(16]。因此,我们假设KLF4可能改善糖尿病伤口的修复调停Th17细胞分化MDSC-dependent方式。
在这份报告中,我们使用一个压力溃疡(PU)模型在ob / ob老鼠表明,糖尿病伤口修复受损与减少的表达KLF4 upregulation IL-17A。KLF4诱导物的应用可以显著加速伤口愈合就是明证CD11b的扩张+Gr-1+MDSCs Th17细胞和伴随的减少和IL-17A表达式。我们也观察到高效的Th17 MDSC抑制分化和IL-17A生产在体外,KLF4表达对这个过程至关重要。我们的数据突出的重要性KLF4-mediated MDSCs在促进糖尿病伤口修复在慢性炎症和表明针对KLF4潜在治疗糖尿病患者慢性伤口。
2。材料和方法
2.1。老鼠
WT C57BL / 6(野生型)和ob / ob老鼠从北京获得至关重要的河实验动物科技公司(中国,北京)。所有老鼠都是8 - 12周的年龄相同的男女比女性。所有涉及老鼠的实验和程序批准的机构动物保健和使用委员会华中科技大学。
2.2。伤口愈合治疗小鼠模型和apto - 253
我们的小鼠PU模型创造了如前所述17],伤口评估也如前所述执行(7]。引起的短暂,KLF4 apto - 253 (MCE化学品和设备)通过腹腔内注射治疗每隔一天在DMSO溶液的浓度为1毫克/公斤(Sigma-Aldrich),而车辆注射作为控制。注射开始前两天第I / R周期(天0),和老鼠牺牲在3天进一步检查。对于那些老鼠标记为伤口评估、apto - 253治疗持续8天。
2.3。RNA提取和实时PCR分析
试剂盒试剂(英杰公司)被用来准备总RNA根据制造商的指示。合成第一链cDNA和实时PCR进行如前所述[7]。表S1包含用于实时PCR引物序列实验。
2.4。流式细胞术分析
脾细胞和外周血单核细胞(PBMCs)准备如前所述7]。短暂,单细胞悬浮体从伤口站点创建组织是碎和1.0毫克/毫升胶原酶消化(σ)之前净化Percoll梯度(σ)。接下来,这种分离单个细胞治疗与fluorochrome-conjugated抗体特定的鼠标CD11b Ly6G, CD4 (eBioscience)。细胞内染色,fluorochrome-conjugated鼠标IL-17抗体(eBioscience)使用。FACSAria III (BD)和FlowJo (BD)被用于图像细胞和分析数据。
2.5。Coculture CD4的+T细胞和MDSCs
使用流式细胞仪Spleen-derived MDSCs被孤立。天真的CD4+T细胞是排序从单细胞淋巴结悬浮液WT老鼠和激活Dynabeads™鼠标T-Activator CD3 / CD28(热)。一批细胞培养在RPMI 1640媒体补充10%的边后卫,50μM 2-mercaptoethanol, 2毫米谷酰胺/ 1%青霉素和链霉素(Gibco)比1:2 (MDSC / T细胞)。apto - 253治疗,MDSCs孵化了apto - 253 (50 nM) 72 h和用PBS coculturing前洗净。DMSO作为控制。
2.6。免疫抑制化验
收集上清液coculturing 48 h后,血液和皮肤组织的样本准备ELISA (MDL)根据制造商的指示。细胞因子il - 1的水平βil - 6, TGF -β、IL-17A和干扰素-γ测定。
2.7。在体外Th17细胞分化
T细胞是收集和清洗coculturing 120 h后,和细胞内染色IL-17如前所述。Th17细胞未分化的T细胞的比例被流式细胞术进行评估。
2.8。统计分析
用SPSS 16.0软件进行统计分析。数据被表示为 和分析使用 - - - - - -测试(两群比较)和单向方差分析(多组比较)。一个值< 0.05被认为是显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。破坏伤口愈合的PU ob / ob小鼠与减少的表达KLF4 Upregulation IL-17A
我们首次发现可能的角色KLF4和IL-17A糖尿病伤口愈合。正如预期的那样,伤口关闭动力学明显延迟3天9的ob / ob小鼠与野生型相比(WT)老鼠(图1(一))。我们检查KLF4的表达和IL-17A ob / ob小鼠中存在3天,和大量减少KLF4表达式的外周血和颗粒组织皮肤的检测而IL-17A表达明显升高血液和皮肤(图1 (b))。我们进一步证实IL-17表达式使用流式细胞仪。受伤后第三天,增加IL-17表达ob / ob小鼠观察与WT (ob / ob vs。WT 在血液, ;ob / ob vs。WT 在皮肤上, )(图1 (c)与以前的报告(),它是一致的11]。
(一)
(b)
(c)
(d)
来确定KLF4缺乏减少的人口MDSCs在血液和伤口3天,我们进行了流式细胞术,结果证明相应减少MDSCs在这两个网站( 在血液和 在皮肤、图1 (d))。这些初步数据表明,KLF4、MDSCs IL-17A都参与了糖尿病伤口愈合的炎症阶段。
3.2。激活的KLF4 apto - 253改善糖尿病伤口愈合伴随着升高MDSC扩张和Th17人口下降
apto - 253是一个小分子,抑制原癌基因表达和调节抗癌活动通过感应KLF4-mediated肿瘤抑制(18]。如图2(一个)apto - 253的应用显著提高伤口愈合的发展从7天9 ob / ob PU模型。随后的存在分析显示基线KLF4表达ob / ob小鼠明显低于WT ( ),但apto - 253获救KLF4表达在这些老鼠( ,和ob / ob)(图2 (b)),符合动力学变化呈现在图2(一个)。与增加KLF4表达式apto - 253治疗组,CD11b的人群+Gr-1+相比,血液和皮肤伤口也增加MDSCs ob / ob PU老鼠没有apto - 253治疗( 在血液和 在皮肤、图2(c))。
(一)
(b)
Th17细胞是一个新发现,辅助T细胞的不同子集生成IL-17 [10]。报告证明了关键作用的MDSCs Th17细胞分化[14,15,19- - - - - -21]。因此,我们能够观察到的数量Th17细胞在血液和皮肤伤口,发现apto - 253治疗抑制Th17细胞的扩张在两个网站( 在血液和 在皮肤、图2(d))。apto - 253持续减少IL-17A和干扰素的表达γ在血液和伤口,这表明炎症状态是改进(图2(e))。这些发现表明,KLF4 MDSCs的监管可能会下调Th17细胞分化和炎症在糖尿病伤口愈合。
据报道,KLF4可以促进Th17细胞分化,直接绑定到IL-17表达式il-17a启动子(22,23),我们观察到的效果相反。我们假定KLF4-regulated Th17细胞分化MDSC-dependent地远比直接KLF4对T细胞的影响。从细胞因子il - 1β、il - 6和TGF -β扮演重要角色在MDSC-driven Th17细胞分化[14用ELISA),我们评估这些因素。il - 1的浓度β、il - 6和TGF -β在血液和伤口都显著提高反应压力溃疡而激活KLF4显著抑制这些细胞因子的表达(图2(e))。
3.3。MDSCs调节Th17细胞分化的ob / ob压力溃疡模型
的在活的有机体内数据显示MDSC Th17细胞分化依赖于细胞因子调节发炎网站内的环境。进一步确定MDSCs调制Th17细胞分化的方式,我们培养WT天真CD4排序+T细胞与spleen-derived MDSCs从不同的群体在体外。在coculture 48 h后,上层清液收集和分析使用ELISA。类似的结果在活的有机体内,MDSCs ob / ob PU组不仅有效地增强IL-17A和干扰素-γ从T细胞也表达内源性il - 1的表达β、il - 6和TGF -β分泌MDSCs本身。这是逆转时,老鼠接受了apto - 253治疗(图3(一个))。中存在的分析还表明,apto - 253干预显著提高KLF4表达MDSCs ob / ob老鼠( ,图3 (b))。在120 h coculture之后,流仪分析T细胞收集。大幅提高的百分比Th17细胞在CD4细胞被发现+细胞培养的MDSCs ob / ob + PU组,观察和减少人口Th17细胞在upregulation KLF4(图3 (c))。这些观测结果符合细胞因子表达的变化如图3(一个)。
(一)
(b)
(c)
3.4。MDSC-Regulated Th17细胞分化是由KLF4 ob / ob老鼠
我们下一个调查是否MDSC Th17细胞分化调节依赖KLF4 MDSCs表达式。MDSCs排序从ob / ob小鼠和天真WT CD4细胞培养+细胞,在实验组,MDSCs服用apto coculture之前72 - 253 h。coculture 48 h后,我们检查了上层清液和MDSCs使用ELISA和存在,分别。正如所料,IL-17A和干扰素的表达γTh17分化所需的主要细胞因子(il - 1β、il - 6和TGF -β)都是抑制在实验组(图4(一)),同时增加KLF4表达式( ,图4 (b))。流式细胞术当时执行检测Th17细胞的百分比在120 h coculture之后。结果显示,MDSCs ob / ob老鼠有效增强Th17细胞的分化( ),但这是显著降低当KLF4表达式被apto调节- 253 ( ,图4 (c)),这表明KLF4表达式在MDSCs Th17细胞分化的关键。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
我们先前的研究显示,通过MDSCs [KLF4调和皮肤伤口愈合7),但目前没有研究描绘KLF4在糖尿病伤口修复的影响。在本报告中,使用一个ob / ob鼠标压力溃疡模型,我们表明,KLF4-regulated MDSCs促进糖尿病伤口愈合通过抑制Th17细胞分化和随后IL-17A表达式。新兴的证据表明,代理人针对炎性细胞因子/受体可以显著改善自身免疫性疾病的发病和进展24,25]。的确,IL-17抑制剂如secukinumab和ixekizumab已经测试并显示安全用于强直性脊柱炎和银屑病(26,27]。然而,广泛的伤口愈合等抑制剂的临床试验尚未进行。与此同时,目前的研究表明,apto - 253,商业化KLF4活化剂,也能够促进压疮的愈合,使KLF4 upregulation伤口愈合应用程序的一个有希望的候选人。
基底的KLF4 ob / ob老鼠低于WT老鼠,而且,即使压力溃疡的刺激,KLF4表达ob / ob老鼠相比仍然是减少(数字1 (b)和2 (b))。然而,伤口关闭被激活救起KLF4 ob / ob老鼠(图2(一个)),表明KLF4糖尿病伤口愈合中扮演关键角色。无法愈合的伤口有关糖尿病的特点是长期炎症阶段,我们发现IL-17A表达明显升高ob / ob PU模型(数据1 (b)和1 (d)),但抑制由于upregulation KLF4(图2(d))。据报道,尽管KLF4能够直接绑定的启动子Il-17a并积极调节其表达(22,23),我们假设,在糖尿病伤口愈合,KLF4负调节IL-17A在一个Il-17a独立的时尚。
MDSC / Th17细胞相互作用不同的微环境,主要由细胞因子而不是直接细胞接触(21]。在伤口愈合,MDSCs il - 6的主要来源,il - 1β,TGF -β,Th17细胞分化[不可或缺的细胞因子14,21]。ELISA结果从而证明增加基底这些细胞因子的水平,加上IL-17A和干扰素-γ,很可能是东方ob / ob小鼠T细胞极化的增加和炎症。有趣的是,apto - 253迅速减少炎性细胞因子水平,与此同时减少扩张Th17细胞(数字2(d)和2(e)),所有这些都导致了观察改善伤口愈合(图2(一个))。然而,增加招聘MDSCs ob / ob小鼠的血液和伤口后apto - 253引发的担忧是,炎症抑制主要归因于KLF4可能是由于免疫抑制的性质MDSCs独立Th17人口的影响。确定的相对重要性MDSC-regulated Th17分化,然后执行coculturing MDSCs和幼稚T细胞在体外。MDSCs提取ob / ob PU小鼠apto - 253治疗显示KLF4表达式的大幅度增加,以及伴随的CD4 Th17人口的减少也观察到+T细胞相比cocultured车辆控制(数字3 (b)和3 (c))。上层清液中细胞因子的变化是类似数据在活的有机体内,支持认为KLF4调节Th17分化MDSC-dependent地(图3(一个))。
的基石作用KLF4 MDSC-Th17交互在糖尿病伤口愈合被培养CD4进一步证实了+T细胞与ob / ob MDSCs使用apto - 253。高架KLF4表达式显然与Th17细胞分化的减毒效率有关,和ELISA数据表明细胞因子il - 1β、il - 6和干扰素-γ也降低(图4)。值得注意的是,TGF -有显著变化β和IL-17A。易et al。14)报道,il - 1β是一个主要的中介MDSC-facilitated Th17分化而il - 6和TGF -β调解的效率。因此,任何il - 1β缺陷可能更容易妥协Th17细胞分化。至于IL-17A,尽管它降低apto - 253治疗后没有统计学意义,预防组接近空白的水平控制,表明upregulation KLF4仍然减毒IL-17A表达式通过抑制Th17分化。
总的来说,当前的研究不仅揭示了必要性的KLF4 MDSC-regulated Th17分化的背景下糖尿病伤口愈合也指出KLF4-based干预的必要性,如KLF4激活apto - 253治疗糖尿病PU患者。进一步的调查将决定的分子机制在MDSCs KLF4介导T细胞分化时使用特定的转基因小鼠详细药理apto动力学- 253将详细糖尿病伤口愈合。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(8160080608)。
补充材料
为rt - pcr引物序列见表S1。(补充材料)