文摘
背景。基因突变在人类KLF11可能会导致成年糖尿病的发展年轻的7 (MODY7)。这发生由于胰腺的胰岛素合成受损。到目前为止,小说的临床和功能特性KLF11突变c。1061G > T have not yet been reported.方法。Whole-exon测序被用来屏幕的渊源者和家庭成员的临床怀疑KLF11变体。荧光素酶报告分析被用来调查是否KLF11变体结合胰岛素启动子。实时PCR,免疫印迹和分子生物学胰岛素分泌(GSIS)分析是用来分析KLF11变体调节胰岛素的表达和β细胞胰岛素分泌活动。自由泳自由泳H (Abbott糖尿病保健有限公司)被用来动态监控渊源者每天的血糖水平。结果。整个外显子突变筛选确定了杂合的基因KLF11(c.1061G > T)变体渊源者,她的母亲,和她的外祖父。细胞荧光素酶化验使用野生型和突变体转基因记者透露KLF11(c.1061G > T)变体已经受损的胰岛素启动子调控活动。此外,这种变异被发现损害胰岛素表达和胰腺β细胞的胰岛素分泌。渊源者最好没有主食摄入量(血糖控制 )。结论。在此,第一次,我们报告一个小说KLF11(c.1061G > T)与MODY7单基因突变相关。这个变体有受损的胰岛素启动子调控活动和损害胰腺β细胞表达和分泌胰岛素。因此,用口服抗糖尿病的药物和膳食干预可能受益渊源者。
1。介绍
KLF11在人类首次克隆囊性纤维化胰腺癌细胞系乌鲁蒂亚等人于1998年(1]。KLF11pancreas-enriched转录因子,引起重大关注人员由于其作为负调节的外分泌细胞生长在体外和在活的有机体内(2]。以前的研究已经表明KLF11参与糖尿病的病理生理过程开发(3- - - - - -5]。此外,突变在人类KLF11可能会导致成年糖尿病的发展年轻的7 (MODY7)。内弗等人首先研究MODY7 [2]。2005年,基因筛查在两个家族历史的渊源者早期2型糖尿病发病显示一个渊源者有2型糖尿病,而另一个降低了葡萄糖耐量(2]。这是由于胰腺的胰岛素合成的障碍。遗传分析KLF11显示两个罕见变异(Ala347Ser和Thr220Met)在家庭隔离早期2型糖尿病发病和显著影响其转录活性(2]。
2019年,一本小说KLF11变体(p.His418Gln)报告;这与早期儿童1 b型糖尿病(6]。因此,KLF11是一个有效的候选基因决定早发性和2型糖尿病的遗传倾向,这种基因缺陷可能导致早发性或多基因2型糖尿病(7]。除了KLF11,可能还有其他未知的因素,需要进一步探索。然而,KLF11,由于其作为MODY基因,是一个潜在的成人糖尿病的治疗目标。
在这项研究中,我们报告一个小说KLF11变体与MODY7和探索其临床特征、可能的发病机制,优化治疗和功能特性。此外,我们还调查了是否饮食干预糖尿病患者可能受益KLF11突变。
2。材料和方法
2.1。病人
2.1.1。渊源者
渊源者(III-4,图1)是一个23岁的女性主题,与正常发展和适度的营养状况。2018年9月2日,然而,一个体格检查,发现渊源者的空腹血糖水平是13.9更易/ L。立即进入当地医院之前,渊源者的空腹血糖水平是10.36更易/ L,和糖化血红蛋白水平为11.5%。由于血糖水平较高,医生对她与胰岛素和口服降糖药物。一个月后,渊源者的逐渐调整治疗后血糖控制恶化saxagliptin(2.5毫克/天),voglibose(0.6毫克/天),这是紧随其后的是进入齐鲁医院进一步治疗。病人报告没有烦渴、多尿症,体重减轻,或视力模糊,没有麻木的四肢,疲劳或不适。
(一)
(b)
所有程序中执行这项研究涉及人类受试者按照道德标准机构和/或国家研究委员会1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案或类似的道德标准。本研究通过山东大学齐鲁医院的伦理委员会(不:kyll - 2020 (KS) -069)。所有的科目包含在我们的研究自愿签署知情同意书,由伦理审查委员会。
2.1.2。家族病史
没有糖尿病的父系家族的历史,而母亲之间有一个糖尿病患者的亲属(外祖父)。
2.1.3。体格检查
渊源者的高度是168.5厘米;她体重54公斤,身体质量指数(BMI)为19.02公斤/米2。此外,渊源者并没有表现出任何明显异常的心脏,肺,或腹部,没有水肿的下肢。
2.1.4。治疗方法
由于不满意控制空腹和餐后的血糖水平,治疗改为胰岛素注射(睡前10单位),口服saxagliptin(2.5毫克;一次/天),口服voglibose(0.2毫克;三次/天)。
2.1.5节讨论。临床资料收集
这个主题的家庭提供知情同意,并在2018年9月。我们收集全面的临床数据,比如身体检查的结果,病史、血统和相关代谢产品的水平。
2.2。突变分析
外周血收集从四个家庭成员(渊源者之后,她的父母,她的外祖父)。EDTA抗凝和E.Z.N.A.®血液DNA迷你包(ωBio-Tek D3392 Inc .)被用来从外周血白细胞中提取基因组DNA,并送往北京总基因生物技术有限公司有限公司whole-exome测序。
2.3。在硅片的KLF11变异分析
使用phyre2服务器,野生型的三维(3 d)结构KLF11 (WT-KLF11)及其变种(Cys354Phe-KLF11)预测使用线程的方法,全面分析了最终模型的详细比较。WT-KLF11和Cys354Phe-KLF11 3 d结构模型建立了参考模型(8]。使用节省v5.0服务器结构进行可视化。
2.4。质粒信息
质粒向量编码pGL3-basic-INS胰岛素启动子序列,由伯纳黛特首次报道Neve et al。2),是由Biosune合成生物技术(上海)有限公司,有限公司pCDNA3.1-WT-KLF11质粒是购自Biosune生物技术(上海)有限公司,有限公司使用QuikChange定点诱变的pCDNA3.1-C354F-KLF11质粒构建工具(安捷伦科技公司,圣克拉拉,CA),根据制造商的指示。所有结构都验证了测序ABI 3730 xl音序器。构建完全克隆测序和用作模板设计。
2.5。西方墨点法
人类胚胎肾HEK 293细胞与质粒编码Cys354Phe-KLF11 cotransfected WT-KLF11并培养如前所述[9]。在48 h posttransfection,细胞收获并受钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。西方墨点法进行了使用鼠标单克隆anti-KLF11主要抗体(Origene,猫:TA811001s, 1: 1000)和辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g多克隆二级抗体(中山金桥,猫:zb - 2305、1: 10000)。蛋白质乐队使用化学发光检测设备(微孔、钙、美国、WBKLS0050)和使用化学发光成像系统成像(上海Qinxiang科学仪器有限公司)。
2.6。荧光素酶报告实验
HEK 293个细胞被播种在96 - 200年文化板块(10000细胞/μL培养基)和培养24小时。然后,每个单元格组与pRL-TK质粒分别转染,pGL3-basic-INS,和pCDNA3.1-WT-KLF11 pCDNA3.1-C354F-KLF11使用LipofectamineTM 2000(表达载体,猫:11668 - 027),根据制造商的指示。在48 h posttransfection dual-luciferase记者分析了用荧光素酶报告实验设备(Promega E1910)。
2.7。胰岛素分泌和胰岛素含量测定
INS1细胞与质粒编码Cys354Phe-KLF11 cotransfected WT-KLF11探讨胰岛素分泌和胰岛素内容,如前所述[10]。胰岛素分泌决心使用静态条件下孵化方法5%的有限公司2和95%的空气在37°C,如前所述[11,12]。细胞被播种密度 细胞24-well盘子和1毫升的杜尔贝科是改造过的鹰培养基培养(DMEM, 25 L更易与葡萄糖)。48 h后,介质被移除,细胞被洗一次HEPES-balanced克雷布斯铃声碳酸氢盐缓冲(119更易/ L氯化钠,4.74 L更易与氯化钾,2.54 L CaC1更易2,7.4 L MgC1更易2,1.19 L KHPO更易4,25更易/ L NaHCO3,10更易/ L玫瑰,pH值7.4)含0.5%牛血清白蛋白(BSA)没有葡萄糖。接下来,细胞在HEPES-balanced preincubated Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲0.5% BSA和5更易与L葡萄糖为30分钟。洗两次后HEPES-balanced Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲,INS1细胞孵化在HEPES-balanced Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲补充0.5% BSA和不同浓度的葡萄糖。媒体被收集和化验的免疫反应性的胰岛素通过酶联免疫吸附试验(ELISA),用鼠标胰岛素作为标准。一卷200μL 1 mol / L氢氧化钠添加到每个好溶解细胞为了确定细胞蛋白质内容使用ELISA测定工具包(微孔,EZRMI-13 K)。测量细胞胰岛素的内容,1毫升的酸乙醇添加到井,然后用压敏膜密封。提取收集24 h后孵化在4°C,然后由ELISA稀释和化验。
2.8。实时聚合酶链反应
INS1细胞被孤立使用试剂盒试剂(豆类,T9108)。生成的互补使用HiScript Q RT SuperMix qPCR(豆类,DRR047S)和实时PCR进行了化验LC480光周期计使用以下引物序列:Ins1底漆,GAAGAGGCCATCAAGCAGATCACT;ATTGTTCCACAATGCCACGCT Ins1反向引物;GCCTTCCGTGTTCCTACC GAPDH正向引物;,GCCTGCTTCACCACCTTC GAPDH反向引物。相对基因表达决心使用比较方法(2- - - - - -△△CT)。GAPDH是作为内部标准。
2.9。统计分析
所有的数据呈现的 (SDs)或 (sem)。通过使用双尾进行统计比较,学生的配对 - - - - - -只涉及两组测试数据集,或者通过使用单向方差分析的数据包括两组以上。然后,Dunnett和Bonferroni事后测试进行多重比较。所有测试使用GraphPad棱镜进行8。每一个独立实验至少重复三次。代表实验结果数据所示。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。临床表现
作为渊源者首次在23岁时被诊断出患有糖尿病和胰岛素和口服降糖药物,它对确定哪种类型的糖尿病的渊源者是非常重要的。三周的治疗后,6.6%的糖化血红蛋白水平。因此,该治疗方案是维持一年半,和病人的血糖水平控制和稳定。
3.2。实验室数据
胰岛自身抗体筛查发现的缺失谷氨酸脱羧酶(GAD),酪氨酸磷酸酶抗体(IA-1ABs) anti-insulin细胞抗体(ICA-IgG),胰岛素自身抗体(IAAs)β-cell-specific锌转运体8。当渊源者的血糖水平正常,稳定,口服葡萄糖耐量试验(OGTT)与胰岛素和c -肽释放试验同时进行评估胰岛功能(表1)。的外祖父渊源者是一个糖尿病患者,我们进行基因检测的渊源者。因此,我们发现了一个杂合的变体KLF11(c。1061G > T, p.Cys354Phe) via whole-exome sequencing. Moreover, the proband exhibited no abnormalities in the thyroid function, hepatic and renal function, blood lipid profile, or urine microalbumin.
3.3。临床特点的家庭成员和他们的基因检测的结果
的外祖父渊源者(我2)是在66年被诊断出患有2型糖尿病的年龄和口服降糖药物治疗。他的血,糖化血红蛋白浓度为6.0%(表在他最后的考试2)。渊源者的父母从未被诊断为糖尿病,但母亲(II-5)发现空腹血糖水平5.8更易/ L的体检。基因检测MODY促进正确的诊断,从而使治疗优化和允许家庭成员无症状的监测。因此,基因检测进行了父母和外公的渊源者。正如所料,杂合的变体KLF11(c。1061G > T, p.Cys354Phe) was also identified in the mother and maternal grandfather (Figure1(一))。为了确认是否母亲是一个无症状的成员,我们执行一个OGTT同时,胰岛素和c -肽释放试验(表1)。我们的研究结果表明,渊源者的母亲可以诊断为糖耐量受损,这意味着她是前驱糖尿病的,将来可能患糖尿病。
有相同的突变引起的临床表型的差异即使在同一个家庭,这些结果可能表明KLF11突变与不完全外显率相关联。总之,我们的结果表明,KLF11(c.1061G > T)在这个家庭变体与糖尿病有关。
3.4。测序结果和生化特性的KLF11 (c.1061G > T)变异
人类的保护域KLF11由一个细胞外区域,由三个转录阻遏域(TRD)和锌指域。KLF11,作为Sp1 / KLF家族的一员,一直预测结合GC-rich或CACC序列。Cys354Phe-KLF11变体是映射到一种新型疏水glycine-glutamine-proline-rich域被观察到在相应地区的飞直接同源,cabut(图2(一个))。之前的KLF11 Cys354Phe变体也映射到特征转录监管域3 (TRD3)。多个氨基酸序列比对使用Clustal W表明Cys354Phe-KLF11守恒跨各种物种(图2 (b))。预测突变这埋网站导致接触表面的蛋白质,从而改变蛋白质的活动。此外,由于这个网站的接触表面的蛋白质突变后,它可能位于一个更大的转录屏蔽域和影响一些转录功能(图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.5。的功能描述KLF11 (c.1061G > T)变异
之间的联系KLF11(c.1061G > T)变体和公认的糖尿病病理生理过程评估。的KLF11(c.1061G > T)基因变异不影响蛋白表达水平(数字3(一个)和3 (b))。荧光素酶化验的结果表明KLF11发挥作用,胰岛素基因的转录调控。胰岛素诱导的启动子活动KLF11(c.1061G > T)引起的变体被观察到低于WT-KLF11(图3 (c))。此外,观察胰岛素基因的激活突变的影响KLF11。进一步探索的作用KLF11Cys354Phe变体在β细胞功能,我们过表达WT和变体KLF11在INS1细胞(使用pcDNA3.1消极控制和质粒KLF11(WT和Cys354Phe)质粒)和发现KLF11Cys354Phe变异减少胰岛素转录和胰岛素分泌减少甚至与高葡萄糖刺激后(数字3 (d)和3 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。探索KLF11 (c.1061G > T)基因治疗
渊源者受到控制的血糖水平和胰岛素和口服降糖药物治疗后一年半(表2)。由于在学校使用胰岛素的不便,药物调整口服格列齐特缓释片剂(30毫克/天)结合饮食控制在2020年6月。我们发现一起控制主食的摄入量,这治疗导致更好的血糖控制在为期两周的主食审判。没有显著差异之间的能量摄入两周( ,表3)。然而,每日平均血糖有显著差异,空腹血糖,血糖的量和2 h两周( ,表3)。没有统计不同血糖的平均振幅远足(法师)之间的两个星期,代表血糖波动。根据动态血糖参数,饮食干预可能是有益的渊源者,每天帮助控制血糖水平(数字4(一)和4 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
们考虑的诊断是富有挑战性的,由于其相对较低的患病率和重叠在演讲和MODY患者之间的临床特征和与其他糖尿病亚型(13]。MODY特点是常染色体显性遗传的多基因家族糖尿病史,25岁前发病,没有胰腺自身免疫和胰岛素抵抗14]。在这项研究中,我们发现了一个KLF11变体在三人属于一个家庭通过whole-exome测序。其中,两个人(包括一个年轻的成年人)开发的糖尿病。渊源者表现出高血糖在23岁,被发现为胰岛细胞自身抗体阴性。外公开发了2型糖尿病,享年66岁。母亲被认为是糖尿病,但通过OGTT延迟胰岛素分泌和胰岛功能测试,这是糖尿病的特点之一。父亲被认为是健康的。事实上,严格遵守这些准则所带来的高特异性,但低敏感性识别MODY主题,超过一半的患者在欧洲国家不符合这些突变鉴定确诊临床推荐的标准。因此,坚持当前的指导方针将继续导致很大一部分患者的误诊MODY [15,16]。此外,通过扩展MODY诊断检测超出当前的指导方针,欧文et al。17)确定MODY科目不是MODY特点的临床特征,包括没有糖尿病的家族史。因此,诊断渊源者们考虑的是明确的,即使没有一个典型的家族病史。
众所周知,糖尿病是由于遗传和环境危险因素的结合。其中,表观遗传学在调解中起着至关重要的角色之间的交互环境和遗传因素。表观遗传学也有代际影响,一些从祖父母extragene信息会传递给孙子,和标志着孙子将烧毁在显示相应的特征。这些因素可能导致的早期发病糖尿病。
基因研究发现错义突变KLF11基因导致迟发性糖尿病的发展(7]。这是由于基因突变影响的事实KLF11绑定膀胱蛋白基因的启动子和激活。此外,在cis激活突变后的元素KLF11被发现抑制KLF11全身胰岛素基因的激活,从而减少体内胰岛素的生物合成。KLF11蛋白锌指转录因子,结合SP1-like序列的启动子区域ε- - -γ球蛋白基因(18]。发现了三个成绩单变体编码两种不同亚型KLF11在胰腺mRNA和蛋白表达β肽(10]。这个绑定增加其压制和削弱胰岛素启动子的激活(19]。此外,这种基因缺陷导致MODY7。此外,内弗等人确定了两个罕见的KLF11变异(Ala347Ser和Thr220Met)与2型糖尿病发病早期家庭,这被证明能显著影响的转录活动KLF11。此外,他们发现了一个频繁的多态Gln62Arg变异与2型糖尿病相关,明显在北欧洲人(2]。Ushijima等人发现了一个杂合的KLF11(p.His418Gln)变体在家庭与儿童早期临床诊断1 b型糖尿病(6]。这两种糖尿病危害研究显示损失的影响KLF11蛋白质的功能。
多个氨基酸序列比对表明,KLF11 Cys354Phe (C354F)保存在不同的物种。此外,细胞的转染KLF11wt和突变质粒结构表现出无统计上显著差异(数据没有显示)。此外,没有明显的差异之间的蛋白质表达水平KLF11 -WT - - -KLF11-C354F-transfected细胞。值得注意的是,KLF11(c.1061G > T)变异诱导胰岛素启动子活性低于KLF11wt。这表明,突变的影响KLF11全身胰岛素基因的激活。据预测,突变在这埋网站可能导致接触表面的蛋白质,从而改变蛋白质的活动(20.,21]。此外,由于这个网站的接触表面的蛋白质突变后,有可能该网站位于一个更大的转录阻塞域,从而影响胰岛素的转录功能(22]。进一步表明,细胞功能研究KLF11Cys354Phe转录变异减少胰岛素和胰岛素分泌减少甚至刺激高葡萄糖。此外,失调KLF11细胞的胰岛素含量的影响。
儿童和青少年患糖尿病最初可能与胰岛素治疗,甚至这种方案通常持续后血糖的稳定。然而,在一些患者们可以控制高血糖处方口服抗糖尿病的药物(如磺酰脲类药物),不使用胰岛素(23]。事实上,大多数的标准治疗方法尚未建立糖尿病亚型由于病例数低,缺乏数据证实治疗功效。政府的胰岛素治疗的初始阶段MODY7被描述在先前的研究6),这是符合治疗收到的渊源者在我们的研究中。在这种情况下,使用胰岛素(使用和存储缺陷)也导致不便渊源者。此外,与磺酰脲类药物治疗后,当摄入的总能量保持稳定,减少主食的摄入量,我们发现渊源者的血糖水平是更好的控制。因此,口服抗糖尿病的药物和饮食干预糖尿病患者可能受益KLF11突变和帮助他们控制自己每天的血糖水平。以下方案和健康的生活方式是非常重要的因素在疾病控制2型糖尿病患者。
5。结论
总之,在这项研究中,我们成功地确定了KLF11通过whole-exome测序(c.1061G > T)变异,导致MODY7显示在一个23岁的女性。这项研究首次证明KLF11(c.1061G > T)变异参与MODY7的发病机理。表观遗传因素可能导致的早期发病糖尿病。此外,我们表明,口服抗糖尿病的药物和饮食管理的渊源者干预是有益的,并帮助控制每天的血糖水平。我们的研究也有一些局限性。需要进一步的研究,如动物实验,解释之间的关系改变了KLF11函数和糖尿病发病和严重程度。此外,新的饮食干预和治疗方法需要为MODY开发。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
XGH和LC是参与研究设计。连续波、RXZ和JW参与这项研究的行为。初稿SYJ收集的准备是,QJR, JW。SYJ QJR起草和修订后的手稿。茎的太阳和瞿论的贡献同样这项工作。
确认
这项工作是支持的研究生教育创新计划Cheeloo医学院,山东大学开出信用证(批准号2020日元),中国国家自然科学基金(批准号81670706开出信用证X.G.H.,批准号81770818开出信用证,批准号81873632开出信用证,批准号82070800,Grant No. 81770818 to L.C.), the National Key R&D Program of China (Grant No. 2016YFC0901204 to L.C., Grant No. 2018YFC1311801 to L.C.), and the Taishan Scholars Project (Grant No. ts201712089 to L.C.).