文摘

背景。循环内皮祖细胞(epc)的血管修复中扮演很重要的角色。然而,high-glucose的机制——(HG)诱导脐带血EPC衰老和B2受体的作用(B2R)仍然未知。方法。脐带血样本26妊娠期糖尿病(GDM)患者和26名健康对照组样本收集。B2R循环CD34表达+脐带血单核细胞的细胞(CBMCs)使用流式细胞仪检测。8-isoprostaglandin F2的血浆浓度α(8-iso-PGF2α)和一氧化氮(NO)是测量。内皮祖细胞治疗与HG(40毫米)单独或与缓激肽(BK)(1纳米)。B2R和以挪士小干扰rna (siRNAs)和PI3K拮抗剂LY294002被添加到块B2R,分别以挪士,PI3K。确定衰老细胞的数量,senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加)染色。水平的线粒体活性氧(ROS)在内皮祖细胞被Mito-Sox染色评估。细胞生存能力评估细胞计数Kit-8 CCK-8化验。线粒体DNA (mtDNA)拷贝数和相对端粒的长度被检测到真正的time-PCR。人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的分布在细胞核,胞质,线粒体的内皮祖细胞被免疫荧光检测。p21的表达B2R、p16、p53, P-Ser473年AKT、T-AKT以挪士,hTERT证明了免疫印迹。结果。B2R循环CD34表达+细胞CBMCs明显降低GDM患者与健康对照组相比。此外,B2R循环CD34表达+与等离子体8-iso-PGF2 CBMCs细胞呈负相关α浓度与血浆没有水平呈正相关。BK治疗减少了EPC衰老和ROS生成。此外,BK细胞治疗HG-exposed导致P-Ser升高473年一种蛋白激酶和以挪士蛋白表达与HG单独治疗。BK减少HG-induced衰老内皮祖细胞hTERT易位。B2R核,以挪士siRNA和拮抗剂的PI3K信号通路阻塞BK的保护作用。结论。通过PI3K-AKT-eNOS BK,信号通路,减少hTERT易位,端粒的相对长度增加,同时减少mtDNA拷贝数,最后防止EPC汞引起的衰老。

1。介绍

内皮祖细胞(epc)似乎扮演着一个关键角色,内皮的修复和改善新血管形成1- - - - - -3]。过早衰老的内皮祖细胞与妊娠期糖尿病(GDM)可以削弱其功能(4]。老龄化是一个普遍的、进步的和不可逆转的组织干细胞功能下降(5]。此外,糖尿病一直与减少循环内皮祖细胞(6- - - - - -9]。

一氧化氮(NO)被描述减少内皮细胞衰老,而没有封锁一个不利影响,影响与端粒DNA合成的端粒酶(10,11]。然而,尽管高葡萄糖(HG)可以通过NO-related通路诱导细胞衰老(12),HG诱发脐带血EPC衰老的机制尚不清楚。

组织kallikrein-kinin系统(kk)触发各种有益的效应,如抗高血压和抗氧化作用[13]。激肽有多种功能,包括有效endothelium-mediated血管扩张性和抗血栓形成的属性。先前的研究表明,B2受体(B2R)激活可能参与循环CD34的招聘+细胞与新血管形成潜在的(14]。我们之前的研究表明,外生缓激肽(BK)显著地抑制H2O2全身的EPC衰老通过B2R / AKT RB和B2R /表皮生长因子受体/ RB信号通路(15]。此外,BK保护内皮细胞从H2O2全身衰老通过B2R-mediated没有释放16]。然而,汉堡王是否能保护内皮祖细胞从HG-induced衰老仍不清楚。

本研究旨在探讨BK / B2R轴的具体调控机制在预防EPC衰老引起的汞柱。

2。材料和方法

2.1。病人组

总的来看,我们登记26 GDM病例和26 non-GDM控制分析的样本。

这项研究排除了怀孕的雌性与某些风险因素,例如,女性体外受精或多胎妊娠,遗传性代谢病,孕前的糖尿病或慢性高血压。GDM诊断是根据世卫组织标准。有以下的女性被认为是GDM: 1 h 50克葡萄糖的挑战 更易与L,空腹血糖7.0≥更易与L, 1 h口服葡萄糖耐量试验(OGTT) 75克≥10.0更易/ L,或2 h 更易与L。批准的工作是东南大学附属中大医院医学伦理委员会(2018年批准ID: zdsyll069-y01)。所有参与者提供书面知情同意。

2.2。测定B2R

B2R在CD34的表达+循环祖人口脐带血单核细胞(CBMCs)是由流式细胞术,如我们之前所述的研究(15]。

2.3。测量等离子体8-Iso-PGF2α水平,没有水平

的8-iso-PGF2α使用一个8-iso-PGF2浓度进行了分析α酶联免疫试剂盒(CUSABIO,中国)。没有生产等离子决心用一个没有试验设备(南京建成生物工程研究所,中国)。

2.4。评估HG-Induced衰老和线粒体ROS

EGM-2 MV中被认为是euglycaemic基底5毫米葡萄糖的浓度。内皮祖细胞治疗与40毫米葡萄糖(美国σ)单独或1 nM BK(美国σ)(考虑到提前30分钟)+ 40毫米葡萄糖5% FBS-containing媒介。甘露醇作为渗透压控制。内皮祖细胞的衰老是由senescence-associated决定β牛乳糖(SA -β加)染色(BioVision)。SA -β-gal-positive细胞计算并显示在细胞总数的百分比。内皮祖细胞与Mito-Sox孵化(表达载体)。荧光是评估内皮祖细胞的荧光显微镜(Axio观察者A1,德国)。获得的图像转换成二值图像量化使用ImageJ平均荧光强度。EPC人口生存能力检测到CCK-8工具包(Dojindo实验室)。总没有发现生产培养基使用分析工具(南京建成生物工程研究所,中国)。

2.5。实时定量逆转录PCR

使用试剂盒的细胞细胞溶解试剂,其次是互补脱氧核糖核酸的合成。p53、p21和p16 mRNA水平衡量实时存在,这是执行7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)使用SYBR绿色PCR试剂盒(热费希尔科学)根据指导手册。引物所示表S1。p53、p21和p16 mRNA表达规范化β肌动蛋白mRNA和计算为2−∆∆Ct。

2.6。基因沉默的B2R并使用小抑制RNA以挪士

B2R siRNA沉默协议和小干扰rna是按照制造商的指示以挪士如前所述[15]。小干扰rna抑制特定B2R和效率以挪士被西方墨点法进行验证。

2.7。测定B2R siRNA的影响,以挪士siRNA, PI3K信号通路阻断剂的BK抑制HG-Induced衰老和线粒体ROS

PI3K拮抗剂LY294002 (10μ米)BK治疗前增加了5分钟。B2R siRNA转染和以挪士siRNA BK治疗前进行如上所述。内皮祖细胞与HG单独或与孵化1 nM BK如上所述。甘露醇作为渗透压控制。染色与SA -β加和Mito-Sox如上所述。

2.8。免疫印迹分析

蛋白质提取的协议是按照制造商的指示(Beyotime)。蛋白质浓度测定由BCA试剂盒(Beyotime)。蛋白质样本加载并隔开SDS-polyacrylamide凝胶电泳前转移到PVDF膜。在TBST 5% BSA阻塞后,一夜之间,膜被孵化在4°C主要抗体一种蛋白激酶(CST 1: 2000年,美国),P-Ser473年中科AKT(1: 2000年,美国),以挪士(CST 1: 1000年,美国),p21 (Abcam 1: 1000年,英国),p16 (Abcam 1: 1000年,英国),B2R (Abcam 1: 1000年,英国),叔(Abcam 1: 1000年,英国),p53(1: 1000年,圣克鲁斯,美国),和β肌动蛋白(Abcam 1: 1000年,英国)。随后孵化了PVDF膜荧光二次抗体(ZSGB 1: 10000年,中国)。最后,乐队是SuperSignal化学发光底物(微孔,美国)。

2.9。测量的线粒体DNA (mtDNA)内容

总DNA提取使用QIAamp DNA隔离设备(试剂盒、希尔登,德国)。mtDNA确定内容如前所述[17]。

2.10。实时PCR检测的相对端粒的长度

端粒在不同条件下的相对长度测量通过定量PCR使用Cawthon[描述的方法18]。Ct值的比值的端粒基因的36 b4(参考单拷贝基因)指定每个样本的T / S比值,用来反映的相对端粒的长度。

2.11。免疫荧光分析hTERT易位

内皮祖细胞种植在盖玻片12-well盘子疣状前48 h。内皮祖细胞治疗如上所述。与PBS 3次洗涤后,内皮祖细胞与50 nM / L孵化MitoTracker深红色(表达载体)30分钟37°C(5%股份有限公司2)。然后,内皮祖细胞与4%多聚甲醛固定(30分钟)。后来,epc permeabilized Triton x - 100 0.3%(30分钟)。接下来,幻灯片和anti-TERT孵化主要抗体(Abcam)(1: 50)一夜之间在4°C。然后,幻灯片和Alexa孵化萤石- 488驴anti-rabbit免疫球蛋白(英杰公司)(1:1000)在室温下1 h。最后,幻灯片和4孵化 - - - - - -6-diamidino-2-phenylindole(10分钟)。使用荧光显微镜荧光图像记录。

2.12。统计数据

值表示为 。数据分析使用单向方差分析Bonferroni紧随其后的多重比较测试。 值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。流仪B2R CD34的表达+细胞的CBMCs新生儿有或没有GDM的母亲

研究人群的特征描述表S2。在GDM的新生儿,B2R CD34的表达+细胞CBMCs低于健康对照组(数字1(一)和1 (b))。正如所料,8-iso-PGF2增加α水平GDM新生儿组观察(图1 (c))。等离子体8-iso-PGF2α浓度显著负相关B2R CD34的表达+CBMCs细胞( ; )(图1 (e))。一个没有试验设备是用来评估没有生产。等离子体的生产水平GDM新生儿相比,在减少non-GDM控制(图1 (d))。血浆浓度没有将积极与B2R CD34的表达+CBMCs细胞( ; )(图1 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图1
B2R在CD34的表达+细胞CBMCs与GDM新生儿有或没有母亲。(a)的典型直方图流仪分析B2R CD34的表达+细胞CBMCs与GDM新生儿有或没有母亲。(b)的量化B2R表达式通过流式细胞术。8-iso-PGF2 (c)α浓度是直接探测到8-iso——PGF2α酶联免疫试剂盒。(d)没有生产检测化验设备。(e)等离子体8-iso-PGF2之间的相关性α浓度和B2R表达式。(f)之间的相关性血浆浓度和B2R表达式。
3.2。EPC诱导衰老

内皮祖细胞有一个典型的cobblestone-like形态。内皮祖细胞被染色的Dil-Ac-LDL或凝集素绑定(图S1)。我们使用40毫米葡萄糖没有诱导细胞凋亡(数据未显示),和孵化epc 48 h。在数据显示2(一个)和2 (c)与HG的比例显著增加,孵化SA -β-gal-positive衰老细胞。HG诱导线粒体ROS(增加数据2 (b)和2 (d))。HG下调EPC增殖(图2 (e))。与此同时,没有分泌减少(图2 (f))。评估衰老,伴随老化蛋白表达被西方墨点法测量。p16、p21和p53水平显著增加治疗后48 h HG(数字2 (g)和2 (h))。B2R蛋白质水平的汞组低于对照组(数字2(我)和2 (j))。渗透控制与甘露醇不不同于空白控制(数据没有显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
(j)
(j)
图2
HG诱导内皮祖细胞的衰老。(一)代表的SA -显微照片β加在内皮祖细胞染色。(c)在治疗后衰老细胞的数量。(b, d) ROS生成被Mito-Sox分析。(e)细胞生存能力被CCK-8试验评估。(f)没有生产检测化验设备。(g h)为p16蛋白免疫印迹,p21和p53在内皮祖细胞。蛋白质含量(i, j) B2R HG 48 h后治疗。酒吧代表 ( 与控制; )。
3.3。BK防止EPC衰老

内皮祖细胞是使用0.1 nM BK HG治疗之前或1 nM BK。正如所料,BK政府减少了EPC衰老率和ROS生成(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。BK政府推行EPC增殖和分泌(数字3 (e)和3 (f))。评估衰老,p16、p21和p53 mRNA和蛋白表达水平测定。水平的p16、p21和p53 mrna和蛋白显著增加治疗后48 h HG。BK政府下调这些信使rna和蛋白质(数据的表达3 (g)- - - - - -3(我))。BK没有对内皮祖细胞的影响没有处理HG(数据没有显示)。诱导细胞增殖可能混淆影响p16, p21和p53 mRNA和蛋白表达水平。因此,我们测试了1 nM BK对内皮祖细胞的增殖的影响,并没有发现BK 48 h后的增殖效应(数据没有显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
图3
BK预处理对HG-induced EPC衰老的影响。(一)代表的SA -显微照片β加在内皮祖细胞染色。(c)在治疗后衰老细胞的数量。(b, d) ROS生成被Mito-Sox分析。(e)细胞生存能力被CCK-8试验评估。(f)没有生产检测化验设备。(g)的mRNA表达p16、p53 p21,被实时PCR检测。(我)h, p16蛋白免疫印迹,p21和p53在内皮祖细胞。酒吧代表 ( 与控制; )。
3.4。通过B2R BK防止衰老EPC / PI3K / AKT eNOS-Mediated没有释放

检查B2R沉默效率,对照组和B2R siRNA组样本进行免疫印迹分析,我们观察到的表达下降B2R蛋白质B2R siRNA组。此外,以挪士以挪士siRNA组中表达下调(图4(a))。LY294002 B2R核,以挪士siRNA废除BK的保护作用EPC衰老和ROS生成(数字4(b) -4(e))。P-Ser473年AKT和以挪士水平降低治疗后48 h HG。BK完全阻止P-Ser的变化473年一种蛋白激酶和以挪士的水平。HG减少NO释放。BK预防减少没有释放。不出所料,B2R核、LY294002或小干扰rna治疗以挪士完全废除P-Ser BK的有益影响473年AKT和HG以挪士表达和释放调控诱导的内皮祖细胞。T-AKT表达式没有改变(数字4(f) -4(j))。没有汉堡王LY294002没有影响。综上所述,BK防止EPC衰老通过刺激B2R / PI3K / AKT eNOS-mediated没有释放。


图4
B2R的作用和保护作用的BK对内皮祖细胞的衰老。(一)西方墨点法B2R和内皮祖细胞以挪士。(b)代表的SA -显微照片β加在内皮祖细胞染色。(d)在治疗后衰老细胞的数量。(c, e) ROS生成被Mito-Sox分析。(外)为P-Ser西方墨点法473年在epc AKT、T-AKT和以挪士。(j)没有生产检测化验设备。酒吧代表 ( 与控制;# 与汞;& 与 ; )。
3.5。通过调节hTERT易位BK防止EPC衰老

HG治疗导致mtDNA拷贝数显著增加。相比之下,HG治疗减少内皮祖细胞的相对端粒的长度。重要的是,BK治疗预防mtDNA拷贝数的增加与HG内皮祖细胞治疗。与此同时,BK政府明显抑制端粒的相对长度的减少引起的HG。不出所料,小干扰rna, B2R LY294002,或以挪士siRNA治疗完全废除的有利影响BK mtDNA拷贝数和端粒的相对长度引起的汞在epc(数字5(一个)和5 (b))。在正常细胞hTERT主要位于细胞核。免疫荧光的图片,我们观察到绿色荧光,代表hTERT主要位于细胞核。HG感应后,绿色荧光强度衰减在细胞核和线粒体明显增强。BK抑制减少核和线粒体的绿色荧光强度的增加,这表明BK抑制hTERT易位。然而,孵化B2R核、LY294002和小干扰rna抑制了BK的行动以挪士,表明B2R-AKT-eNOS信号通路参与了BK的影响对HG-induced hTERT易位(图5 (c))。相比之下,hTERT蛋白质含量没有改变在整个细胞溶解产物在所有七个组,证明从细胞核hTERT的易位到线粒体整体hTERT差别之前对这些蛋白质含量(数字5 (d)和5 (e))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图5
BK对mtDNA拷贝数的影响,端粒的相对长度,hTERT易位和hTERT表达内皮祖细胞治疗HG。(a)的相对mtDNA内容内皮祖细胞被实时PCR检测。在内皮祖细胞(b)的相对端粒的长度被实时PCR检测。(c)代表免疫染色显示hTERT的分布。线粒体、红色荧光;hTERT和绿色荧光。(d, e)西方墨点法在内皮祖细胞hTERT。酒吧代表 ( 与控制;# 与汞;& 与 ; )。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现B2R CD34的表达+细胞CBMCs是降低GDM的女性比健康女性。这种减少是8-iso-PGF2与高血浆水平负相关α和没有与低血浆水平呈正相关。BK阻止通过抑制hTERT易位EPC衰老,它的特点是增加相对端粒的长度,减少mtDNA拷贝数与HG内皮祖细胞治疗。重要的是,BK监管EPC hTERT易位通过B2R-mediated Akt /以挪士信号通路。因此,我们在这里展示BK防止HG-induced EPC衰老通过B2R-mediated没有释放。

在这项研究中,我们的结果表明,B2R循环CD34表达较低+细胞的CBMCs GDM 8-iso-PGF2妇女和伴随着更高的学位α水平与健康对照组相比。因此,我们假设B2R是关键元素,调节HG-induced CD34+细胞衰老。先前的研究表明,活性氧的积累会导致加速衰老的细胞,细胞功能障碍和逮捕的细胞周期G1期(19]。HG-induced内皮功能障碍的机制都进行了广泛的调查。先前的研究表明,碳酸anhydrase-I HG妨碍了内皮细胞通透性,并确定引起的内皮细胞体外凋亡[20.]。此外,炎症因子参与内皮功能障碍的恶化造成的HG。埃斯波西托et al。21]报道肿瘤坏死因子α的作用在HG的存在内皮功能障碍。内皮祖细胞是骨骨髓来源和lineage-specific细胞致力于成为成熟的内皮细胞。内皮祖细胞的功能障碍常常会导致内皮细胞障碍。2型DM患者比健康对照组EPC水平较低,类似于其他与压力有关的疾病患者,如缺血性心脏病。的确,在急性冠脉综合征及急性心肌梗塞、急性高血糖症可能会导致不同的反应主要血管成形术和支架植入DES的差别,通过对这些基因内皮祖细胞。这可能条件不同的扩展与负面影响心肌损伤的心肌抢救和预后差22]。脂肪组织炎症密切相关,和乳房腺脂肪组织估计占不同的速率主要不良心血管事件(锤)对绝经期前的女性23,24]。在这项研究中,循环CD34+细胞从26 GDM患者,随着样本26 BMI-matched健康对照组,收集。我们证明了HG剂量依赖性降低内皮祖细胞的活动和增强EPC衰老。

先前的研究显示,以挪士/ PI3K / Akt通路参与的机制没有释放减少ROS生成(25,26]。衰老细胞不可逆转地增长逮捕并包含高p21的表达和p16细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(27]。之前的数据表明p53似乎发挥重要作用的规定p21表达和衰老28,29日]。在这项研究中,BK施加对HG-induced ROS生成的保护作用,从而减少p53-mediated EPC衰老。对EPC衰老的影响可能认为,至少在一定程度上抑制PI3K-Akt-eNOS的信号通路(30.]。在这项研究中,B2R核,以挪士siRNA, PI3K抑制剂LY294002完全废除BK在EPC的抑制性影响衰老引起的HG。这些结果表明,BK防止HG-induced EPC Akt-eNOS-NO衰老的信号通路。

没有有能力防止复制的衰老,端粒与端粒的DNA修复相关的影响(10]。各种各样的研究已经证明,叔的活动是至关重要的,防止细胞进入衰老的伸长端粒(31日,32]。以前的数据证明hTERT本地化在细胞核,胞质和内皮细胞的线粒体33]。在这项研究中,与此同时显著增加活性氧的形成的内皮祖细胞,核hTERT蛋白质减少,而线粒体hTERT蛋白增加。相比之下,hTERT蛋白质并没有改变整个细胞溶解产物。这些结果表明,离原子核hTERT易位到线粒体整体hTERT差别之前对这些基因的表达。这与以前的研究结果是一致的报告下叔的线粒体易位ROS增加体外(34,35]。此外,目前的结果证实,在平行于增加线粒体hTERT表达式,mtDNA积累过程中,与线粒体功能障碍(36和活性氧的增加37- - - - - -40]。此外,通过以挪士/ AKT通路BK刺激没有释放,然后进一步减少ROS生成汞条件下维持端粒的长度。这些结果表明,BK政府明显抑制EPC hTERT易位和衰老引起的汞通过减少线粒体ROS依赖B2R / AKT eNOS-mediated没有释放。

5。限制

有一些限制,包括我们用免疫荧光,而不是端粒重复扩增协议(陷阱)评估hTERT蛋白质的水平,这可能不太准确。还需要进一步的研究来确定是否B2R超表达可以推迟EPC衰老的进程,和更详细的分子机制,如一个特定的机制,而不是一个hTERT ROS对核出口的影响,仍有待进一步阐明。

6。结论

BK政府明显抑制EPC hTERT易位和衰老引起的汞通过减少线粒体ROS依赖B2R / AKT eNOS-mediated没有释放。防止损失B2R表达式可能代表一个新颖的方法预防和治疗的氧化应激相关EPC衰老。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Yuehuan吴认为,姚明的构思和设计实验。所有作者进行了实验。Yuehuan吴认为,姚明分析数据。智,他和李Xing-Er贡献试剂/材料/分析工具。Bing李和Cong傅收集临床样本。刘常和马Genshan收集的临床资料。吴Yuehuan起草和修订。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(格兰特数字:81470401和81770452)。

补充材料

补充1。图S1:内皮祖细胞被染色的Dil-Ac-LDL或凝集素结合。

补充2。表S1:内皮祖细胞用于rt - pcr引物。表S2:临床注册怀孕的特征。