文摘
背景。哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)对内皮功能是至关重要的。本研究旨在评估是否glucagon-like peptide-1 (GLP-1)模拟liraglutide通过mTOR对内皮功能保护作用的信号通路。方法。管理人类脐静脉内皮细胞(通过传代形成细胞liraglutide(100海里)为0,10、30、60、720和1440分钟。mTOR的表达和磷酸化水平,mTOR-Raptor复杂(mTORC1)和mTOR-Rictor复杂(mTORC2)是由免疫印迹和免疫沉淀反应,而mTORC1和mTORC2表达式被siRNA-Raptor siRNA-Rictor,分别。一种蛋白激酶磷酸化被免疫印迹检测。HUVECs然后孵化与liraglutide没有或第四Akt抑制剂的存在。一氧化氮(NO)释放由硝酸还原酶的方法来评估。磷酸化内皮一氧化氮合酶(以挪士),人类端粒酶逆转录酶(hTERT)和apoptosis-related效应器是评估蛋白质含量的蛋白质印迹。端粒酶活性是评价ELISA。结果。持续mTOR磷酸化,形成mTORC2 mTORC2-dependent Akt磷酸化被liraglutide诱导。此外,以挪士磷酸化,没有生产,核hTERT积累,和核端粒酶活性增强了mTORC2-mediated Akt激活。Liraglutide还显示一个由上调抗凋亡蛋白和凋亡的影响表达下调proapoptotic蛋白质在mTORC2-Akt activation-dependent方式。结论。Liraglutide显著改善内皮功能,至少部分通过mTORC2 / Akt信号通路。
1。介绍
加速动脉粥样硬化特征2型糖尿病(T2DM)病人体内。内皮细胞功能障碍(ECD)过早动脉粥样硬化中发现2型糖尿病被认为是动脉粥样化形成的因果因素。ECD的特点是减少内皮一氧化氮合酶(以挪士)活性和一氧化氮(NO)版本中,端粒酶活性降低,细胞因子表达升高,导致受损的血管舒张和凋亡刺激敏感性增加,从而加剧了赤字和促进动脉粥样硬化的发病和进展。因此,探索潜在的机制和识别策略的改善内皮细胞功能是预防和治疗的关键macrovascular并发症的2型糖尿病。
Liraglutide代表一个glucagon-like peptide-1 (GLP-1)模拟应用于2型糖尿病治疗。类似于内生GLP-1, liraglutide导致餐后胰岛素分泌,减少胰高血糖素释放,提高饱腹感。越来越多的证据表明GLP-1类似物可能同样降低心血管疾病的风险在患有2型糖尿病1,2]。除了良好的肠促胰岛素作用,GLP-1影响心血管系统通过直接作用于内皮细胞,在特定的受体GLP-1已发现(3]。特别是,GLP-1诱发血管舒张,改善内皮功能(4]。然而,这些影响机制在很大程度上仍是个未知数。
先前的研究已经证明了哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)与内皮细胞功能密切相关。最近的研究表明GLP-1对胰腺β细胞有保护作用[5),心肌细胞(6),和神经细胞(7),包括凋亡和抗氧化活动通过mTOR信号通路。然而,研究评估GLP-1协会的有利影响对内皮细胞功能与mTOR / Akt信号稀缺。
当前工作的目的是评估的保护作用是否GLP-1模拟liraglutide内皮功能涉及mTOR信号通路。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类脐静脉内皮细胞(HUVEC, ScienCell,美国)隔离进行了从人类脐带静脉标本通过胶原酶治疗如前所述[8]。HUVECs在ECM培养基培养(ScienCell) 37°C在潮湿环境中有5%的公司2在段落使用3 - 5。
2.2。免疫印迹和免疫沉淀反应
根据之前的描述(这些分析进行了9]。
2.3。转染siRNAs HUVECs
基因沉默、mTOR猛禽,Rictor和控制siRNAs,分别转染到HUVECs后以前的报告(10]。简而言之,HUVECs ( 每6-well板)细胞培养在ECM confluency媒介(2毫升)60%。其次是7 h(孵化各自siRNAs的存在。转染后,HUVECs进一步培养24小时。最后,猛禽,mTOR Rictor表达水平被免疫印迹分析。
2.4。端粒酶测定
细胞被播种到6-well板( 细胞每口井)和孵化liraglutide没有或第四Akt抑制剂的存在。PBS洗后,HUVECs是细胞溶解(如前所述)(11]。在收集到的上层清液蛋白质含量由布拉德福德的方法。端粒酶活性是评估使用3μg蛋白的TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA +工具包(罗氏)。
2.5。没有测量
没有从HUVECs释放是评估分析工具包(AO12、南京建成生物工程研究所)的硝酸还原酶的方法。
2.6。统计分析
数据是 从3或更多实验独立执行。学生的 - - - - - -测试是用来比较组对。单向方差分析(方差分析)与后续图基事后测试是用于多个组比较。 显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。在HUVECs Liraglutide增加mTOR磷酸化
HUVECs接种liraglutide(100海里)为0,10、30、60、720和1440分钟,分别进行免疫印迹的表达和磷酸化mTOR(图1(一))。如图1 (b),liraglutide显著增加mTOR磷酸化;Ser2448磷酸化在mTOR从10分钟,达到增加60分钟,剩下数量上升,直到1440分钟时间点。
(一)
(b)
3.2。Liraglutide诱发mTORC2-Dependent Akt-Ser473磷酸化
GLP-1激活蛋白激酶B(一种蛋白激酶),它通过直接磷酸化激活以挪士。因此,在激活phosphor-Akt liraglutide表达的影响进行评估。一种蛋白激酶磷酸化Ser473(主磷酸化网站)在HUVECs liraglutide对待增加60分钟,而总Akt水平保持不变(图2 (b))。众所周知,mTOR有助于两种不同multiprotein复合物:mTORC1,雷帕霉素的证明目标,包括mTOR, Mlst8,猛禽;mTORC2最初认为是rapamycin-insensitive,由mTOR Mlst8, Rictor。接下来,mTORC1和mTORC2参与liraglutide对HUVEC功能保护作用的评估。先前的研究表明,mTORC2磷酸化Akt Ser473。评估是否liraglutide促进mTORC2 HUVECs合成,coexpression和协会mTOR Rictor进行评估与liraglutide治疗后(图2(一个))。蛋白质免疫印迹显示Rictor和猛禽数量都是减少HUVECs转染与Rictor Raptor-specific siRNAs,另行规定。没有控制核组中观察到的影响。接下来,siRNA-transfected HUVECs接种liraglutide 60分钟。结果表明,siRNA-associated Rictor击倒明显减少liraglutide-dependent Akt磷酸化与控制核组相比,虽然siRNA-induced猛禽击倒(数据没有影响2 (b)和2 (c))。总的来说,这些发现表明,liraglutide提升mTORC2 HUVECs形成和下游的一种蛋白激酶的激活。
(一)
(b)
(c)
3.3。在HUVECs Liraglutide增加没有生产
内源性内皮细胞没有具有至关重要的作用。因此,我们评估的影响liraglutide没有输出,以挪士的活动,主要在内皮细胞没有合成酶。治疗HUVECs liraglutide在100 nM 60分钟导致显著增加大量的生物活性没有在细胞上清液与控制(图的值3(一个))。此外,磷酸化以挪士(图的水平3 (b)(图)和e-NOS-hsp90复杂3 (c))也增加了liraglutide管理后,检测到免疫印迹和coimmunoprecipitation实验,分别。因为Akt激活以挪士直接磷酸化,这些影响被Akt抑制剂钝化。
(一)
(b)
(c)
3.4。Liraglutide增加hTERT和端粒酶活性的核易位HUVECs通过mTORC2 / Akt信号
细胞衰老是由端粒酶活性调节hTERT表达式,磷酸化、核转位的水平。探索机制下游mTORC2 / Akt通路,是否liraglutide调节hTERT蛋白表达在HUVECs评估免疫印迹。如图4,p-hTERT水平(图4(一))和核hTERT积累(图4 (b)(图)以及核端粒酶活动4 (c))与liraglutide HUVECs增加在治疗。这种效应被Akt抑制剂IV钝化。
(一)
(b)
(c)
3.5。Liraglutide对HUVECs凋亡蛋白表达水平的影响
Apoptotic-related蛋白质,包括一种蛋白激酶B细胞淋巴瘤(Bcl) 2,和Bcl-2-associated死亡启动子(坏),被免疫印迹(数据量化5(一个)- - - - - -5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
Liraglutide推广一种蛋白激酶磷酸化Ser473后续增加的bcl - 2蛋白表达水平(图5(一个));与此同时,增强坏磷酸化(图5 (c))观察GLP-1-treated HUVECs。此外,减少Bim (proapoptotic蛋白质水平(图)5 (b))是通过phosphor-FOXO1获得(图5 (d)后liraglutide管理。有趣的是,这些liraglutide影响是推翻政府的第四Akt抑制剂。这些结果表明,liraglutide可以减弱凋亡HUVECs通过调节凋亡蛋白通过mTOR / Akt通路。
4所示。讨论
这项工作表明liraglutide保护内皮功能通过mTOR诱导mTOR磷酸化信号通路,mTOR-Rictor复杂的形成,mTORC2-dependent Akt磷酸化。此外,mTORC2-associated Akt激活增强下游没有生产,hTERT移位入核,核端粒酶活性,移植和抑制antiapoptosis proapoptosis蛋白质,分别在HUVECs。上述研究结果提供关键机械的见解HUVECs liraglutide的影响。
mTOR蛋白调节细胞生长、增殖、生存能力和函数(12]。我们发现liraglutide强有力地保护HUVECs通过一个涉及mTOR激活的机制。众所周知,mTOR活动是通过磷酸化调制。如上所示,磷酸化水平的mTOR Ser2448从10分钟,达到增加60分钟,剩余高直到1440分钟后治疗liraglutide HUVECs。mTOR蛋白质代表两个不同的multiprotein复合物的组成部分,包括mTORC1和mTORC2。mTORC2促进mTOR和一种蛋白激酶磷酸化,磷酸化增强细胞骨架肌动蛋白微丝组织(13]。我们发现mTORC2形成HUVECs liraglutide治疗后增加;与此同时,其可拆卸的减少liraglutide-associated一种蛋白激酶磷酸化,削弱liraglutide的保护作用。因此,长期liraglutide管理可以促进Akt激活通过增加磷酸化mTOR数量和HUVECs mTORC2水平,表明liraglutide保护HUVEC函数通过mTORC2 / Akt通路。
不代表主要的内皮血管舒张,与强大的antiatherosclerotic影响由于其抗氧化,抗炎,anticoagulatory属性(14,15]。病理改变,包括胰岛素抵抗和2型糖尿病代谢紊乱,引起以挪士功能障碍,减少没有合成,目前被认为是主要的机制macrovascular糖尿病并发症。此外,glp - 1在冠状增加数量没有废水从老鼠的心脏,血管舒张效应削弱了以挪士抑制剂(16),这表明GLP-1激活以挪士。以挪士的磷酸化激活Ser1177是必不可少的。与先前的研究一致,本研究表明,通过以挪士磷酸化liraglutide诱导没有生产。与此同时,许多激酶磷酸化以挪士,包括PKA, Akt, AMPK,重要功能GLP-1信号(17]。这项研究还表明,一种蛋白激酶抑制导致减少GLP-1-associated没有生产,表明GLP-1的血管舒张作用,至少部分,由上述控制通路。这些发现证实了此前公布数据显示,GLP-1诱发的扩散HUVECs Akt的控制下,以挪士。
除了调节以挪士磷酸化和内皮没有生产,Akt还控制多个细胞周期调节器和细胞生存途径。我们评估是否liraglutide抑制HUVEC衰老。如上所示,liraglutide核hTERT积累增加,显著提高核HUVECs的端粒酶活性表达情况。这种效应被削弱Akt抑制剂IV Rictor击倒,表明liraglutide增强核通过mTORC2 HUVECs和Akt激活的端粒酶活性表达情况。
多个报告展示了glp - 1在不同细胞类型是凋亡,例如,胰腺βcholangiocytes细胞,神经细胞、心肌细胞和血管内皮细胞(18]。能够很好的接受,bcl - 2家族成员代表中央监管机构的细胞死亡。例如,坏与抗凋亡蛋白bcl - 2或Bcl-Xl结合生成复杂,诱发细胞凋亡。然而,坏的磷酸化在Ser136 Akt使其释放上述复杂;然后它形式的另一个复杂的胞质14-3-3蛋白质,从而失去其proapoptotic活动(19]。坏的被认为是一个下游Akt在提高细胞生存的目标。先前的发现表明GLP-1诱发bcl - 2 upregulation,糟糕的失活,caspase-3活动减少胰腺β细胞(20.]。此外,GLP-1 bcl - 2增加了伯灵顿比,降低胞质细胞色素c的水平,并减少caspase-9和HUVECs caspase-3活动管理先进的糖化终端产品(年龄)21]。与这些报告一致,随后mTOR磷酸化激活其下游效应器Akt和bcl - 2表达和糟糕的磷酸化,增加而下调proapoptotic蛋白质Bim和允许HUVECs抵抗凋亡刺激。
mTOR信号通路是细胞代谢的调节密切相关。因此,我们将进一步研究liraglutide对细胞代谢调控和线粒体功能的影响在病理条件下(如high-glucose和高脂肪的条件),通过自噬是否调节细胞内稳态。这将有利于进一步澄清liraglutide的心血管保护机制。总之,liraglutide刺激mTOR磷酸化,mTORC2形成,与保护作用和HUVECs Akt激活,通过mTORC2 / Akt-dependent增加核端粒酶活性和生物合成。目前发现揭示新的机制liraglutide-associated保护HUVEC函数和建议mTORC2 HUVEC的关键调制器的功能。
数据可用性
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
伦理批准
伦理考虑为这个研究是不必要的。没有动物和人类的研究提出了手稿。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
所有作者列出了一大笔,直接和知识贡献的工作,批准发布。
确认
这项工作是国家重点支持的研究和发展项目(2018 yfc0901500 yfc2001100和2016年),中国医学科学院医学科学创新基金(cifms2017 - i2m - 1 - 008),和PUMCH科学基金青年教师(PUMCH - 2016 - 1.14)。