文摘

背景。糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,是导致终末期肾病(ESRD)和替代疗法。DN患者维生素D水平非常低,由于1 -的合成和活动减少α羟化酶在近端小管细胞和维生素D受体数量减少。到目前为止,很少有研究显示1的抗氧化效果α,25-dihydroxyvitamin D3(1,25 (OH)2D3在高血糖诱导肾损伤。维生素D受体的选择性激活,paricalcitol,减少蛋白尿,减缓肾损伤的进展。维生素D的确切机制影响糖尿病状态和提供肾脏的保护还有待确定。方法。糖尿病(DM)在94年被诱导8-week-old DBA / 2 j小鼠腹腔注射链脲霉素(STZ)。DM小鼠随机分为接受和paricalcitol车辆或治疗,活性维生素D模拟,1周后DM感应或paricalcitol治疗3周后DM归纳。一个额外的健康对照组野生型老鼠并不是治疗。尿白蛋白、血尿素氮和肌酐水平测量之前和结束时paricalcitol治疗。周期性acid-Schiff、免疫组织化学染色和免疫印迹的肾组织的维生素D受体,villin, nephrin,和podocin表达式,进行了分析。结果。Paricalcitol治疗恢复villin、nephrin podocin表达下调的蛋白质含量在DM感应,并降低纤连蛋白的蛋白质水平。维生素D受体激活paricalcitol可以减少蛋白尿的DN在小鼠和缓解high-glucose-induced损伤肾脏足细胞通过调节nephrin-podocin等关键分子。结论。Paricalcitol治疗与改进的结构性变化在1型糖尿病小鼠包括upregulation维生素D受体的表达,和减少纤维化标志物如纤连蛋白。这些影响可能导致维生素D的一致利益模拟肾小球功能减缓恶化和减少风险ESRD患者的1和2型糖尿病。我们的研究结果表明,额外的使用paricalcitol可能是有益的在治疗糖尿病患者标准治疗策略。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是最常见的肾的并发症不受控制的1型和2型糖尿病(T2D)和终末期肾病(ESRD)的主要原因。大约三分之一的糖尿病(DM)患者(ESRD)将开发需要肾脏替代治疗的25年内DM发作(1]。长期潜在的风险和介入研究已经清楚地表明,DN发展直接相关的慢性高血糖与不同的器官损害和失败包括视网膜,肾脏,心脏,血管2- - - - - -4]。在这些并发症,DN是最严重的微血管并发症,造成大量的发病率和死亡率(1]。

DN的主要病理改变包括功能变化体现了反渗透法和肾小球形态变化和近曲小管(PCT)细胞足突细胞渗出,系膜基质增生,细胞外基质(ECM)扩张,ESRD tubulointerstitial纤维化,肾小球硬化,导致(5- - - - - -7]。

病理生理学导致糖尿病肾病的发展遵循从糖尿病的生成和发行量环境导致晚期糖化终端产品(年龄),生长因子的精化,血流动力学和激素的变化。这些导致活性氧的释放和氧化应激和炎症介质。一些研究表明,炎性细胞因子和促炎的因素与DN生成和发展密切相关(6,7]。此外,众所周知,肾纤维化是由肾血流动力学改变,引起缺血,葡萄糖代谢异常,和一个活跃肾素血管紧张素醛固酮系统(老城)[5,8,9- - - - - -11]。此外,转化生长因子-β1 (TGF -β1)和血管紧张素ⅱ对肾组织纤维化的过程(5,12- - - - - -16]。纤连蛋白的角色,fibrosis-related蛋白质,TGF -β1在DN发病机理和发展已被许多研究工作的重点(5- - - - - -7]。

维生素D参与肾脏损伤一直得到广泛的研究。活动1,25 (OH)2D3结合细胞内维生素D受体(VDR)在目标基因激活维生素D反应元素。在肾脏,维生素D是很重要的对足细胞的健康和抑制肾素基因表达在足细胞和炎症。维生素D已建议港口多种生物活性,其中的潜在保护维生素D的DN。动物实验和临床试验都有记录的逆相关性低维生素D水平和DN的风险,和补充维生素D或其活性衍生物已被证实能改善内皮细胞损伤,减少蛋白尿,减弱肾纤维化和延缓DN发展。维生素D对其药理作用主要是通过维生素D受体在足细胞的激活抑制肾素-血管紧张素系统。黛比和他的团队(13提供证据,保护足细胞足突细胞VDR信号从高血糖诱导细胞凋亡和防止糖尿病肾病。维生素D的anti-DN好处时可以增强管理结合血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素ⅱ受体拮抗剂。机械的研究表明,通路相关炎症参与DN发病机理,指出通过抑制巨噬细胞浸润,核factor-kappa (NF - BκB)激活和生产等炎症介质的转化生长因子-β(TGF -β)[14,15]。

越来越多的证据表明,维生素D及其受体,维生素D受体(VDR),扮演着至关重要的角色在DN的开发和发展4]。VDR,核激素总科的一员,主要表达在近端和远端小管上皮细胞,足细胞、系膜细胞和集合管上皮细胞(14- - - - - -16]。一些临床试验已证实维生素D的antiproteinuric活动类似物对慢性肾病的糖尿病患者。在肾脏,VDR是主要表达。

Paricalcitol是一种改性的活性维生素D和VDR受体激动剂,由于其tissue-selective行动的方法17- - - - - -19]。Paricalcitol对细胞增殖的抑制作用和纤维化16]。多项研究表明,VDR-mediated信号转导途径抑制DN的发展中发挥着至关重要的作用,通过减少炎症反应,减少蛋白尿和预防纤维化。各种肾病小鼠模型表明,paricalcitol renoprotective效果,包括抗炎和antifibrotic效应(20.,21]。Paricalcitol可以增加VDR在足细胞的表达,促进VDR细胞核,translocalization和nephrin-podocin的差别显著逆转high-glucose-mediated对这些基因,从而提高足细胞损伤和减少2型糖尿病患者尿白蛋白(13,21]。更多,paricalcitol可以扮演一个消极的内分泌调节肾素-血管紧张素系统与肾保护(10,12,22,23]。

确定选择性的有利影响维生素D analoge, paricalcitol,糖尿病患者肾功能的变化,由高血糖引起的,在8周大DBA / 2 j小鼠,腹腔内注射(IP),每天一次,连续五天,刚做好的链脲霉素(STZ)。DBA / 2 j是更容易患上糖尿病肾病(15,26]。这项研究的目的是确定(1)如果维生素D的外生管理模拟,paricalcitol,可以延缓DN的发展,(2)如果paricalcitol可以减少肾纤维化由于高血糖,和(3)如果paricalcitol可以通过转录刺激减少蛋白尿的表达nephrin podocin,一个关键的狭缝隔膜由足细胞蛋白质合成(27- - - - - -29日]。

2。材料和方法

2.1。动物和糖尿病模型

71 DBA / 2 j纯系小鼠购自杰克逊实验室(美国我巴尔港)和群居饲养和维护在12 h / 12 h光/暗周期与随意获取食物和水。71 DBA / 2 j小鼠选择,因为他们更容易患糖尿病肾病。动物治疗动物福利按照国家卫生研究院的指导方针,和所有程序批准Azrieli医学院,机构的巴依兰大学动物保健和使用委员会(IACUC)。

2.2。糖尿病感应

DM是诱导8-week-old DBA / 2 j小鼠( )腹腔内注射(IP),每天一次,连续五天,刚做好的链脲霉素(STZ)(35毫克/公斤体重,溶解在10毫米柠檬酸缓冲液pH值4.5),胰岛细胞毒素(Gurley et al . 2006)。STZ剂量方案确定前飞行员校准模型实验。控制老鼠( )治疗的车辆10毫米柠檬酸缓冲。去年注射STZ后一周,尾巴测量血糖水平连续两天,使用一个(Accu-Chek,罗氏)。老鼠显示葡萄糖 连续两天被认为是糖尿病。

2.3。实验设计

老鼠被随机分为四组:(I)控制(CON)没有治疗的小鼠( :12男性(M);11个女性(F));(2)DM-induced糖尿病小鼠没有得到治疗 :11米;12 F);(3)DM小鼠接受paricalcitol (DM +早期P治疗)在糖尿病并发症的发病之前,一周后糖尿病感应( :7米;12 F);及(IV) DM小鼠接受paricalcitol (DM + P治疗晚期)糖尿病并发症的发病后,即,三周后糖尿病感应( :14米,15 F)。

小鼠体重和尿液样本手动收集每4周。小鼠安乐死paricalcitol或车辆的开始治疗后12周,由ketamine-xylazine注入。立即收集血液,肾脏是收获;一个是保存在-80°C液氮生物化学,和其他被保存在甲醛组织学检查。血液是离心机进行血清生化分析。肾脏重量和存储根据组织学和生物化学分析要求。

2.4。维生素D补充

最后一个或三周后注射STZ(第三和第四组,分别),老鼠管理IP注入paricalcitol (0.3μ克/公斤体重),溶解在丙二醇:DDW (80: 20)。Paricalcitol每周进行3次/共12周。

2.5。周期性Acid-Schiff (PAS)染色

新鲜的肾脏从每个鼠标甲醛和嵌入在石蜡固定在4%。然后,4μ米厚的部分被削减和转移到积极的玻片,和加工周期acid-Schiff (PAS)染色。幻灯片deparaffinized,水化,然后孵化在0.5%高碘酸为30分钟,紧随其后的是一个孵化与品红试剂(美国微孔HX, 69853033)在室温下,在黑暗中1 h。对比染色和迈耶的苏木精了。

2.6。免疫印迹分析

肾组织均质,含有蛋白酶裂解缓冲(# P8340,σ,以色列)和磷酸酶抑制剂(# 04906837 - 001 f罗氏公司AG)、ch - 4070巴塞尔瑞士)。肾脏溶菌产物受到钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),之后被转移到蛋白质硝基或聚乙二烯二氟化物(PDVF)膜。膜被屏蔽5%干脱脂牛奶(美国Bio-Rad) Tris-buffered盐水与渐变20 (TBST)在室温下1 h,与TBST洗了三次,和孵化主要抗体TBST奶粉5%,在4°C,一夜之间。膜是TBST清洗和孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体室温,35分钟,其次是TBST洗涤。乐队使用清晰的可视化增强化学发光(ECL)工具包(美国Bio-Rad),并使用图像实验室软件带强度进行了分析(美国Bio-Rad)。

2.7。免疫印迹抗体

主要包括反抗体使用β肌动蛋白(σ1:10000年,美国),anti-glyceraldehyde 3 -磷酸脱氢酶(GAPDH)(16891年1:20000年,EPR, Abcam), anti-VDR (1: 750 nbp1 - 51322,罗福斯生物制剂),anti-villin (LSC407669 1: 1000年,寿命生物科学),anti-nephrin(1: 400年,ab58968 Abcam) anti-podocin(13820年1:2000年,EPR, Abcam),和anti-fibronectin(1: 2000年,Abcam)。二次抗体包括山羊anti-rabbit(美国杰克逊ImmunoResearch 1: 7500、111-035-144)。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)

部分deparaffinized在二甲苯和分级酒精,然后受到抗原检索与柠檬酸缓冲30%,pH值6 (# ZY0001, Zytomed系统)。非特异性抗体结合位点被封锁H为3%2O215分钟。部分被孵化与主要抗体,稀释在屏蔽解决方案(CAS-block 8120、表达载体、英国),在4°C,一夜之间。HRP-conjugated anti-rabbit (N-Histofine Nichirei生物科学公司,日本)作为二级抗体。免疫反应性的信号是在孵化与3,3-diaminobenzidine(民建联、ta - 060 hdx热科学、英国)。幻灯片和苏木精复染色,脱水,安装快速硬化(# 03989,σ,德国)。图像使用Axio捕捉到一个实验室/ A1显微镜(20 x客观),配备摄像头与禅宗和分析软件。所有样品接触时间保持不变。

主要的抗体使用包括anti-VDR (1: 200 nbp1 - 51322,罗福斯生物制剂),villin (LSC407669 1: 400年,寿命生物科学),anti-nephrin(1: 400年,ab58968 Abcam) anti-podocin(13820年1:2000年,EPR, Abcam), anti-fibronectin(1: 2000年,Abcam)和anti-TGF -β(1:2000年,Abcam)。

包含IHC染色被观众全景量化,Image-Pro(第7版)软件,使用最染色领域的热点方法每组;95%置信区间计算。量化是基于至少10个字段在每组图像。总染色面积计算是基于手动选择染色面积的比值的总面积。

2.9。统计分析

所有结果的报道 (SEM),所有独立实验至少重复三次。学生的 - - - - - -测试和学习小组之间的方差分析进行比较,利用GraphPad Prism 5.00版本Windows(美国加州La Jolla GraphPad软件)的 被认为具有统计显著性值< 0.05。

3所示。结果

3.1。Paricalcitol补充影响肾脏指数

评估paricalcitol对肾功能的影响,肾脏指数(肾/体重比)(图计算1)。DM小鼠的肾脏指数明显高于( )控制老鼠(相比 )( )。适度降低肾脏指数所示DM小鼠对paricalcitol DM的后期阶段( ),而DM小鼠接受早期治疗证明显著减少肾脏指数( )( ),使他们在正常范围内。


图1
老鼠肾脏指数。糖尿病引起的感应显著增加肾脏指数水平(DM小鼠, )与控制(案子, )老鼠( ),虽然paricalcitol早期治疗(DM + P ( ),DM + P(末 ))恢复肾脏指数水平正常( ,DM +早期P老鼠和控制)。结果表示为 。
3.2。Paricalcitol补充影响肾VDR表达式

由于船舶的监管水平活性维生素D水平的影响paricalcitol肾VDR蛋白质的表达是量化。免疫印迹分析显示明显降低在VDR在DM小鼠水平( )与对照组相比 )( ),paricalcitol-treated老鼠(早期和晚期治疗)表达了VDR ( 和 ,分别)水平与未经处理的小鼠(数字控制2 (b)和2 (c))。

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图2
维生素D受体表达在糖尿病小鼠肾组织。(一)免疫组织化学分析的维生素D受体(VDR)小鼠肾组织中的表达。VDR信号降低DM小鼠相比对照组。早期和晚期paricalcitol (P)治疗VDR的表情恢复正常。放大,×20。(b)代表西方滴VDR蛋白质含量。(c)肾VDR的量化表达式。DM肾VDR显著下降( )与控制老鼠( )( )。显著增加VDR水平观察肾组织DM + P(初 )相比DM小鼠( )。

这些观察经包含IHC染色的VDR在肾组织(图2(一个))。更具体地说,观察低VDR表达式在组织中提取的DM小鼠作为控制老鼠相比,paricalcitol治疗肾VDR水平增加,微不足道的差异测量之间的早期和晚期的治疗方法。

3.3。Paricalcitol肾损伤和形态学的影响

PAS染色控制动物的肾脏部分显示正常的肾小球和圆形PCT形态。相比之下,DM小鼠表现出扁平的管状细胞。早期和晚期paricalcitol治疗恢复扩展的小管(图形状正常3)。


图3
PAS染色的肾脏部分。肾脏部分代表PAS染色显示正常的肾小球形态和PCT的对照组。DM小鼠表现出扩展的小管,而早期和晚期paricalcitol治疗恢复了延长小管形态正常。放大,×20。

DM小鼠表现出更高的纤连蛋白积累在肾小球控制老鼠相比,影响由paricalcitol预防治疗,通过包含IHC(图所示4(一))和免疫印迹分析(数据4 (b)和4 (c))。

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图4
纤连蛋白表达在小鼠肾组织。(a)免疫组织化学分析,纤连蛋白表达在糖尿病(DM)小鼠肾脏部分。部分DM小鼠表现出纤连蛋白的高表达与控制(CON)部分。Paricalcitol治疗(DM +早期P DM + P)末纤连蛋白表达减少。放大,×20。(b)代表西方滴纤连蛋白和GAPDH蛋白质提取小鼠肾组织。(c)量化的西方的污点。在DM小鼠肾纤连蛋白水平显著增加( )相比之下,控制老鼠( )( )。观察纤连蛋白水平明显降低早期paricalcitol-treated老鼠(DM + P ( ),DM + P末 治疗)与DM小鼠( )。误差线对应于扫描电镜。
3.4。PCT损伤的生物标志物
3.4.1。PCT受伤

Villin,肾脏近端小管的重要组成部分,和PTC损伤的生物标志物,在DM表达下调与控制老鼠(图5(一)),但仍处在正常水平paricalcitol-treated老鼠。相似的结论达成以下包含IHC villin分析蛋白质的水平,在DM小鼠肾脏明显下降( )与控制小鼠相比 , ),但仍处在正常水平的老鼠接受早期或晚期paricalcitol治疗( 和 ,)(图5(b)和5(c)),表明其对肾脏的保护作用。

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图5
Villin表达小鼠肾组织。(a)免疫组织化学分析villin表达小鼠肾部分。染色强度villin低DM与控制(CON)老鼠。早期Paricalcitol治疗(DM + P DM + P治疗晚期)恢复villin水平。放大,×20。(b)代表西方滴villin和GAPDH蛋白质提取小鼠肾组织。(c)量化的西方的污点。DM小鼠肾villin水平明显下降( )控制老鼠(相比 )( )并明显高于早期paricalcitol-treated老鼠(DM + P ( ),DM + P(末 )治疗)与DM小鼠( , ,分别)。误差线对应于扫描电镜。
3.4.2。肾小球损伤

Nephrin podocin,两个关键肾小球蛋白质形成狭缝隔膜,都在肾组织中表达下调的DM小鼠控制老鼠相比,但水平恢复paricalcitol-treated动物(图6(一))。免疫印迹分析后也获得了类似的结果,podocin水平低于DM相比控制老鼠肾脏溶菌产物( 和 ,分别 ),但在paricalcitol-treated是正常的动物( 和 ,早期和晚期治疗,分别)(数据6 (b)和6 (c))。

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图6
免疫组织化学分析podocin表达小鼠肾组织。(一)免疫组织化学(包含IHC) podocin表达小鼠肾脏部分的分析。在DM Podocin染色低控制(CON)老鼠相比,虽然早期和晚期paricalcitol治疗恢复Podocin水平。放大,×20。西方滴podocin和(b)代表β肌动蛋白的蛋白质提取小鼠肾组织。(c)量化的西方的污点。肾在DM podocin水平明显下降( )控制老鼠(相比 )( )。显著增加podocin水平观察paricalcitol-treated (DM + P(初 ),DM + P末 治疗)与DM小鼠( , ,分别)。误差线对应于扫描电镜。

同样,尽管nephrin水平降低DM小鼠( )相比之下,控制动物( ),(差别paricalcitol治疗阻止这对这些 和 ,分别为早期和晚期治疗)(图7)。总的来说,这些结果表明,paricalcitol治疗对PCT和肾小球损伤生物标志物有保护作用。

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图7
Nephrin水平在小鼠肾组织。(a)代表西方滴nephrin和GAPDH蛋白质提取小鼠肾组织。(b)量化的西方的污点。肾nephrin水平显著降低DM ( )控制老鼠(相比 )( )。Nephrin水平恢复后早期( )和后期( )paricalcitol治疗DM小鼠(相比 , ,分别)。误差线对应于扫描电镜。

4所示。讨论

虽然维生素D的renoprotective作用近年来已经被很好地记录下来了,底层保护机制仍然是难以捉摸的。在我们的研究中,我们提供了一个证据证明VDR信号在足细胞对糖尿病肾病的renoprotective活动,和足突细胞VDR至少部分介导的antifibrotic作用1、25 (OH)2D3及其类似物。更多,upregulation VDR可以恢复缝组件,nephrin, podocin受到高葡萄糖。中央机械的基础上保护似乎是高血糖引起的纤连蛋白合成的抑制作用。这里的数据报道强烈支持猜测,足细胞和PCT细胞是关键renoprotective维生素D的行为目标。

我们评估的保护作用对DN的维生素D模拟使用DBA / 2 j纯系小鼠,腹腔内注射诱导糖尿病(DM)的链脲霉素(STZ)。DBA / 2 j小鼠更容易患糖尿病肾病。

众所周知,慢性肾脏疾病患者正在遭受由于减少合成维生素D缺乏的肾脏。维生素D模拟治疗CKD患者提供了重要的生存优势,体现在改善肾脏功能。几项研究已经表明,paricalcitol补充可以减少蛋白尿CKD患者(30.,31日]。此外,它可以减少足突细胞肥大和肾小球硬化(32]。然而,paricalcitol保护肾脏的机理和防止DN的开发和进展知之甚少。paricalcitol提出数据显示,12周的治疗增加了VDR在糖尿病小鼠足细胞表达的绑定机制可以解释paricalcitol VDR及其对肾脏的保护作用[21]。

paricalcitol-treated DM小鼠的死亡率改善记录可能已经与VDR刺激老城的差别和/或直接对这些活动和抑制细胞因子的生产,积极影响生存(24,25,33,34]。此外,维生素D涉及免疫和心血管系统的生理功能和保护肾细胞完整性(33]。

探讨疗效的paricalcitol DM-associated近端肾小管损伤,我们测量villin的表达,细胞骨架的一个核心组成部分的肾上皮刷边界的PCT (35]。糖尿病大鼠肾的重要upregulation villin表达接受paricalcitol治疗表明paricalcitol可以积极地修复肾脏损伤引起的DN。在肾脏,维生素D是重要的维持足突细胞功能和结构35,36]。在这项研究中,paricalcitol治疗显著增强nephrin podocin表达,表达下调的DM感应。此外,显著增加VDR nephrin-podocin蛋白质的表达和恢复缝隔膜在paricalcitol-treated DM小鼠。这些观察结果一致与Trohatou et al .,他观察到增强的VDR表情足细胞,本地化的VDR在细胞核,和nephrin的差别high-glucose-mediated对这些基因的重大逆转,从而改善足细胞损伤在paricalcitol-treated动物(36]。同样,Chokhandre和他的同事已经证明了VDR激活paricalcitol减少肾脏足细胞的炎症和细胞凋亡在糖尿病肾病模型(17]。因此,在足细胞可以调节VDR upregulation renoprotective补充维生素D。

纤连蛋白的高表达,一个强有力的纤维发生的因素,在糖尿病小鼠与控制老鼠相比,及其paricalcitol治疗后恢复到正常水平,提供了额外的证据renoprotective paricalcitol在DM小鼠的影响。报道PAS染色结果进一步证实了这些防护paricalcitol对肾纤维化的影响。

目前的研究进行了探讨paricalcitol治疗的潜在影响在预防DN的发生和发展中STZ-induced糖尿病小鼠模型。根据提交的调查结果,paricalcitol,选择性和活性维生素D模拟,有明显的有利影响肾PCT和肾小球结构和功能,与足细胞有可能成为一个关键维生素D治疗糖尿病肾病的治疗目标。因此,糖尿病肾损伤的抢救观察到糖尿病小鼠是一个非常有说服力的证据支持的重要性足VDR在renoprotection信号。综上所述,这些数据表明足细胞作为一个关键的维生素D治疗慢性肾病的治疗目标。

5。结论

Paricalcitol可以反向的下降水平VDR, nephrin,和podocin高葡萄糖引起的,进一步证实了其对预防DN肾损伤的影响。这些结果可能会提供一个基础进一步在临床实践中合理使用paricalcitol糖尿病肾病的早期阶段,不仅患者继发性甲状旁腺功能亢进。

数据可用性

研究数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。相应的作者电子邮件(电子邮件保护)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Nakhoul Nakhoul和蒂娜Thawko贡献同样这项工作。

确认

这项研究被MIGAL支持,内部部加利利的发展,北以色列,和巴鲁克Padeh Poriya医院医学研究基金会,降低加利利,以色列。我们感谢Nadya Lisovoder和精神Atiya技术支持。