腺苷2A受体在高脂饮食诱导的周围神经病变中的作用

摘要

糖尿病周围神经病变（DPN）是一种并发症，在多达一半的2型糖尿病患者中观察到。DPN也被证明与肥胖有关。高脂饮食（HFD）影响糖代谢，糖耐量受损可导致2型糖尿病。有证据表明腺苷2A受体发挥作用（A2ARs）和信号素3A（Sema3a）DPN中的信号传导。假设了DPN中Sema3a和A2AR表达之间的联系，但对其潜在机制仍知之甚少。在本研究中，我们研究了脊髓中A2AR对Sema3a的调节及其在DPN中的功能意义。我们检测了A2ARs和Sema3a的表达，以及神经肽在1和丛蛋白A中，Sema3a的共同受体，位于HFD诱导的糖尿病动物模型的腰脊髓背角。我们的结果表明HFD失调A2AR介导的Sema3a表达，对2型糖尿病诱导的周围神经病变具有功能意义。这些观察结果可刺激临床症状学习以提高我们对这个问题的理解。

1.介绍

周围型糖尿病神经病变(DPN)是一种常见的糖尿病并发症，影响约50%的2型糖尿病患者，给患者和社会带来巨大压力[1]研究表明，高血糖通过引起全身和神经元氧化应激在DPN中起关键作用[2- - - - - -4]，临床试验也表明，即使血糖水平正常，肥胖患者也可能表现出周围神经病变的症状[5- - - - - -7］.同样，肥胖动物模型的研究也报道了肥胖动物的周围神经病变[8，9］.然而，我们对肥胖与周围神经病变之间的神经生物学机制知之甚少。

众所周知，高脂饮食(HFD)会影响糖代谢，糖耐量受损可导致2型糖尿病[10]HFD可导致大的有髓神经和小的感觉神经纤维损伤，从而导致周围神经病变[8，9，11]对HFD喂养的C57BL/6小鼠的研究显示，运动和感觉神经传导速度（NCV）、热痛觉过敏和平均树突长度减少[11］.

这些过程背后的机制可能涉及信号量的调控。信号量蛋白是一大家族膜相关和分泌蛋白，参与多种细胞过程。信号量是一种双功能信号分子，具有促进或抑制生长的作用[12]这种功能的多样性与特定受体复合物的形成有关。信号素与其受体、神经纤毛蛋白和丛蛋白一起，是负责中枢神经系统发育过程中轴突引导的复杂调节系统的组成部分[13，14］.

Sema3a是信号素家族的成员之一在活的有机体内作为胚胎背根神经节(DRG)神经元外周投射的排斥引导线索。Sema3a与生长锥丝状叶尖上的Neuropilin 1高亲和力结合。虽然Sema3a的作用需要Neuropilin 1，但它不能将Sema3a信号传递到生长锥内部。相反，Sema3a/Neuropilin 1复合物与生长锥表面的另一种跨膜蛋白丛蛋白相互作用。丛状蛋白细胞内区域负责启动信号转导级联，导致生长锥坍塌、轴突排斥或生长锥转动[15］.

反过来，Sema3a也通过其他信号通路受到调节。研究表明，该蛋白的表达可以通过刺激A2腺苷受体(A2ARs)来调节[16]A2ARs被确定为HFD诱导的2型糖尿病特征的重要调节因子。据报道，在对照组小鼠中，给予HFD 16周可显著上调A2bAR的表达，而在这种饮食条件下，A2bAR基因敲除小鼠出现更大的肥胖和2型糖尿病特征[17］.

A2ARs被证明参与控制周围神经损伤引起的神经病理性疼痛，其特征是显著降低机械性痛觉超敏，抑制热痛觉过敏和痛觉超敏[18］.研究发现腺苷A2A受体的下调与高血压糖尿病肾病的发生有关[19]及糖尿病性视网膜病变[20.］.

重要的是，已经在人类中研究了DPN中A2ARs上调的可能性。例如，BVT115959，一种从海洋天然产物中提取的A2ARs激动剂[21，被证明有效 糖尿病神经病理性疼痛临床试验中的口服日剂量[22］.由于该公司停止了对小分子的研究，这个特殊的临床试验结束了。然而，初步研究结果表明，选择性和强效的A2AR激动剂在DPN治疗中具有很高的潜力。最近的研究表明，刺激A2ARs可以增加Sema3a的表达[16］.既往研究表明Sema3a可减轻神经生长因子- (NGF-)诱导的神经性疼痛模型脊髓痛觉过敏[23］.基于这些发现，我们推测A2ARs可能通过调控脊髓Sema3a在DPN的发生发展中发挥重要作用。

在目前的工作中，我们使用HFD诱导的糖尿病动物模型研究了脊髓中A2A受体刺激和Sema3a水平在周围神经病变中的作用。我们还研究了腰脊髓背角中A2ARs、Sema3a、神经纤毛蛋白1和丛蛋白A的表达。最后，我们研究了repea的作用ted腹腔注射选择性A2ARs激动剂SCH58261对HFD喂养小鼠周围神经病变的影响。

2.材料和方法

2．1．动物

雄性C57BL/6J小鼠从吉林大学实验动物中心获得，并获得食物和水随意．本研究涉及动物，经吉林大学第二医院机构动物护理使用委员会批准。严格遵守《实验动物护理和使用指南》(生命科学委员会实验动物资源研究所，2011)的所有指导方针。

2．2．高脂肪饮食治疗

我们使用的方案与之前的研究相似[24]喂养体重在23-25磅之间的老鼠 g八周时，用正常小鼠食物（中国上海斯拉康）和/或高脂肪饮食（D12330配方奶粉，58 在一组单独的高脂肪饮食-（HFD-）处理的小鼠中，载体（10%二甲基亚砜、40%聚乙二醇300、5%吐温-80和45%生理盐水）或SCH58261处理（1或10 从第24周开始，每天给药一次，为期一周。

2.3.血糖和体重监测器

每周进行血糖监测和体重测量（葡萄糖诊断试剂；Kinbio Tech，中国上海）[8，25，26］.小鼠禁食3小时后从尾部采血。在我们的研究中，高脂饮食24周后，小鼠的血糖在8.1-9.0 mmol/l左右。这些发现与之前关于高脂肪饮食导致的前驱糖尿病和肥胖的研究一致。

２.４.神经传导速度的测量

使用批准的蒸发器和清除系统用异氟烷麻醉动物。将侧翼用乙炔处理，并使侧翼的0.5cm长切口暴露坐骨神经，然后通过钝性解剖分离下面的肌肉组织。将热敏电阻探针邻近神经置入，用皮肤夹闭合伤口，定位直肠直肠探针。直肠温度通过热垫在37℃下保持。使用连接到温度调节器的热灯维持神经和环境温度，当热敏电阻探头检测到37°C以上的温度时，可以自动关闭热源。加热灯距离动物的2英尺（60厘米）不允许，动物的头部和腹部覆盖着热反射材料。刺激动物的神经（200 mV，50 μ每2秒持续时间方波刺激 s） 使用放置在坐骨切迹处的细针电极。用两个细针电极记录骨间肌诱发肌电图。然后，取下热敏电阻探针；用伤口夹闭合皮肤切口，并涂上倍他定，然后将动物从麻醉剂中取出，然后在温度控制室中进行监测。醒来后，观察动物5小时 在它们返回常规笼子之前的分钟。手术用了不到5分钟 min，观察皮肤伤口在1周内愈合，允许在每次研究过程中每隔一周重复测量。

2.5. 行为测试

所有试验都是在正常饮食或高脂饮食24周的小鼠身上进行的。小鼠首先适应了一种行为器官。在测试期间，小鼠被置于行为装置中30分钟以适应环境。采用von Frey法进行触觉反应测试。具体来说，小鼠被放置在一个透明塑料笼子里的金属丝网上，允许小鼠的后爪进入。为了评估周围神经病变，然后使用von Frey单丝评估机械停药阈值。每个后爪的足底中部表面垂直于von Frey丝序列(0.02,0.04,0.07,0.16,0.5,0.6,1.0,1.4 g力)(Stoelting, Wood Dale, IL, USA)。纤维扣接时间约为2-3秒，间隔约为5分钟。实验采用0.16 g力von Frey灯丝进行。这种积极的反应被描述为对刺激的后动力退却。 Whenever a positive stimulus response was given, the next lowest of the von Frey filaments were used, and the next higher filaments was applied when a negative response occurred. After the first reaction measurement, the test consisted of five further stimuli. In order to establish a 50% withdrawal threshold, the up-down approach was used [27，28］.

根据von Frey的实验，小鼠的热敏感性通过热板测试进行评估。具体来说，这些动物被放置在55°C的热板上，并用摄像机记录它们的行为。潜伏期是计算舔前后爪。审查员对实验环境一无所知，进行了所有的计算。

2.6.蛋白质印迹

用4％异氟醚麻醉动物并迅速斩首。收集整个腰骶部脊髓部分。将组织在含有50mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA，150mM NaCl，0.5％Triton X-100和全蛋白酶抑制剂鸡尾酒的裂解缓冲液中均化。将均化的组织样品在冰上温育30分钟。将样品以15,000rpm（Eppendorf 5415c，上海，中国）以4°C离心，并储存在-80°C。为了确定蛋白质水平，使用BCA蛋白质测定试剂盒（ABCAM，上海，中国）。蛋白质样品（50 μg)随后在8%聚丙烯酰胺凝胶(Tris-HCl)上分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, Billerica, MA, USA)，室温下110 V 1 h。膜与一抗在4°C孵育过夜。我们使用的主要抗体包括抗信号素3A抗体、抗神经pilin 1抗体、抗腺苷受体A2A抗体和抗丛状蛋白A1抗体(Abcam，上海，中国)。洗涤后，用HRP-(辣根过氧化物酶-)连接的二抗(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)在室温下孵育膜2小时。使用电化学发光试剂盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)产生发光信号，并通过柯达x射线胶片曝光(X-OMAT;柯达,中国上海)。对膜进行冲洗，进行反探针β-actin抗体(1:10 00,Santa Cruz, Shanghai, China)采用NIH ImageJ软件用密度仪定量蛋白质水平。

2.7。表皮内神经纤维密度定量

皮肤组织保存18至24小时后 h在Zamboni的固定液中，在20%蔗糖中冷冻过夜，将其嵌入OCT（最佳切割温度）化合物中并切割成20 μm（小鼠足垫）低温恒温器切片（徕卡微系统公司CM 1850，德国）。随机选择每个组织的三个切片，并用兔抗蛋白9.5（PGP 9.5）进行免疫染色。在光学显微镜下，在放大倍数为200倍的情况下，对源自和穿过皮肤真皮-表皮连接处的PGP 9.5阳性纤维在每个节段的三个区域进行定量。在表皮内，次级分支和碎片未计数。评估切片长度，并将线性表皮神经支配密度计算为表皮内神经纤维密度（IENFD）（表示为IENF/mm）[29］.

2.8。统计分析

GraphPad Prism 5.0（GraphPad软件，San Diego，CA，USA）用于所有统计分析。提供所有量化数据作为 ．的 -测试用于分析行为测试。给药后使用方差分析（ANOVA）评估行为数据。在主要ANOVA效应后使用Tukey的事后测试进行多重比较。显著性设置为 ．

结果

3.1. HFD治疗对体重、血糖水平和食物摄入的影响

监测体重，血糖和膳食摄入正常饮食和HFD的小鼠（表1)。一般来说，随着时间的推移，体重会增加。HFD第一周后，与正常饮食喂养的小鼠相比，这些小鼠的体重和食物摄入量略有增加，但血糖没有变化。与正常饮食喂养的小鼠相比，HFD小鼠在16或24周后的体重增加更大。平均一天的食物摄入HFD小鼠与正常饮食小鼠相比，HFD小鼠的d消耗量也明显高于正常对照组，另外，HFD喂养小鼠在HFD 16周和24周时血糖水平高于正常对照组。

3.2。HFD治疗诱导的糖尿病外周神经病变

在接受正常饮食或HFD 24周的小鼠中进行触觉超敏和热痛觉减退试验。与正常饮食小鼠相比，在HFD喂养的小鼠中观察到触觉超敏和热痛觉减退( -测试中, ；数字1)我们还测量了神经传导速度，发现HFD喂养的小鼠的神经传导速度降低（图1)．

３．３．HFD对脊髓A2ARs、Sema3a、Neuropilin 1和Plexin A表达的影响

与正常饮食相比，HFD在24周时降低了脊髓中A2AR的表达。与正常饮食相比，HFD在24周时也降低了脊髓中Sema3a的表达（图2（a）)此外，与正常饮食相比，HFD 24周后神经纤毛蛋白1和丛蛋白A的表达水平也降低（图2（b）和2（c）)．最后，与正常饮食相比，高脂饮食24周后脊髓中A2AR的表达也降低了(图)2（d）)．

3．4．IP给药对hfd诱导的周围神经病变的影响

接受媒介物IP注射的小鼠在HFD 24周后显示出较慢的神经传导速度（图3（a）)．然而，每天一次重复注射10 mg/kg的SCH58261(而不是1 mg/kg的SCH58261)，与常规注射相比，提高了神经传导速度(图)3（a）)此外，这种现象与小鼠脊髓中Sema3a表达增强有关（图3（b）)．

3.5。SCH58261对IENFD的知识产权影响的影响

在HFD 24周后，接受IP注射载体的小鼠IENFD降低(图)4)．然而，与车辆相比，每天重复注射10 mg/kg SCH58261(而不是1 mg/kg SCH58261)提高了IENFD(图)4)．

4.讨论

我们对高脂饮食诱导的周围神经病变的A2AR检查显示，使用高脂饮食24周的时间足以使动物产生触觉异常痛和热痛觉减退。这些观察结果与之前发表的数据一致[26］.我们进行了一个有趣的观察，即HFD引起的周围神经病变与Sema3a，神经毛素素1，plexina和脊髓A2ar表达的降低强烈相关。最后，发现重复的选择性A2AR激动剂SCH58261敏感这些效果。这些结果清楚地表明A2AR介导的Sema3a信号传导在肥胖症相关的外周神经病变中的作用。

众所周知，大部分神经排斥因子(包括Sema3a)和神经延伸因子(包括神经生长因子)是由角质形成细胞产生的，以调节表皮神经支配[30.- - - - - -34］.我们的研究再次证实Sema3a也在脊髓中表达。糖尿病周围神经病变以小纤维减少为特征，与高血糖率密切相关[35，36]研究表明，慢性高血糖与角质形成细胞中Sema3a的mRNA和蛋白质表达增加有关[37].与这些结果相反，我们观察到糖尿病小鼠脊髓中的Sema3a表达降低。虽然我们不清楚Sema3a表达矛盾的原因，但我们的结果表明，Sema3a对糖尿病小鼠的神经病理性疼痛行为具有抑制作用。Sema3a与疼痛之间的联系是在几项研究中讨论。在角膜损伤模型中[38]，通过基因转移引入的Sema3a过度表达抑制CGRP阳性神经末梢和机械刺激超敏反应。中枢神经系统中受损的AMPK-CGRP信号被证明有助于增强HFD诱导的肥胖大鼠的神经病理性疼痛[39]此外，在NGF诱导的神经病理性疼痛模型中，通过接种表达Sema3a的腺病毒过度表达Sema3a，可诱导在背角发芽的CGRP阳性组织[23]然而，这些研究和我们的报告在使用的神经损伤模型和对实验结果的解释方面存在显著差异。

在各种疾病中，如特应性皮炎（AD），表皮Sema3a可能与IENFD密切相关[33，34，40］.补骨脂素和紫外线A辐射疗法没有报道增强Sema3a的表皮浓度，但也有报道减少AD患者皮肤中的IENFD [33］.此外，Sema3a替代疗法使AD神经支配过度正常化[40］.最近的一项研究表明，在人类患者和模型动物的表皮的Suprabasal层中，SEMA3A水平显着增加，具有糖尿病外周神经病变的模型动物[37］.在雷帕霉素治疗之后，Sema3a的上调伴随着小纤维数量的升高，而不会影响糖尿病大鼠的高血糖症。其他研究发现SEMA3A可以抑制DRG轴突生长体外［31，41］.Sema3a的表达增加可能通过将生长锥体连接到Nuropilin 1 / plexin仍然在成年DRG细胞的小纤维中表达的受体复合物[42］.这些发现允许假设，角化细胞产生的Sema3a表达的增加可能与糖尿病周围神经病变中观察到的小纤维数量的减少有关，脊髓中Sema3a表达的减少促进了常在糖尿病患者中看到的神经性疼痛。

5.结论

基于本文提出的结果，我们可以合理地假设，暴露于HFD可导致a2ar调节的脊髓Sema3a表达减少。A2AR的这种调节似乎在周围神经病变的最终发展中发挥了重要作用。此外，Sema3a信号异常与2型糖尿病相关的周围神经病变有关。2型糖尿病的病例正在上升，全球有很大比例的人口要么患有2型糖尿病，要么容易发展为2型糖尿病。在此背景下，进一步研究A2AR与Sema3a之间的相互作用和相互关系具有重要意义。破译潜在机制将有助于更好地了解糖尿病的进展，并为治疗干预开辟新的途径，特别是在周围神经病变等并发症的情况下。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

李吉和刘焕秋对这部作品贡献相当。

致谢

吉林省科学技术厅资助项目(批准号:3D5195714428)。

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