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糖尿病研究期刊》的研究
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糖尿病研究期刊》的研究/2020年/文章

研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 3426902 | https://doi.org/10.1155/2020/3426902

Yang Li Xude Wang宝玉,Haozhen Wang学界,滋阴,14路,Bing高, ”3β-Hydroxysteroid -Δ24还原酶(DHCR24)保护胰腺β从内质网应激细胞凋亡细胞清除过多的细胞内活性氧”,糖尿病研究期刊》的研究, 卷。2020年, 文章的ID3426902, 11 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/3426902

3β-Hydroxysteroid -Δ24还原酶(DHCR24)保护胰腺β从内质网应激细胞凋亡细胞清除过多的细胞内活性氧

杨李,1 Xude王,1 宝玉杨,1 Haozhen王,1 中国学界马,1 滋阴陆,1 14路,1 和 必应高2

1生物化学与分子生物学、生命科学学院,辽宁大学,沈阳110036年,中国

2细胞生物学和遗传学、沈阳医学院,110034年沈阳,中国

学术编辑器:作为礼尚往来领导
收到了 2020年3月26日
接受 2020年6月17日
发表 2020年7月17日

文摘

有越来越多的证据表明,细胞凋亡诱导的内质网(ER)压力在胰腺中起着关键作用β细胞功能障碍和胰岛素抵抗。3β-Hydroxysteroid -Δ24还原酶(DHCR24)是一种多功能酶位于内质网(ER),这是为了保护神经元细胞ER应激细胞凋亡。然而,DHCR24在2型糖尿病中的作用只是不完全理解为止。在本研究中,我们通过衣霉素诱导ER应激(TM)治疗和显示,感染与Ad-DHCR24-myc MIN6细胞呈现这些细胞抵抗caspase-3-mediated TM,诱导细胞凋亡,细胞转染siRNAs瞄准DHCR24对TM更敏感。免疫印迹分析表明TM治疗诱导upregulation毕普的蛋白质含量在两个细胞感染Ad-LacZ(对照组)和Ad-DHCR24-myc,表明大量的ER应激。细胞感染Ad-LacZ展出的快速和强大的激活ATF6和p38 TM曝光后达到3 h。相反,细胞感染Ad-DHCR24-myc显示更高和更持续的ATF6和毕普比控制细胞的激活。DHCR24过度也抑制细胞内活性氧(ROS)的产生ER应激和保护引起的细胞凋亡引起的治疗胆固醇和过氧化氢。总之,这些数据表明,第一次DHCR24保护胰腺β细胞ER应激诱导细胞凋亡。

1。介绍

2型糖尿病(T2D)是一种代谢紊乱与许多相关的风险因素,包括在其他遗传因素,环境暴露,肥胖和年龄1,2]。它的特点是高血糖由于胰岛素分泌不足,引起体内胰腺的功能障碍β细胞和胰岛素敏感性降低,引起胰岛素抵抗[3]。T2D是一种慢性终生的疾病和一些目前临床治疗方案。

在T2D,后发生高血糖往往β细胞逐渐无法弥补胰岛素抵抗,β细胞T2D的发病机制的失败是一个至关重要的因素(4,5]。T2D患者胰腺组织,减少细胞群已经观察到(6,7,有越来越多的证据表明,细胞凋亡是一个重要的机制β细胞质量损失(6- - - - - -8]。因此,治疗目标和衰减的方法β细胞凋亡可能是T2D的临床管理的有效方法。

胰岛素是在内质网(ER)合成,膜间的关键,新合成分泌和膜蛋白折叠,装配和运输。在正常情况下,ER蛋白质积累和折叠之间保持平衡状态的能力。胰腺β细胞有高度发达的ER满足高要求的胰岛素分泌,这是至关重要的β细胞保持ER内稳态(5]。然而,一些病理过程,如长时间胰岛素抵抗[4),gluco / lipotoxicity [9),或胰岛淀粉样蛋白的形成10),可能会扰乱体内平衡,导致ER应激的细胞应激反应。ER应激,一个名为展开蛋白质反应的适应性反应(UPR)被激活,最初它是有益的。然而,持续UPR触发凋亡在缺乏有效的干预措施(5]。

ER应激细胞凋亡已确认原因β细胞功能障碍和胰岛素抵抗11]。研究者发现ER stress-specific切/ GADD153凋亡信号通路被激活在MIN6细胞暴露于高浓度的脂质以及人类T2D的胰腺部分科目(12]。此外,它已被证明,ER应激导致胰岛素受体信号的抑制和缺乏Xbox-binding蛋白1 (XBP-1)转录因子调控UPR在ER应激反应,并导致小鼠的胰岛素抵抗[13]。积累的或错误折叠的蛋白质在ER应激导致过多的活性氧(ROS)的产生,引发氧化应激。胰腺β细胞是高度敏感的ROS,过度的细胞内活性氧导致β细胞死亡(14,15]。此外,ROS水平上升有关β细胞功能障碍在T2D [16]。因此,能够诱导阻力ER和氧化应激是一种常见的标准T2D药物筛选,,例如,二甲双胍,知名T2D药物,作用于β通过减轻氧化应激和细胞ER应激(17]。

3β-Hydroxysteroid -Δ24还原酶(DHCR24)是一种多功能酶位于许多组织的ER (18]。除了众所周知的作用,胆固醇生物合成,DHCR24作为综合抗凋亡蛋白,其抗氧化能力密切相关(19- - - - - -22]。在以前的研究中,我们报告说,DHCR24施加ROS-scavenging效应,可以减弱小鼠神经元的凋亡N2A细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(mef) ER应激和氧化应激引起的22- - - - - -24]。T2D的全基因组关联研究已经隐含一个协会DHCR24脂类代谢,肥胖,T2D [25,26]。然而,在T2D DHCR24的作用尚未阐明。澄清DHCR24在胰腺的功能β细胞,我们评估的后果DHCR24超表达在小鼠胰腺MIN6细胞暴露于ER应激,探索潜在的潜在保护功能的分子机制。这里,我们第一次证明ER应激后,DHCR24过度预防胰腺癌β通过细胞凋亡过度活性氧的清除。这些发现提供了新的T2D的潜在治疗方法治疗。

2。材料和方法

2.1。细胞系和试剂

MIN6细胞(日本大阪,大阪大学捐赠)孵化在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM /高葡萄糖)补充10%胎牛血清在37°C在潮湿的气氛中有5%的公司2。100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素也添加到培养基中。衣霉素(TM)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)和溶解在DMSO溶液。衣霉素是一种常用的ER应激诱导物的行为通过抑制N-linked糖基化。细胞暴露于0.5μ克/毫升,1μg / ml TM、胆固醇(250 x) (Gibco,宏伟的岛,纽约,美国),和1毫米H2O224 h。相差显微镜(IMT-2、奥林巴斯、东京、日本)是用于采集的细胞图像。

2.2。腺病毒感染

原癌基因的重组腺病毒表达DHCR24标记抗原决定基(Ad-DHCR24-myc)本出版物中使用构造之前(23]。作为一个消极的控制,我们使用一种腺病毒表达β牛乳糖(Ad-LacZ)。MIN6细胞感染Ad-DHCR24-myc和Ad-LacZ感染复数(MOI) 50微升/细胞48 h,接着用TM。采用分析与抗体染色对原癌基因被用来确定感染效率。

2.3。siRNA干扰

MIN6细胞转染和小干扰rna的目标DHCR24(siDHCR24)和负控制核(siControl)从Dharmacon购买(拉斐特,美国)DharmaFECT 1 (Dharmacon)根据制造商的指示。的目标序列siDHCR24以前发表的(27]。使用半定量rt - pcr RNA干扰效率测量。

2.4。粘附细胞数量和细胞凋亡检测分析

我们用台盼蓝染色(Beyotime、上海、中国)分析TM曝光后粘附细胞数量,正如前面发表(22]。细胞图像,使用相差显微镜。按照制造商的指示,我们使用TUNEL检测细胞凋亡的方法原位细胞凋亡检测设备(豆类,大津,日本)。

2.5。采用免疫(IC)分析

集成电路进行分析(如前所述22]。短暂,细胞在盖玻片固定和封锁,其次是孵化用鼠标anti-myc抗体(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)或兔子anti-cleaved caspase-3抗体(细胞信号,贝弗利,MA)在一夜之间在4°C。二次抗体的细胞培养老鼠或兔子免疫球蛋白g共轭Alexa萤石488/568(分子探针,尤金或)1 h的排斥下光。使用数字荧光显微镜微观图像获得(BIOREVO bz - 9000,日本基恩士,大阪,日本)。与ImageJ光密度分析软件。

2.6。免疫印迹分析

细胞总蛋白的提取与里帕裂解缓冲(Beyotime、上海、中国)。50微克(50μg)总蛋白质的溶解产物分离使用10% sds - page和转移到聚偏二氟乙烯膜(美国Billerica的微孔,MA),阻止了5%脱脂牛奶在室温下1 h。膜是孵化主要抗体在一夜之间在4°C和随后孵化与辣根peroxidase-labeled二级抗体兔子/鼠标免疫球蛋白(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下1 h。我们使用以下主要抗体:兔子anti-actin (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),鼠标anti-Bip / GRP78 (BD生物科学,贝德福德,MA),鼠标anti-myc(圣克鲁斯、钙、美国),鼠标anti-ATF6 / ATF6裂解,和兔子anti-phospho-p38 MAPK (T180 / Y182)(细胞信号,贝弗利,MA)。高度敏感的目标乐队可视化ECL化学发光工具包(Beyotime、上海、中国)。ImageJ软件被用于光密度分析。

2.7。检测细胞内ROS

我们发现细胞内ROS使用2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorofluorescin (DCFHDA;分子探针),这是一个ROS-sensitive荧光染料,如前所述[22]。短暂,细胞玻璃盖玻片固定TM曝光之后,紧随其后的是孵化20μM DCFHDA PBS。我们捕获的荧光DCFHDA使用数字荧光显微镜。ImageJ软件被用来检测荧光强度。

2.8。细胞内胆固醇测量

MIN6细胞使胰蛋白酶化和收集在1.5毫升埃普多夫管。一个整除的细胞用于细胞计数,然后剩下的细胞受到脂质提取基于布莱和戴尔(描述的方法28]。的氯仿阶段Bligh-Dyer提取被转移到一个新的管和风干消除氯仿。样品随后被放置在一个真空30分钟去除任何残留有机溶剂。的脂质干终于溶解胆固醇测定缓冲区。3β-Hydroxysterol确定总甾醇含量,与酶检测胆固醇测定工具包(罗氏诊断,曼海姆,德国)。

2.9。实时PCR半定量的

DHCR24的mRNA水平是衡量半定量的实时PCR siRNAs感染后24小时。短暂,从细胞总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)和反向转录成cDNA使用QuantiNova逆转录工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。随后使用以下PCR引物进行PCR反应,使用3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内生参考基因:DHCR24意义:5 - - - - - -GGCACGGCATAGAACAGGTC-3 ,DHCR24反义:5 - - - - - -CACAGGCATCGAGTCATCGT-3 ,GAPDH意义:5 - - - - - -CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 。和GAPDH反义:5 - - - - - -GGGTCTTACTCCTTGGAGGC-3 。

2.10。统计分析

每个实验包括至少三个独立的复制。统计分析是使用方差分析和Bonferroni多个进行的 - - - - - -测试。一个 小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。Upregulation DHCR24,由腺病毒进行靶向治疗,预防ER应激MIN6细胞死亡

调查DHCR24于MIN6细胞的影响,我们用Ad-DHCR24-myc MIN6细胞感染或Ad-LacZ(作为一个消极的控制)。腺病毒感染的效率使用anti-myc IC分析证实了抗体染色。我们观察到近100%的感染效率Ad-DHCR24-myc MIN6细胞并感染证实DHCR24-myc主要是出现在感染细胞的细胞质(图1(一))。

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图1
DHCR24过度保护MIN6细胞细胞死亡引起的TM曝光。(一)采用(IC)分析对原癌基因(绿色荧光信号)是用来确定Ad-DHCR24-myc的转导效率。酒吧,100μm。(b)固醇含量MIN6细胞测定感染后48 h表明腺病毒(50微升/单元)。 ( )。(c) MIN6细胞图像,用相差显微镜后24 h TM曝光(0、0.5和1μg / ml)。酒吧,100μm。(d)数量的细胞的贴壁细胞百分数表示Ad-LacZ组0μg / ml TM曝光。 ( ); 与Ad-LacZ。

期间作为DHCR24催化desmosterol胆固醇胆固醇生物合成的最后一步,我们接下来研究了细胞内胆固醇水平是否受感染Ad-LacZ或Ad-DHCR24-myc。胆固醇水平没有显著差异的Ad-DHCR24-myc细胞相比,控制细胞(图1 (b)),这表明过度DHCR24没有改变细胞内胆固醇水平。这可能是由于细胞内胆固醇的浓度是严格监管,实现其止血,因为有一个细胞外的血清胆固醇供给细胞的培养基。

在目前的研究中,利用TM诱导ER应激。我们发现大多数Ad-DHCR24-myc MIN6细胞存活了至少24 h后1组μg / ml TM曝光,而Ad-LacZ组细胞的数量减少剂量依赖性的方式与TM浓度(增加数据1 (c)和1 (d))。此外,失去细胞的数量在这组明显高于Ad-DHCR24-myc组,暗示的upregulation DHCR24 ER应激死亡的胰腺会增加阻力β细胞。

3.2。过度的DHCR24抑制Caspase-3-Mediated细胞凋亡

Caspase-3是合成的酶原没有活动和裂解成活性片段对凋亡触发器通过self-proteolysis和/或劈理等上游蛋白酶caspase-8, caspase-9, caspase-10 [8,29日,30.]。因此,分析激活(裂解)caspase-3识别细胞凋亡是一种常见的方法。评估是否TM-induced MIN6细胞死亡是由于细胞凋亡,细胞adenovirus-infected播种在盖玻片进行了分析通过IC anti-cleaved caspase-3抗体染色。如数据所示2(一个)和2 (b)与强烈的绿色荧光信号,细胞Ad-LacZ组明显比那些Ad-DHCR24-myc组,表明激活caspase-3 DHCR24被过度抑制。这个结果暗示DHCR24超表达的胰腺TM-induced细胞凋亡的发生和发展β细胞。同样,TUNEL分析表明TM(1后24小时μg / ml)治疗,约有80%的Ad-LacZ-infected细胞凋亡,但Ad-DHCR24-myc-infected细胞更能抵抗TM-induced细胞凋亡(数字2 (c)和2 (d))。综上所述,这些数据表明DHCR24可以抑制caspase-3-mediated胰腺细胞凋亡β细胞ER应激条件下。

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图2
MIN6细胞诱导的细胞凋亡抑制了TM DHCR24超表达。(一)代表荧光图像的裂解caspase-3(绿色)是通过集成电路分析TM曝光后24小时。规模的酒吧,50μm。(b)的相对荧光强度裂解caspase-3 ImageJ软件进行了分析。 ( ); 与Ad-LacZ。(c) MIN6细胞的细胞凋亡被TUNEL分析TM治疗后24小时。绿色荧光信号代表TUNEL-positive细胞。酒吧,100μm。(d) TUNEL-positive细胞数量计算TUNEL-positive细胞的百分比数字贴壁细胞在相同的领域。 ( ); 与Ad-LacZ。
3.3。Upregulation DHCR24强化ATF6激活和抑制p38在UPR MIN6细胞磷酸化

DHCR24诱导的超表达Ad-DHCR24-myc MIN6细胞也证明了免疫印迹分析如图3(一个)。毕普(免疫球蛋白重链结合蛋白,也称为Grp78)是一个ER伴侣帮助蛋白质折叠、组装、和传输正确,调节和激活在ER应激(12]。因此,毕普ER应激的可以作为指标。用免疫印迹,我们发现交响乐团证明DHCR24诱导的超表达Ad-DHCR24-myc和毕普水平逐步增加MIN6细胞TM治疗后,表明TM诱导ER应激(数字3(一个)和3 (b))。Ad-DHCR24-myc组的细胞表现出更高的表达水平毕普比控制的细胞,尤其是在TM 48 h后曝光,表明DHCR24超表达促进了毕普的upregulation提高蛋白质折叠能力,防止蛋白质积累,从而减轻引起ER-stress TM。

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图3
UPR-related信号通路被免疫印迹分析TM治疗后检测。(一)代表西方墨迹显示原癌基因的表达,毕普p-p38, ATF6,裂解ATF6 MIN6细胞TM治疗后。这些蛋白质的水平是归一化到肌动蛋白的水平。(b, c)毕普的水平,p-p38, ATF6,裂解ATF6计算最大比例的水平-控制(Ad-LacZ)组。 ( ); 与Ad-LacZ。

接下来,我们进一步探讨DHCR24在UPR信号通路的作用通过调查ATF6和p38的激活。如数据所示3(一个)和3 (c),ATF6表情迅速增加Ad-LacZ-infected细胞和TM曝光后三个小时达到高峰。相反,在Ad-DHCR24-myc集团ATF6表达逐渐增加TM暴露的时间(数字3(一个)和3 (c))。TM表达后6小时,ATF6的水平,包括ATF6裂解,明显高于Ad-DHCR24-myc组相比Ad-LacZ组。相反,p38的激活被显著地抑制感染Ad-DHCR24-myc相比控制腺病毒。这些数据表明,DHCR24过度可能缓解ER应激通过提高ATF6的激活和抑制p38的激活。

3.4。过度的DHCR24食过度引起的细胞内ROS TM MIN6细胞

有一个ER应激和氧化应激之间的关系密切,它已经表明,一些抗氧化剂可以降低ER应激(31日- - - - - -33]。DHCR24,作为一种抗氧化剂,已被证实对ER有保护作用和氧化应激,衰减神经元凋亡通过清除细胞内ROS ER应激条件下(22]。因此,我们进行了类似的实验调查是否adenovirus-driven MIN6细胞DHCR24可以清除ROS的过度表达,在胰腺积累β细胞在ER应激。如数据所示4(一)和4 (b)使用荧光探针,通过评估细胞内ROS水平DCFHDA,我们观察到细胞感染Ad-LacZ TM治疗后明显表现出更高水平的荧光与基线相比,表明TM暴露诱导细胞内活性氧的生成。相反,较弱的荧光信号检测在Ad-DHCR24-infected细胞,表明DHCR24超表达能够缓解ER应激引起的氧化环境。

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图4
过度的细胞内ROS被过度的DHCR24回收。(一)细胞内ROS的荧光染料DCFHDA检测到应用程序。酒吧,50μm。(b)为代表的细胞内ROS水平的相对荧光DCF (2 ,7 - - - - - -二氯荧光素)。 ( )。 与水平0 h TM治疗后。 与Ad-LacZ。
3.5。Upregulation DHCR24保护MIN6细胞对氧化压力诱导细胞凋亡

氧化应激在胰腺细胞凋亡起着重要的作用β细胞。先前的研究已经证实,胆固醇和H2O2MIN6细胞氧化应激诱导细胞凋亡,抗氧化剂治疗可以逆转(8,34]。因此,探讨DHCR24能否赋予抵抗氧化压力诱导细胞凋亡,我们应用胆固醇和H2O2MIN6细胞诱导的氧化应激和量化细胞凋亡。如图5,治疗胆固醇和H2O2诱导细胞的一个明显的损失Ad-LacZ组。感染Ad-DHCR24-myc贴壁细胞数量明显增加暴露于胆固醇和H2O2,表明upregulation DHCR24 MIN6细胞对细胞凋亡引起的氧化应激的保护。


图5
MIN6细胞凋亡诱导胆固醇和H2O2被过度抑制DHCR24。MIN6细胞暴露于胆固醇(250×稀释)和H2O2(1毫米)48 h postadenovirus感染。细胞的粘附细胞数量是按照百分比计算感染Ad-LacZ对照组。 ( ); 与Ad-LacZ。
3.6。Downregulation内生DHCR24促进细胞凋亡的MIN6细胞ER应激条件下

最后,我们检查的影响内源性DHCR24 MIN6细胞ER应激条件下用siRNA干扰。我们使用半定量rt - pcr证实siDHCR24转导效率。细胞转染siDHCR24显示DHCR24 mRNA水平差别很大对这些(数据6(一)和6 (b)小干扰RNA转染)相比,细胞没有或细胞转染siControl RNA,证明siDHCR24成功抑制MIN6细胞内源性DHCR24 mRNA的表达。没有TM治疗,转染细胞与siControl或siDHCR24对细胞生存能力没有明显的影响。然而,TM曝光后24小时,细胞转染对细胞凋亡与siDHCR24更敏感,表现出一种独特的细胞损失比没有转染的细胞和细胞转染siControl(数字6 (c)和6 (d)的差别),表明对这些内生DHCR24减少MIN6细胞的能力抵抗ER应激诱导细胞凋亡。这些结果进一步表明,DHCR24能够保护胰腺β细胞ER应激细胞凋亡。

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图6
Downregulation内生DHCR24促进MIN6细胞凋亡引起的ER应激。(a)的mRNA水平DHCR24 MIN6细胞被感染后的半定量rt - pcr测定siControl和siDHCR24。(b)的相对mRNA水平DHCR24规范化GAPDH和计算比例的水平在si(-)组。 ( ); 与si(-)或siControl。(c)的图像MIN6细胞被感染后用相差显微镜siControl和siDHCR24接着用TM 24 h。酒吧,100μm。(d)细胞的粘附细胞数量计算百分比在si(-)组(0 h TM治疗后。 ( ); 与si(-)或siControl。

4所示。讨论

ER应激胰腺的细胞凋亡中发挥着关键作用β在T2D细胞,保护胰腺β细胞与细胞凋亡是一个有吸引力的战略T2D的预防和治疗。在当前的研究中,我们发现DHCR24过度保护MIN6细胞对细胞凋亡引起的ER应激通过增强毕普表达水平通过增强作用ATF6 p38激活的激活和抑制。MIN6细胞的凋亡作用DHCR24可能密切相关,其能力清除过多的细胞内ROS以来特别是DHCR24超表达可以显著抑制TM-induced活性氧积累和减少MIN6细胞氧化应激引起的损失。这些发现表明,DHCR24可以考虑候选人T2D药物开发的目标。

有越来越多的证据广泛凋亡DHCR24的函数。DHCR24被发现在人类的大脑Greeve等人,最初命名为seladin-1(1)选择性阿尔茨海默病指标[20.]。DHCR24显著下调在大脑神经元脆弱地区的广告,和超表达DHCR24保护神经细胞在体外(PC12细胞和H4细胞)对β毒性和氧化应激。在先前的研究中,我们证明了,第一次DHCR24过度保护神经元N2A对ER压力造成了细胞凋亡(22]。综上所述,这些研究证明DHCR24的神经保护作用。此外,它已证实DHCR24保护mef H诱导细胞凋亡2O2并通过清除细胞内ROS ER应激(23]。最后,凋亡活性DHCR24也反映在其异常高表达在肿瘤组织18,35,36),研究表明,DHCR24可以用作贫困癌症患者临床病理特征的指标(37]。在这里,我们描述第一次DHCR24在胰腺的抗凋亡作用β细胞(数据1,2和6),扩大凋亡DHCR24活动的作用。

胰腺β细胞是人体的一些最敏感的细胞ER应激由于胰岛素合成(ER的至关重要5]。UPR是最早的ER应激反应,主要是通过平移衰减特征,upregulation ER的伴护蛋白质错误折叠蛋白质的蛋白酶体降解。长期未解决的压力导致从自适应转换不适应或proapoptotic反应,通常与病理状态(38]。女士等人所描述的sXBP1显著调节在高脂饮食的前驱糖尿病的阶段——美联储(HFD)小鼠模型,表明UPR应答可以观察到即使在相对温和的膳食压力。一旦HFD-fed高血糖小鼠的进步,ATF6的表达,一个激活转录因子导致ER的表达监护人减轻压力,显著降低,暗示一个不成功的响应β细胞UPR弥补维持胰岛素的要求。同样,ATF6表达水平的降低和sXBP1配合高血糖在这两个基因的小鼠模型(ob / ob)和人类2型糖尿病患者38]。β细胞更容易ER应激时细胞凋亡ATF6撞倒,抗细胞凋亡时ATF6 overexpressing活跃β(39]。有趣的是,它也被发现在ATF6遗传变异与前驱糖尿病在中国汉族人口(40]。这些报告表明ATF6可能代表T2D的治疗目标。

在我们的研究中,MIN6细胞暴露于TM展出upregulation毕普蛋白质含量,表明存在ER应激(图3)。ATF6强烈感染Ad-LacZ细胞被激活,峰值早在TM治疗后3小时以内,然后急剧下降,这表明这些细胞无法应对持续TM刺激。相比之下,细胞感染Ad-DHCR24-myc仍显示重大和持续upregulation ATF6。相应地,毕普的表达,受激活ATF6,这组显著高于Ad-LacZ组TM 48 h后曝光。此外,DHCR24过度也抑制活化的细胞信号通路(图3)。因此,upregulation DHCR24呈现MIN6细胞抗凋亡引起的ER应激。

为了应对不正确的二硫键的形成和错误折叠的蛋白质积累ER应激期间,丰富的ROS的产生,导致ER氧化还原系统的不平衡(41]。在目前的研究中,活性氧的生产TM曝光中的弱后Ad-DHCR24-myc组比对照组(图4),证明DHCR24拥有的能力平衡ER应激条件下氧化环境。过度的DHCR24可以直接清除活性氧生成在ER应激(23),因此衰减ER应激障碍,导致upregulation毕普蛋白质含量和阻塞p38的持续激活。综上所述,我们的研究结果表明,从TM-induced DHCR24保护MIN6细胞的过度凋亡清除过多的活性氧。

我们的数据表明,DHCR24超表达数量显著增加附加MIN6细胞暴露于胆固醇和H2O2(图5)。先前的研究已经证实,胆固醇和H2O2诱导细胞凋亡在MIN6细胞通过产生过多的活性氧,可逆转,减少谷胱甘肽和抗氧化剂cyanidin-3-glucoside [8,34]。结合我们的数据显示,DHCR24抑制TM-induced ROS生产,我们假设DHCR24的功能在保护MIN6细胞胆固醇和H2O2全身的细胞凋亡也可能源于清除过多的活性氧。

ROS是一个中间连接ER应激和氧化应激,这两者都是重要的病理过程的胰岛素抵抗[41,42]。线粒体活性氧的主要来源,生产过剩的活性氧与炎症反应和线粒体功能障碍(41,43]。核factor-kappa轻链增强器(NF - B细胞κB)和核factor-erythroid两个相关因子2 (Nrf2)两个redox-sensitive转录因子coregulated为了保持健康细胞的氧化还原内稳态。激活的NF -κB信号通路通常是陪着的负调控炎症反应期间Nrf2糖尿病(44]。在骨骼肌细胞,抑制NF -κB减轻线粒体功能障碍,变弱增强活性氧水平,改善胰岛素敏感性后持续营养过剩[45]。它也被发现,高脂肪饮食增加NF -κB表达而减少Nrf2水平在小鼠肝组织,补充可逆转的二十二碳六烯和特级初榨橄榄油46- - - - - -48]。激活NF -κB单向抑制Nrf2的转录功能通过促进转录阻遏物的定位或激活胞质抑制剂Keap1随后导致降低抗氧化防御酶的转录和增加活性氧的积累49- - - - - -51]。麦格拉思等人已经证明upregulation DHCR24介导抗炎作用的高密度脂蛋白(HDL)在内皮细胞,而沉默DHCR24 NF -的表达增加κ无法抑制的B重组高密度脂蛋白(52]。根据这些证据,我们假设,除了直接清除活性氧,过度DHCR24可能减弱活性氧水平,改善胰岛素敏感性增加胰岛素抵抗模型表达下调T2D的NF -的表达κB和移植Nrf2的表达。然而,这个假设需要进一步调查。

除了在ROS清除作用,相关的凋亡DHCR24活动也可能在胆固醇生物合成的作用,因为维护所需的胆固醇是小窝/脂质筏质膜的结构和功能,这是许多生长因子受体的定位(53]。这是由我们的一个先前的研究,表明神经细胞的感染与Ad-DHCR24-myc提高胆固醇水平和伴随着增加窖蛋白1和胰岛素样生长因子受体(22]。然而,在目前的研究中,与Ad-DHCR24-myc MIN6细胞的感染没有明显影响细胞内胆固醇水平(图1 (b)),这表明在MIN6 DHCR24的凋亡功能主要是通过其活性氧的清除。此外,这些结果表明,DHCR24对细胞特定类型细胞内胆固醇水平,这可能是由于微分调节胆固醇体内平衡机制在不同的细胞类型。

5。结论

总之,虽然只是一个初步研究,但目前的工作提供了明确的证据表明,DHCR24保护胰腺β从ER应激细胞凋亡细胞清除细胞内ROS过度。这些结果表明,针对DHCR24 T2D可能代表一种新的治疗策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括这篇文章。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

杨莉和王Xude co-first作者。

确认

这项研究是教育部的资助支持的辽宁省(没有。LFW201701),辽宁省重点研发项目指导项目(2019 jh8/10300057)和辽宁省重点研发项目(2020 jh2/10300114)。

引用

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