文摘

垂体腺苷酸cyclase-activating多肽(PACAP)作用于多个进程的血糖和能量代谢。PACAP强化在脂肪细胞胰岛素的行动,从胰腺释放胰岛素β肽,从而提高糖耐量。这些影响在器官水平相反,PACAP零老鼠表现出胰岛素过敏。然而,这种明显的差异还有待解决。我们旨在澄清机制PACAP空小鼠的抗糖尿病的表型。与高脂肪饮食喂养(HFD)胰岛素的敏感性和糖耐量受损在野生型小鼠,而这些变化被阻止在PACAP零老鼠。HFD也受损insulin-induced一种蛋白激酶磷酸化在野生型小鼠肝脏中,但不是在PACAP零老鼠。使用GeneFishing方法,HFD增加白细胞共同antigen-related(政治)蛋白质酪氨酸磷酸酶在野生型小鼠肝脏。沉默的守护神恢复肝脏的胰岛素信号HFD老鼠。此外,政治表达增加了HFD阻止在PACAP零老鼠。HFD VPAC1受体的表达增加(VPAC1-R),三种PACAP受体,在野生型小鼠的肝脏。 These data indicate that PACAP-VPAC1-R signaling induces LAR expression and insulin resistance in the liver of HFD mice. Antagonism of VPAC1-R may prevent progression of HFD-induced insulin resistance in the liver, providing a novel antidiabetic strategy.

1。介绍

垂体腺苷酸cyclase-activating多肽(PACAP)调节血糖和能量代谢通过中央和周边的行动。PACAP强化glucose-induced从胰岛胰岛素释放,促进insulin-mediated葡萄糖处理在脂肪细胞1- - - - - -3]。此外,在饥饿、禁食条件下,PACAP增加食物摄入量,儿茶酚胺释放保持能源供应(4- - - - - -6]。PACAP本地化在中央和周边组织(7]。在中枢神经系统(CNS), PACAP是本地化在下丘脑(8)和脑干,包括核束solitarius (nt)和背电动机迷走神经核(DMV) [9),调节能量代谢的领域。PACAP也在广泛的本地化周围神经包括交感神经系统。因此,PACAP也被用来作为一种神经递质或神经调质在中枢和周围神经。

有三种类型的PACAP受体:PAC1受体(PAC1-R)选择性PACAP [10],VPAC1-R VPAC2-R PACAP共享和VIP同等效力11]。在三种类型的PACAP受体,PAC1-R表达胰岛细胞和VPAC2-R胰岛细胞和脂肪细胞12,13]。PACAP增强了分子生物学在胰岛胰岛素分泌,insulin-induced在脂肪细胞葡萄糖摄取,作为抗糖尿病的影响(1- - - - - -3]。矛盾的这些行动,PACAP零老鼠据说展览增加胰岛素敏感性与普通食物的饮食(14]。此外,PACAP零老鼠抵御高脂肪饮食——(HFD)诱导胰岛素抵抗。这些结果表明,PACAP可能损害胰岛素作用的脂肪组织以外的组织。肝脏的主要器官之一,目标是通过胰岛素与胰岛素抵抗,PACAP受体表达。之前报道,据报道,PACAP刺激腺苷酸环化酶在肝细胞和葡萄糖的输出他们(15,16]。因此,肝脏可能的候选目标PACAP行动葡萄糖代谢。在这项研究中,我们旨在阐明的信号机制和功能PACAP美联储HFD小鼠的肝脏中。

2。材料和方法

2.1。PACAP零小鼠和野生型老鼠

的生成和维护PACAP零在ICR小鼠背景之前详细描述(4]。有没有雄性ICR小鼠和C57BL / 6 j小鼠从日本得到SLC(日本滨松)。在这项研究中,PACAP零小鼠和野生型ICR小鼠single-housed下12 h: 12 h黑暗周期(灯在早上07:30时。)条件。小鼠随机分为两组用常规的食物或HFD 6周。周润发(CE-2;克丽、日本),58.9%的热量来自碳水化合物和卡路里来自脂肪的11.6%,产生的总热量344千卡/ 100 g。HFD(快速脂肪CLEA-Japan、东京、日本),44.6%的卡路里是来自碳水化合物含有蔗糖和32.3%的热量来自脂肪,425千卡/ 100 g。实验过程和照顾动物进行了根据有望医科大学研究所的动物保健和使用委员会。

2.2。葡萄糖耐量和胰岛素耐受性测试

葡萄糖耐量测试(GTT),老鼠在6周后定期周润发和HFD美联储禁食6小时。后政府的葡萄糖(每公斤2 g i.p),尾巴血液中葡萄糖水平测定在表示时间点。胰岛素耐量测试(ITT),小鼠禁食6小时。注射胰岛素后每公斤(0.5 IU i.p),尾巴血液中葡萄糖水平测定在表示时间点。

2.3。GeneFishing分析小鼠肝RNA表达

C57BL / 6 j小鼠在六个星期老被随机分配到两种不同的饮食组6周()。常规食物或HFD美联储在6周后,总RNA的肝脏孤立使用试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和处理RQ1-DNase (Promega,麦迪逊,WI)与DNA去除残留污染。分析两组小鼠肝脏的RNA表达的差异,我们使用一个新的差异显示pcr方法基于退火控制引物(acp)。反转录进行使用GeneFishing™度包(Seegene说,首尔,韩国)如下;3μ克总RNA转化为互补使用ReverTra Ace (Toyobo,大阪,日本)dT-ACP1底漆。合成第一链cDNA样本进行PCR扩增使用dT-ACP2和一个任意acp的底漆。在94°C孵化后5分钟,50°C 3分钟,1分钟和72°C, 40 94°C 40秒的周期,为40秒,65°C和72°C 40秒,之后在72°C进行拉伸后5分钟。PCR产品被接受在2%琼脂糖凝胶电泳和染色1毫克/毫升溴化乙锭。放大PCR产品被克隆到一个pGEM-T向量使用助教克隆系统(豆类生物、Ohtsu、日本)进行进一步分析。双链DNA测序日立模型平方- 5500 DNA auto-sequencer用δTaq荧光dye-primer循环测序工具包(Amersham Corp .)、阿灵顿高地,IL)和Texas-red标记引物。

2.4。建设短发卡rna(成分)和病毒载体生产

政治目标序列老鼠被选为设计成分(加入011213.2 NM数量:5′-CGAATTACGTGGATGAAGA-3′。530年至548年)。此外,炒寡核苷酸序列用于特异性控制(5′-CAACACTAGTTGACATGTA-3′)。mU6启动子,发夹序列和终结者序列subcloned pAAV质粒。shRNA构造被克隆到一个AAV血清型9 (AAV9)稳定的shRNA交付。短暂,AAV9-LAR-shRNA AAV9-Scr-shRNA病毒与pAAV-shRNA triple-transfection HEK293细胞后产生,adenoviral辅助质粒pAdeno和嵌合辅助质粒编码AAV2代表/ AAV9帽(pAAV2rep / AAV9cap)的基因。的净化和滴定AAV报道如前所述[17]。

2.5。AAV载体在体内

intraliver管理,向量在100年被解散μL盐水和直接注入门静脉的老鼠。AAV-LAR-shRNA或控制AAV-scrambled-shRNA (vg)是管理6周HFD美联储C57BL / 6小鼠。AAV载体管理1周后,胰岛素耐量试验和测量肝脏胰岛素受体磷酸化的两组老鼠进行。

2.6。免疫印迹

一种蛋白激酶的磷酸化和胰岛素受体被免疫印迹测量之前报道(18]。后腹腔内注射胰岛素(每公斤0.5 IU i.p),肝脏被移除和细胞溶解1毫升裂解缓冲包含100毫米氟化钠,钠PPi 10毫米,2毫米原钒酸钠。10μg蛋白受到8% sds - page和转移到硝基过滤器。发现了一种蛋白激酶的磷酸化和胰岛素受体的多克隆抗体,phospho-Ser473 Akt(春秋国旅,贝弗利,MA),或phosphor-Tyr1361胰岛素受体β亚基(Abcam plc,剑桥,英国)。免疫反应性的蛋白质与HRP-conjugated二级抗体检测和ECL系统(Amersham Corp .)、阿灵顿高地,IL)。剥离后,膜与anti-Akt杂化抗体(CST,贝弗利,MA)或anti-insulin受体β亚基(圣克鲁斯生物。圣克鲁斯,CA)。然后,免疫反应性的信号量化了fas - 1000(日本富士胶片)和信号水平的phosphor-Akt phosphor-insulin受体和规范化的一种蛋白激酶和胰岛素受体β亚基。

肝脏溶菌产物蛋白质的老鼠AAV载体的管理受到8% SDS-polyacrylamide凝胶电泳和转移到硝基过滤器。守护神蛋白质anti-LAR检测了免疫球蛋白(转导实验室,肯塔基州的列克星敦)和发射极耦合逻辑系统。免疫反应性的信号量化利用fas - 1000(富士胶片、东京、日本)和表达水平的蛋白质被规范化β肌动蛋白(圣克鲁斯生物)。

2.7。信使rna的测量

量化的mRNA表达测量实时PCR之前已经详细描述(19]。总RNA分离使用试剂盒和RNase-free DNase。执行转换后cDNA、实时PCR与SYBR预混料交货taq II聚合酶(豆类生物)。ΔΔCT表达水平计算的方法。在这个实验中使用的引物是补充表1中列出的在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9321395。

2.8。肝脏切片文化

横向5-week-old雄性ICR小鼠的肝片准备之前报道(20.]。从麻醉小鼠的肝脏是孤立的,从这片300μ米厚度vibratome准备。组织切片是移植文化膜(Millicell厘米,0.4孔隙大小μm,微孔)35毫米Petridish后用封口膜密封好(美国有限公司,格林威治)和培养与测试试剂在1.0毫升DMEM (Gibco-Invitrogen),这是与2.7毫米NaHCO补充₃20 mg / L,消息灵通的10毫米,卡那霉素(Gibco), 100毫克/毫升apo-transferin(σ),5μg / mL胰岛素(σ),100毫米腐胺(σ),20 nM孕酮(σ),30 nM亚硒酸钠在5% (Gibco)和孵化有限公司₂在37°C的过夜。培养24小时后,总rna提取和rt - pcr进行如前所述。

2.9。统计分析

所有数据都表示为±sem。所有数据受到单向或双向方差分析。实验组之间的差异是由图基测试。统计学意义是当接受。

3所示。结果

3.1。PACAP零老鼠HFD-Induced对胰岛素抵抗的保护

老鼠常规食物或受到gtt HFD 6周。在常规chow美联储条件下,PACAP零老鼠,与野生型小鼠相比,呈现了显著的抑制血糖上升,快回到60分钟(图的基础水平1(一))。HFD美联储条件下,血糖高水平升高超过400 mg / dL在野生型小鼠,在PACAP空明显改善小鼠(图1 (b))。itt公司,在常规chow美联储条件下,PACAP零老鼠表现出更大的胰岛素敏感性比野生型小鼠(图1 (c))。此外,严重的HFD诱导胰岛素抵抗改善PACAP零老鼠(图1 (d))。这些结果表明,PACAP缺乏常规的食物喂条件下促进胰岛素敏感性和抵消HFD引起的胰岛素抵抗。

探索增强胰岛素敏感性的机制PACAP零老鼠,一种蛋白激酶的磷酸化(Ser473),肝脏的胰岛素信号分子,是检查。麻醉小鼠肝组织样本所得15分钟后ip胰岛素注射(0.5 IU /公斤体重)。肝脏的胰岛素,磷酸化Akt野生型和PACAP零白鼠常规食物(图2)。HFD美联储条件下,相比之下,一种蛋白激酶磷酸化在野生型小鼠明显下降,这变化是几乎完全阻止PACAP零老鼠,而总Akt蛋白含量保持不变(图2)。这些结果表明,PACAP抵消的作用HFD损害insulin-induced一种蛋白激酶磷酸化在肝脏。

3.2。的表达在小鼠的肝脏是美联储HFD守护神

HFD探索分子诱导的肝脏中mRNA表达差异定期使用GeneFishing周星驰和HFD条件进行了分析。小鼠的肝脏中美联储HFD 21基因和升高4减少基因被确定。一个共同基因白细胞升高antigen-related蛋白酪氨酸磷酸酶(政治),也称为受体类型蛋白质酪氨酸磷酸酶F (PTPRF),这是参与胰岛素信号(15]。定量PCR还显示,HFD治疗明显升高守护神mRNA表达肝细胞(图3(一个))。另一方面,升高的守护神mRNA表达在肝脏HFD条件下显著减少PACAP零老鼠(图3 (b)),这表明PACAP HFD条件下增加守护神mRNA的表达。

评估守护神的病理超表达之间的联系和HFD小鼠胰岛素抵抗,我们沉默守护神AAV载体通过使用成分表达式。Intraportal管理AAV-LAR-shRNA向量显著降低守护神的表达HFD小鼠肝脏(数字4(一)和4 (b))。治疗与LAR-shRNA Scr-shRNA相比,改善胰岛素抵抗在HFD老鼠(数字4(一)和4 (c))。此外,胰岛素受体的磷酸化β子单元在肝脏AAV-LAR-shRNA管理老鼠相比显著增加,控制老鼠。AAV-LAR-shRNA管理显著改善胰岛素敏感性HFD老鼠(图4 (d))。这些结果表明,过度的守护神在肝脏中,诱发的HFD通过PACAP受损体内的胰岛素敏感性。

这一发现促使我们研究直接影响政治的PACAP mRNA表达在肝脏切片体外实验。在肝脏切片准备从ICR小鼠和培养24小时的DMEM解决方案,治疗10⁻⁸M PACAP38守护神mRNA表达明显增加(图5(一个))。贵宾也显著增加守护神mRNA表达(图5 (b))。两个十⁻⁹M PACAP和10⁻¹⁰M TNF -α没有增加但共同政治表达明显增加(图5 (c))。这些结果表明,PACAP直接与肝脏诱导守护神mRNA的表达。

3.3。VPAC1-R mRNA表达增加肝脏的白鼠HFD

PACAP和三个子类的mRNA表达PACAP受体接受了检查。VAPC1-R在高水平和PAC1-R在低水平表达,PACAP VPAC2-R并不表示,在肝脏(图6)。的mRNA表达VAPC1-R在肝脏被HFD提升10倍。这些结果表明HFD条件下,卓越的海拔VPAC1-R可能允许PACAP诱导守护神mRNA表达在肝脏诱导胰岛素抵抗。

4所示。讨论

本研究旨在阐明机制PACAP空小鼠的抗糖尿病的表型。我们发现HFD显著增加政治和VPAC1-R肝脏中表达,与系统性胰岛素抵抗。缺乏PACAP中和HFD-induced胰岛素抵抗和海拔的守护神表达式在肝脏。相反,PACAP管理增加了政治表达肝片体外。目前的研究表明,在HFD条件下,VPAC1-R非凡的高度可能会允许PACAP诱导守护神mRNA表达在肝脏诱导胰岛素抵抗。

在目前的研究中,政治HFD-induced表达与胰岛素抵抗在肝脏,而政治表达的沉默HFD小鼠的肝脏恢复胰岛素受体磷酸化。胰岛素受体的激活是由其磷酸化酪氨酸残基,以应对胰岛素和终止通过诱导脱磷酸化蛋白酪氨酸磷酸酶(中)21- - - - - -23]。政治中,广泛表达于胰岛素敏感组织和抑制骨骼肌和脂肪细胞的胰岛素信号24,25]。此外,缺乏政治上调PI3K, Akt的活化剂,在肝癌细胞(26]。此外,政治表达升高肝脏的肥胖Zucker肥鼠(27]。结合这些报告,我们的研究结果表明,肝脏的高架守护神HFD导致胰岛素抵抗。

慢性炎症中扮演着重要角色在胰岛素抵抗的发病机制28]。肿瘤坏死因子-α促进炎症抑制胰岛素敏感性和胰岛素靶组织包括肝脏。肿瘤坏死因子-α也会增加政治表达(27]。在我们之前的研究中,而血浆TNF -αPACAP水平零小鼠没有明显不同于野生老鼠,守护神表达式在PACAP空小鼠肝脏降低,表现出明显的差异(14]。我们在这里证明PACAP强化了TNF -α增加全身的政治表达。建议政治表达的增强作用PACAP PACAP null老鼠被废除,导致胰岛素抵抗的反作用。

在这项研究中,PACAP中没有检测到肝脏。因此,交互的PACAP VPAC1-R提升政治可能来源于extraliver组织。据报道,PACAP产生在节前和节后的交感神经,神经纤维PACAP-containing观察胃肠道,肾上腺,在多个器官和血管壁29日- - - - - -32]。因此,PACAP可能来自交感神经支配的肝脏。还应该指出,PACAP刺激胰高血糖素、儿茶酚胺的释放,刺激腺苷酸环化酶活动的代理肝细胞(33,34]。因此,PACAP能刺激肝细胞葡萄糖输出不仅通过直接作用于肝脏,也通过释放胰高糖素和/或儿茶酚胺(15,16]。

dipeptidyl肽酶IV抑制剂(DPP-IV)是临床上用于治疗2型糖尿病患者。DPP-IV抑制剂延长寿命,因此促进抗糖尿病的荷尔蒙的影响,glucagon-like肽(GLP-1)和glucose-dependent insulinotropic多肽(GIP)。DPP-IV的一大优势是,他们在一个小得多的诱导病理低血糖发生率比经典的抗糖尿病的药物,如磺脲类(35]。底层机制并不完全理解,尽管glucose-dependent insulinotropic GLP-1和GIP是涉及的影响。DPP-IV循环PACAP38的降解中起着重要作用[36,37]。因此,DPP-IV抑制剂有望延长寿命,促进PACAP的效果。目前的研究表明一种可能的机制,促进行动的PACAP DPP-IV抑制剂增强肝脏葡萄糖输出,防止低血糖。

一些报告显示可能PACAP参与2型糖尿病的发展,尽管这需要探索更多的细节。PACAP subpicomolar范围放大glucose-induced胰岛素释放从小岛1,2),一个动作部分由VPAC2-R [35]。VPAC2-R位于小岛和脂肪细胞,据说VPAC2-R特定受体激动剂增强胰岛素分泌和葡萄糖处理(38,39]。此外,本研究发现,肝脏是VPAC1-R升高和调节胰岛素抵抗HFD“饮食”的白鼠。共同的VPAC1-R拮抗和激动VPAC2-R可以有效地抵消高血糖(协同工作40]。发展的选择性VPAC1-R拮抗剂可能提供一个新的工具来治疗糖尿病和代谢综合征。

缩写

PACAP:	垂体腺苷酸cyclase-activating多肽
贵宾:	——血管活性肠肽
HFD:	高脂肪饮食
非传染性疾病:	正常的饮食
政治:	白细胞共同antigen-related
PTPRF:	受体蛋白质酪氨酸磷酸酶F型
GTT:	葡萄糖耐量试验
ITT公司:	胰岛素耐量试验。

相互竞争的利益

这个手稿的作者没有利益冲突声明。

确认

本研究支持的波峰,JST,可本研究的一部分是由科学研究补助金(C) (JP24592277和JP15K09442 Masanori醒来时),对具有挑战性的探索性研究(JP26670453行长雅达和JP26670122仁桥本),科学研究(B) (JP26293020仁桥本)、科学研究和创新领域(JP15H01288仁桥本)从日本促进社会科学(jsp)和赠款从日本糖尿病基金会Masanori醒来时,行长雅达。这项工作的一部分是在教育部的支持下,日本文化、体育、科学和技术战略研究基金会(下边了)支持程序在私立大学2011 - 2015和2013 - 2017年,格兰特在生理科学研究所共同研究原因等。本研究通过推广JKA补贴资金原因雅达KEIRIN竞赛。这项工作的一部分,也是支持的jsp项目推进战略国际网络加速循环的有才华的研究者,批准号S2603和SRPBS艾湄湾仁桥本。

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