文摘

2型糖尿病(DM2)可以复制大鼠营养性肥胖通过使用低剂量链脲霉素(LD-STZ)以及在高剂量STZ初步烟酰胺(NA)管理。然而,STZ诱导tubulotoxicity。目的。开发大鼠模型的DN NA-STZ-induced DM2和比较它与LD-STZ-model为了选择最相关的方法复制糖尿病肾肾小球和肾小管形态功能的变化。uninephrectomy在3周后开始,成年雄性Wistar鼠五周高脂饮食喂养,然后收到腹腔内要么LD-STZ(40毫克/公斤)或NA(230毫克/公斤)STZ紧随其后(65毫克/公斤)。控制uninephrectomized vehicle-injected老鼠收到正常的食物。周10、20和30(的研究),代谢参数,肌酐清除率,蛋白尿,尿管损伤标记(NGAL KIM-1)进行评估以及肾脏超微结构光显微结构变化在20和30周。NA-STZ-group显示更高的再现性和代谢参数的稳定。10周,NA-STZ-group比LD-STZ-group NGAL水平显著降低。30周,糖尿病组显示DN的早期特征。然而,形态功能的变化NA-STZ-group似乎更明显比STZ-group尽管KIM-1和NGAL的较低水平。我们提出了一种新的大鼠模型与DN DM2的特点是稳定的代谢紊乱,典型的肾损伤,低水平的管状损伤标志物相比LD-STZ-induced糖尿病。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)的适当的实验动物模型是必不可少的nephroprotection为研究其发病机制和不同的策略。DN的发展2型糖尿病(DM2)在大多数情况下触发不仅由高血糖还其他致病因素与肥胖有关,胰岛素抵抗、高血压和血脂异常(1,2]。为了推断贴切地临床前数据转化为临床现实,DM2的DN的动物模型,是基于人类DN的功能和结构损伤以及代谢异常(3,4]。特别有价值的准确复制糖尿病早期肾药物干预治疗的潜在可逆的变化(5]。

Nongenetic DM2 DN通常与不同程度的体外实验模型大鼠复制β电池故障(6,7]。β细胞毒性的链脲霉素(STZ)有关其glucose-like化学结构允许STZ绑定过剩2转运蛋白表达β肽(6,8,9]。STZ诱发DNA碎片由于其烷基化活动(6- - - - - -10]。随后hyperactivation DNA修复酶的聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP1)已被证明导致β细胞坏死涉及NAD⁺/ ATP耗竭[9]。

烟酰胺(NA),通常被称为一个前任的NAD +,是一种适度减弱STZ-induced parp抑制剂β细胞损伤和严重程度的DM (11- - - - - -13]。尽管STZ-NA-induced DM2的老鼠最初是1998年(13),模型的DN NA和STZ诱导的uninephrectomized肥胖胰岛素抵抗大鼠没有报道过。

肥胖和胰岛素抵抗在远可以诱导大鼠高脂喂养(14,15]。因此,大多数描述nongenetic DM2的老鼠模型通常是由单个或多个使用低剂量STZ结合高脂肪饮食不同的成分和持续时间(16- - - - - -20.]。一些作者还使用单侧肾切除术,这被认为是加速的肾损伤进展(6,16]。因此,根据现有的数据,low-dose-STZ-injected high-fat-fed老鼠有或没有单侧肾切除发展适度的高血糖,肥胖、胰岛素抵抗、高血压,高脂血症,中度蛋白尿(16,19]。阻力指标的伤害也许可以但是,尚未评估在这些模型。与此同时,越来越多的证据表明,肾tubulointerstitium扮演着一个重要的角色在DN的发生和进展4,21]。

有必要指出,肾小管上皮细胞也表达过剩2运输使得他们容易STZ [8,10,22,23]。的确,STZ属于一组其肾毒性化学物质与现有能力(10]。因此,STZ使用可能对某些限制解释的实验室测试和肾形态(6,8]。DN的造型,这尤其重要,因为阻力指标纤维化也许可以的存在是一个标志,必须用于验证动物模型的DN。1995年Kraynak等人表明high-dose-STZ-induced在肾小管上皮细胞DNA损伤是短暂的,需要3周时间完成赔偿(8]。不过,目前仍不清楚是否低剂量STZ诱导肾小管损伤和可以长期对肾的影响实验DM2的变化。因此,它仍然是未知是否NA作为建立STZ-mediated衰减器β细胞毒性可能关于tubulotoxicity起到类似的作用11]。

最近建立了管状损伤的标志,中性粒细胞gelatinase-associated lipocalin (NGAL)和肾损伤molecule-1 (KIM-1),已被证明检测有毒伤害之前的存在形态变化(24- - - - - -26]。肾脏的表达KIM-1 NGAL与阻力指标纤维化也许可以的程度和肾功能下降在临床和实验设置(27]。与此同时,尿KIM-1和NGAL升高2型糖尿病大鼠DN的早期迹象(28,29日),甚至不是STZ-induced28]。这些发现与临床研究的结果表明尿KIM-1 NGAL敏感的早期生物标志物,临床前阶段的DN患者DM2 [30.- - - - - -32]。

在我们的研究中,我们评估早期和长期的影响相比,注射小剂量STZ NA-STZ管理肾干扰heminephrectomized high-fat-fed老鼠为了优化实验造型STZ-induced DM 2和DN。

2。材料和方法

2.1。动物和实验设计

图1显示了实验研究的协议。所有实验进行按照“指导的护理和使用实验动物”(没有出版。(NIH) 85 - 23)。所有动物程序是经当地伦理委员会批准。

三十8-9-week-old男性纯种白化大鼠体重180 - 210 g的每个被安置在12小时光明/黑暗改变房间的恒温24°C,提供食物和水随意。所有老鼠受到右肾切除术麻醉与戊巴比妥钠腹腔内(50毫克/公斤),然后随机实验分为三组(每组10动物)。

手术三周后,两组实验动物开始了高脂肪饮食和切碎的牛油(皮下部分,含有94%的脂肪,蛋白质的1.5%,和4%的水)定期与粗碎混合商业饲料在接下来的五个星期。饮食的能量是每100克450 kkal(20%来自脂肪,48%来自碳水化合物,20%来自蛋白质)。测量范围的食品消费每天30 - 40 g为一个动物。两组老鼠都转移到普通食物饮食后第八周之后隔夜空腹被腹腔注射(1)在低剂量STZ(40毫克/公斤- LD-STZ集团)(2)NA的剂量230毫克/公斤,高剂量STZ(65毫克/公斤),15分钟的时间间隔(NA-STZ组);(3)10控制uninephrectomized非糖尿病的老鼠在整个实验过程中被喂以普通商业啮齿动物食物包含每100克310 kkal(5%来自脂肪,48%来自碳水化合物,18%来自蛋白质)。术后8周,控制大鼠腹腔注射了车辆(0.5毫升的柠檬酸钠缓冲)。每天食品消费的测量范围是20 - 25 g为一个动物。

口服葡萄糖耐量试验(ogtt)进行每周注射STZ后/ NA-STZ /车辆。

隔夜空腹大鼠在周后10年,20年,通过尾静脉血样采集。同时在研究结束时(在30周),老鼠置于代谢笼,并为24小时收集尿液样本。血清是由离心分离3000 g×10分钟。

在20周,两组老鼠从控制和NA-STZ先行牺牲了肾脏电子显微镜检查。在30日周overnight-fasted老鼠牺牲;它们的肾脏被光和电子显微镜检查和处理。牺牲的时候,血液也来自主动脉,血清分离如上所述。

2.1.1。右肾切除术的外科手术

数据2(一个)- - - - - -2 (f)和视频文件1(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/8317850)显示右肾切除术的外科手术。在无菌条件下进行的所有操作组大鼠8点之间。标准化和12点。在手术后的一个星期,老鼠被安置每笼来防止seam 2差异由于活跃的运动和好斗的动物的行为。

2.2。材料

链脲霉素、一水柠檬酸和柠檬酸三钠二水合物从西格玛奥德里奇(美国)购买。烟酰胺是购自草Hemosan(奥地利)。兔多克隆抗体anti-collagen IV,二次山羊多克隆抗体合,和其他试剂包含IHC买来Abcam(英国)。马森PAS-staining和三色的染色Bio-Optica买来(意大利)。

2.2.1。链脲霉素制备柠檬酸缓冲和解决方案和烟酰胺

准备的解决方案是在无菌条件下使用层流罩,然后透过0.22μm过滤器(美国微孔)。

所有与STZ操作进行了实验室不透明瓶,防止光用铝箔。STZ粉,储存在干燥,暗位置−20°C,溶解在准备新鲜的柠檬acid-sodium柠檬酸缓冲pH值为4.5。

缓冲区是由混合47毫升0.1柠檬酸溶液(包含21.01 g / L的一水柠檬酸)53毫升为0.1 M柠檬酸钠溶液(包含二水柠檬酸三钠的29.41 g / L)。准备的解决方案是准确与蒸馏水混合的体积1000毫升,随着pH值的同步测量。

在最后的pH值超过4.5的情况下,几滴0.1添加了柠檬酸的溶液。在pH值小于4.5的情况下,几滴0.1添加了柠檬酸钠溶液。

钠溶解在0.9%氯化钠溶液。

2.3。代谢参数的确定

在第十周的试验中,体重测量每2 - 3周。空腹血糖水平是衡量高脂肪饮食的开始,结束后,葡萄糖耐量试验在一周9。从一开始的10周,体重估计一起空腹血糖水平每5周。

一周后注射STZ / NA-STZ /车辆,40%葡萄糖溶液(3 g / kg)温柔地通过聚乙烯口服胃管至少8 hours-fasted老鼠。从尾静脉血糖水平确定一个OneTouch超,约翰逊和约翰逊(美国)(0),30、60、90和120分钟。大鼠空腹血糖水平高于7.0,但低于14.0更易/ L,证明至少增加2倍计算平均血糖曲线下面积(AUC)或更高,持续研究[33]。否则,老鼠被排除在研究之外。

总胆固醇、甘油三酯水平测量使用商业套装Cobas Integra,罗氏公司(德国)、临床化学分析仪Cobas Integra 400 +(德国)、糖化血红蛋白,使用商业套件BioRad(美国)在HPLC-analyzer BioRad d10(美国)。

血清胰岛素水平从ALPCO化验用大鼠胰岛素酶联免疫试剂盒诊断(美国)在ELx800吸光度标仪(美国)。胰岛素抵抗是由稳态模型评估(HOMA-IR)。据Solskov HOMA-IR计算等。34用174乘以系数将胰岛素”ng / mL”单位“pmol / L”:

2.4。常规测定肾功能标记

血清肌酐水平,以及收集尿液样本,肌酐水平和血清尿素水平化验保持酶的使用商业套装Cobas Integra,罗氏公司(德国)、临床化学分析仪Cobas Integra 400 +。肌酐清除率(毫升/分钟/公斤)计算

蛋白尿是化验用鼠白蛋白酶联免疫试剂盒,购自Assaypro(美国),在ELx800吸光度标仪(美国),然后总(24小时)尿白蛋白排泄是计算。

2.5。测定肾小管损伤标记

尿排泄KIM-1和NGAL化验用老鼠ELISA-kits KIM-1和从Abcam NGAL(英国)ELx800吸光度标。24小时排泄这些标记进行了计算。

2.6。肾小球基底膜通过电子显微镜评估

探讨肾超微结构的部分肾皮质组织麻醉动物被浸泡在2.5%戊二醛固定在0.1米甲次砷酸盐缓冲与pH值7.2 12 h和后缀四氧化锇1.0% 1 h,在一系列梯度乙醇和丙酮脱水,嵌入在环氧树脂树脂(美国812年嵌入,EMS)。Semithin和超薄部分在超微切片机切徕卡EM UC7(奥地利)。Semithin部分与环氧树脂染色组织染色(EMS、美国),包含甲苯胺蓝和碱性品红。超薄部分是安装在formvar涂层网格和双沾0.5%醋酸双氧铀和3%柠檬酸铅。使用透射电子显微镜检查的部分天秤座120 +从卡尔蔡司显微镜GmbH(德国)、操作在120千伏。图片拍摄与bm - 2 k - 120双速轴SSCCD相机从TRS(德国)。GBM厚度测量直接在图像上通过ImageJ软件版本1.5(美国国立卫生研究所)。为此,校准后,直线垂直从内部到外部层GBM选择应用于至少30分(每1μ米)在所有数字显微图像。基底膜宽度的测量都是用纳米,结果被添加到数据框。

2.7。组织学和免疫组织化学分析

在30周的研究中,实验动物被戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,并提取左肾组织学检查。所有肾脏加权和切割后纵切一半与4%多聚甲醛固定24小时,然后嵌入石蜡。Semithin部分被周期性acid-Schiff染色(PAS)反应,马森三色的。相同的调查员盲目地评估所有部分,分析了至少35肾小球在每个大鼠肾脏下滑倒置显微镜徕卡DMI6000(奥地利)。

2.7.1。肾小球损伤评估

肾小球损伤评估通过系膜扩张,肾小球硬化症指数部分沾不是试剂和通过分析免疫组织化学染色的强度在肾小球胶原IV型地区。半定量的的形态学分析被用来评估肾小球损伤的程度。肾小球是准确分级的顺序为避免错误相关的评分相同的肾小球好几次了。

肾小球系膜扩张指数评估。系膜扩张矩阵定义的存在增加了大量的PAS-positive材料有或没有内细胞间质地区。因此,肾小球系膜扩张的程度是评估使用半定量的评分方法,在年级0意味着正常的肾小球;1级意味着系膜扩张面积高达25%;2级显示25 - 50%扩张肾小球膜;等级3 - 50 - 75%;4级意味着几乎完全系膜扩张- 75−100%35]。通过这种方式,1大鼠肾脏肾小球系膜扩张指数下滑是计算如下: 是N是肾小球。

计算平均分数为每个老鼠。后来,我们估计为每个实验组这些分数的平均值。

肾小球硬化症指数评估。肾小球硬化症指数相同的半定量的计算方式(36]。肾小球硬化症被定义为肾小球毛细血管丛的崩溃或消灭,或者两者兼有,伴随着动脉透明变性。短暂,每个肾小球的等级从0到4如下:年级0,没有损伤;1级,25%参与肾小球簇的初始系膜扩张和基底膜不规则;二年级,在25%到50%的肾小球病变轻微的节段性透明变性;三年级,弥漫性肾小球透明变性/占据50%到75%的肾小球硬化;和4级,这意味着几乎整个(超过75%)的肾小球丛生了。

IV型胶原免疫组织化学染色。免疫组织化学染色,4μ米厚壁被放在polylysine-coated幻灯片(门泽尔·格拉泽、德国),隔夜干燥后,石蜡被二甲苯移除。然后部分被放置在一个分级乙醇系列和沉浸在蒸馏水。燥热引起抗原暴露后,部分浸在3%双氧水20分钟。为了避免非特异性染色,部分被孵化在屏蔽解决方案1小时在室温下,紧随其后的是使用主要兔多克隆anti-collagen IV抗体稀释1:500一夜之间在5°C。然后二次山羊多克隆抗体结合合是补充道。至少35每个肾脏的肾小球部分进行评估下×100放大和半定量的分类根据褐色黄色色素肾小球基底膜和系膜强度矩阵,所描述的刘et al。37]。短暂,每个观察肾小球分级和编码如下:0,不到25%染色;1、25 - 50%阳性染色;2、50 - 75%阳性染色;和3,75%以上阳性染色。计算平均分数为每个老鼠。后来,我们估计为每个实验组这些分数的平均值。

2.7.2。Tubulointerstitial纤维化评估

马森阻力指标纤维化也许可以对图像分析,三色的和胶原蛋白类型IV-stained部分。从每个肾脏,共有8间质图像的每个幻灯片(肾皮质和juxtamedullary地区)捕获和处理数码相机徕卡DFC495(8像素CCD)融入徕卡DMI6000倒置显微镜(奥地利)使用10倍的目标。胶原纤维所占据的区域使用图像分析软件测量ImageJ version 1.5(美国国立卫生研究所)和半定量的分类根据白等。38),成绩0表示没有变化;1级,纤维化小于25%;和二年级,纤维化占据25 - 50%;3分任意分配时大约有50%或更多的分析领域的参与。

2.8。统计分析

数据评估使用IBM SPSS统计22.0版。所有数据提出了“均值±标准差。“单向方差分析两组之间的差异进行了分析事后图基的多重比较检验结合Mann-Whitney排名和在适当的时候进行测试。配对样本Wilcoxon符号秩检验是用来比较的结果可以对同一组在不同时间的测量。结果ogtt比较用单向方差分析重复措施,和图基的测试执行。显著性水平是接受。

3所示。结果

3.1。代谢参数的确定

3.1.1。体重的变化

根据图中所示的数据3研究中,身体体重的两个实验性糖尿病组之间没有统计学上显著不同。这些动物的体重开始增加3周后启动的高脂肪饮食,成为显著高于控制相比,8周后大鼠的实验。但仍高在随访期间尽管常规食物恢复。高脂喂养时间不超过5周,因为老鼠不情愿地消耗食物的牛油从第四周开始饮食。老鼠完全拒绝在第五周吃高脂肪的食物,迫使其改变常规的食物。体重已经成为高NA-STZ组相比LD-STZ自上周20国集团,但是这些差异是不重要的。

3.1.2。实验性糖尿病的稳定性参数

根据ogtt的结果,单一的低剂量STZ(40毫克/公斤)诱导DM 2 40%的high-fat-fed老鼠和NA的组合和高剂量STZ(65毫克/公斤)70%。如图4(一),所有的组都以最高的血糖水平在30分钟的OGTT逐步减少在接下来的90分钟。然而,糖尿病大鼠表现出明显高于空腹血糖水平以及葡萄糖耐量测试的两个小时期间。有趣的是,NA-STZ组的血糖水平下降慢相比去年的整个90分钟的OGTT LD-STZ组。然而,这些差异是不重要的。曲线下的面积(更易与L×min)不是两个不同的糖尿病组,但在他们两人明显高于对照组(图相同的参数4 (b))。

空腹血糖水平在随访期间图所示5。高脂喂养没有显著改变空腹血糖水平。所有的动物在两组验证轻度高血糖糖尿病直到实验结束。这个事实证明了几乎2倍增加糖化血红蛋白浓度与对照组相比(表1)。然而,意思是LD-STZ-injected糖尿病组的空腹血糖值低于NA-STZ组与倾向于标准化的研究(更易/ L和更易与L,分别地。)。这些结果是一致的无意义的更高层次的血清胰岛素LD-STZ组相比NA-STZ组(表1)。结果,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) NA-STZ-diabetic组明显高于非糖尿病患者相比,老鼠。HOMA-IR LD-STZ组没有明显不同与对照组相同的参数。然而,两者之间HOMA-IR糖尿病组的差异相对较小,直到研究结束。

3.1.3。血清脂类概要

5周的饮食的影响下与牛油、胆固醇和甘油三酯同时升高糖尿病组与NA-STZ组的血脂异常程度更明显。他们明显高于对照组相比,在各方面的测量(表1)。30周,糖尿病组总胆固醇水平之间的差异已经倾向于成为重要的()。

3.2。常规测定肾功能标记

如图6(一),无论是LD-STZ还是NA-STZ团体证明proteinuric蛋白尿水平的实验。然而,因为20周几乎高10倍尿白蛋白排泄率一直在观察糖尿病组相比,控制动物。此外,这种区别成为周30强,显著差异时尿白蛋白排泄甚至被两国糖尿病组(μg / NA-STZ和24小时μ在LD-STZ g / 24小时,),在NA-STZ蛋白尿组高出30倍相比,控制非糖尿病的大鼠(μg / 24小时,)。

NA-STZ组表现出显著的逐步从第一个测量(肌酐清除率下降毫升/分钟/公斤),直到研究结束的毫升/分钟/公斤,(图6 (b))。相比之下,肌酐清除率LD-STZ-injected老鼠倾向于有更高的价值在20周相比NA-STZ组。然而,没有发现显著差异的研究。肌酐清除率在非糖尿病患者组倾向于反渗透法状态可能由于heminephrectomy [39]。

3.3。测定肾小管损伤标记

尿NGAL和KIM-1水平没有显著变化在研究控制非糖尿病患者组(数字7(一)和7 (b)、职责)。相比之下,我们发现几次两个标记在糖尿病组的值增加了实验的最后相比初始状态。与对照组相比表现出更高水平的NGAL和KIM-1 LD-STZ组在各方面的测量。值得注意的,没有显著差异在这些标记在10周NA-STZ组相比,控制老鼠(尿NGAL:ng / 24小时与ng / 24小时,分别地。)。同时,我们获得了几乎2倍增加LD-STZ NGAL水平组相比NA-STZ集团(ng / 24小时,分别地。)。此外,这种差异依然明显30周(ng / 24小时LD-STZ组对比ng / 24小时NA-STZ集团)。

3.4。肾小球基底膜厚度评价

如数据所示8(一个)和8 (b)肾小球基底膜(GBM)宽度,计算在20周的实验,在NA-STZ显著增加糖尿病组(海里)相比,控制大鼠(海里,)。这种差异更加明显,30周(纳米与189年。纳米、职责。)(图9 (b))。电子显微镜评估并不是执行LD-STZ糖尿病组在20周,因为非常少量的动物继续研究老鼠(4)。在实验的最后当semithin部分片段LD-STZ组做好准备,只观察juxtamedullary地区而肾小球也不见了。

3.5。组织学和免疫组织化学分析

半定量的肾小球矩阵扩张指数均明显高于糖尿病组与非糖尿病患者相比动物。然而,NA-STZ组显示显著扩大系膜基质相比LD-STZ组(图10)。有必要指出,其他光微观特性的DN阻力指标纤维化也许可以除了NA-STZ组更明显。

阻力指标纤维化指数也许可以半定量的评估肾小球硬化症和(数据11和12、职责)都明显高于糖尿病组与非糖尿病患者相比动物。然而,没有明显差异指数LD-STZ之间和NA-STZ-injected糖尿病大鼠。

IV型胶原蛋白的免疫组织化学染色的肾小球面积糖尿病组显示暗褐色色素沉着与对照组相比。然而,LD-STZ NA-STZ-injected糖尿病大鼠并没有显著区别观察(图13)。

4所示。讨论

根据肾病委员会公布的数据美国糖尿病并发症财团动物模型的网站(AMDCC,https://diacomp.org/),严格的形态和实验室验证标准提供一个理想的啮齿动物模型的DN。他们是50倍增加蛋白尿与对照组相比,肌酐清除率下降超过50%在随访期间,从最初的水平至少twice-thicker GBM与最初相比,和系膜硬化,小动脉的透明变性,阻力指标纤维化。也许可以和阻力指标受伤也许可以因此,必须评估肾小球干扰。阻力指标受伤也许可以建立,在大多数情况下决定,而比它的发作(DN的进展4,21]。然而,最近的研究表明,海拔管损伤标记可能发生早期DM2的设置和代谢紊乱,之前的发展明显DN (31日,32,40]。

我们研究的主要思想是比较DN的特点在两个鼠模型相似度的代谢紊乱。创建与DN NA-STZ-induced DM2的模型,我们决定修改伊斯兰教和崔的技术(41)通过互补单边右肾切除术和牛油five-week-high-fat饮食。这个减肥法以前所描述的葡萄糖耐受不良的洛根作为一个独立因素和肾功能障碍发展14]。比较我们的模型和一个low-dose-STZ-induced DM2,我们改编的转化模型的DM2 DN Sugano et al。16]。然而,一些适当的验证标准模型的DN阻力指标受伤,也许可以包括GBM增厚没有评估这个模型。

肾形态功能的变化在我们的研究中获得恶化NA-STZ集团证实了近40倍增加的尿白蛋白排泄率比非糖尿病患者组和渐进温和的肌酐清除率下降整个观察期。此外,糖尿病早期超微结构特征具体(重要的肾小球基底膜增厚和部分足突细胞脚过程抹杀)20周之前曾被观察到,年底进行实验。此外,更高级的组织学结果一周30(比如显著扩大肾小球膜和在肾小球硬化和tubulointerstitium)的存在某些明显的相似之处的古典自然历史人类糖尿病肾病(3,4]。

相比LD-STZ集团10周的实验中,动物在糖尿病组开发相同的代谢综合症的重要特征。然而,他们似乎更稳定,直到研究结束时只有在NA-STZ组。关于肾形态功能障碍,显著差异是只发现蛋白尿和系膜扩张(NA-STZ组更明显)。然而,显著降低NGAL的价值得到NA-STZ组相比LD-STZ组周10到30。它可能表明,即使是低剂量STZ政府可能会对管早期以及长期影响的功能。然而,并没有观察到显著差异程度的阻力指标病变也许可以肾,尽管它比LD-STZ NA-STZ组较弱。它可能表明STZ肾毒性的影响不太明显的老鼠接受NA高剂量STZ之前。有趣的是,其他光LD-STZ组显微特征不太明显。因此,它似乎是奇怪的恶化low-dose-STZ-mediated管功能障碍并不是与DN的进展。

基于这些观察结果,我们提出了一些猜测。首先,在糖尿病代谢紊乱是非常相似的组织在10周,观察不同程度的尿管损伤标记(NGAL)可以认为,至少部分,NA的初步注入的影响。尽管如此,即使在一起使用的NA STZ诱导DM2,我们建议开始评估任何形态功能实验动物的标本不早于2周后STZ管理。根据公布的数据,评估药理作用对DN的发展不应该开始直到STZ至少3周后使用,以避免STZ-mediated肾文物(6,8]。其次,即使一个显著增加LD-STZ组肾损伤标记物的水平在10周与STZ于管状细胞的毒性作用,最有可能的这种影响可以忽略,因为非常相似的基本糖尿病引起的肾形态功能的变化。也可以是猜测,总结性的影响连续代谢障碍对长期的发展有更大的冲击比LD-STZ-mediated肾小管功能障碍早期肾功能的变化。因此,我们的研究已经扩展的概念区别这两个模型的DN DM2从一些肾小球干扰的角度以及管状函数。

提出模型NA-STZ-induced DM2 DN是成功应用于我们之前的初步研究探讨二甲双胍肾的影响,在药物证明nephroprotection关于管功能除了血糖降低属性(42]。有趣的是,一个类似的二甲双胍对尿肾损伤标志物的影响得到了在我们的临床研究[43]。与此同时,它不是发现当造型STZ-induced DM大鼠(44),被张et al。17]。他们提出了一个模型的DM2诱导雄性Wistar鼠的每月高脂肪饮食(商业高脂肪食物)和两种STZ腹腔内注射低剂量(30毫克/公斤)在一周的时间间隔17]。然而,根据我们的经验,第二次注射STZ后两天,老鼠患上严重的高血糖(44]。类似的结果在glycaemia方面被描述在另一个试点研究使用的剂量STZ 60毫克/公斤high-fat-fed老鼠(45]。因此,无论是低剂量STZ管理两次还是单高剂量STZ后短时间内(5周)与牛油喂养可能引起代谢紊乱的典型实验DM2 [33]。

本研究有一定的局限性。因此,我们没有使用该集团与单个high-dose-STZ-induced DM(65毫克/公斤)作为一个更合适的控制NA-STZ组确认tubuloprotective初步NA政府的性质。我们假设是很难比较早期的管状效果只使用尿路损伤标记在这些模型中,由于显著差异水平之间的glycaemia组会发生(6,45]。这个肯定是基于知识高血糖本身可能伤害tubulointerstitium (4,21]。此外,一些临床研究表明高相关性KIM-1 NGAL尿排泄和糖尿病补偿度(31日,32,46]。第二个限制是缺乏相关数据,超微结构的肾LD-STZ组在两个时间点的变化,因为上述技术问题。另一个限制是,我们没有测量血压,因为动脉高血压不是一个预留的功能验证的DN模式就像上面提到的。最后,不稳定的代谢紊乱LD-STZ组中观察到的可能是相关的,至少部分,使用five-week-high-fat饮食而不是描述的连续喂养最初研究Sugano et al。16]。因此,增加代谢紊乱的再现性,我们建议继续高脂肪喂养至少2个月。根据洛根获得的数据,使用高脂肪饮食的时间允许我们模型葡萄糖耐量、胰岛素抵抗,和肾小球干扰没有任何额外的干预措施(14]。

5。结论

我们提出一个新的模型,2型糖尿病和糖尿病肾病的特点是稳定的代谢紊乱,典型的肾损伤,降低管功能障碍程度比低剂量体外糖尿病。

烟酰胺和链脲霉素联合使用描述uninephrectomized high-fat-fed老鼠似乎更适合糖尿病肾病的早期阶段的调查相比,低剂量链脲霉素管理时被认为是肾小管功能。不过,目前仍不清楚糖尿病肾病模型的方法是最合适的只有古典肾糖尿病形态功能特性评估。

相互竞争的利益

作者报道,没有利益冲突。

确认

这项研究是通过使用设备的核心设施中心“植物和真菌细胞和分子技术”在科马罗夫俄罗斯科学院植物研究所(俄罗斯圣彼得堡)和研究资源中心的分子和细胞技术圣彼得堡州立大学。这个项目是由俄罗斯基础研究基金会的资助。15-04-08138。

补充材料