文摘

分裂素诱导gene-6 (Mig-6)是一种反馈抑制表皮生长因子受体(EGFR)信号通路。的肝脏特异性基因敲除小鼠(Mig-6 Mig-6基因^{d / d})显示肝肿大和高胆固醇血症增加。在这项研究中,生物标记的胰岛素抵抗和高脂肪饮食的影响在野外(Mig-6^{/ f})和Mig-6^{d / d}老鼠进行了分析。空腹血浆浓度的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸,HOMA-IR测定葡萄糖耐量和胰岛素抵抗测试中执行25-week-old Mig-6^{/ f}和Mig-6^{d / d}老鼠。活跃的胰岛素受体的蛋白质含量,6-phosphatase葡萄糖,磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase肝脏和脂肪含量进行了分析。空腹血浆胆固醇和葡萄糖浓度在Mig-6更高^{d / d}老鼠比Mig-6^{/ f}增加小鼠脂肪沉积在肝脏。但Mig-6^{d / d}老鼠的改善葡萄糖和胰岛素抵抗没有增加数量的胰岛素输注后phosphoinsulin受体肝脏。肝的磷酸烯醇丙酮酸浓度carboxykinase在禁食Mig-6增加^{d / d}老鼠。高脂肪饮食喂养的加速血浆脂质概要文件和HOMA-IR Mig-6^{d / d}老鼠但没有微分效应在口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量测试在两个基因型。这些结果表明,活化表皮生长因子受体信号可能增加空腹血浆葡萄糖浓度通过诱导肝脂肪变性和改善全身KO小鼠的胰岛素抵抗所致脂肪组织减少脂肪生成。

1。介绍

有丝分裂原诱导gene-6 (Mig-6)是一个适配器蛋白质,是肝脏和肾脏中高度表达1]。它的表达是由各种生长因子诱导的,压力,和激素,如表皮生长因子(EGF)、肿瘤生长因子-α(TGF -α)、胰岛素、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)、缺氧,糖皮质激素(2- - - - - -5]。Mig-6蛋白质包含几个领域重要的相互作用与各种信号分子如Cdc42 / Rac-interaction绑定(床)域和Src-homology (SH3)域6]。

Mig-6的主要功能是一个负面的反馈调节器的表皮生长因子受体(EGFR)信号通路7]。Mig-6的下降表现在人类乳腺癌,这是与减少乳腺癌患者的总生存期(8],和损失的蛋白质的功能有助于引发肺癌等癌症的5]。因此,众所周知,Mig-6是一个肿瘤抑制基因。配体的表皮生长因子受体信号通路激活绑定,EGF、TGF -α这是与癌症密切相关(9]。在大多数人类癌症中表皮生长因子受体是过表达的,包括乳腺癌[10],宫颈癌[11),和肺癌12]。一个特定EGFR抑制剂吉非替尼,是成功地用于治疗一些癌症13]。

当一些表皮生长因子受体抑制剂的患者同时患有癌症和糖尿病,它不仅治疗癌症,而且改善糖尿病(14]。此外,治疗的表皮生长因子受体抑制剂(PD153035)改善葡萄糖耐受不良和胰岛素敏感性,降低食源性肥胖(戴奥)小鼠的炎症15),表明一些角色的表皮生长因子受体信号通路在糖尿病的病理生理学。此外,肝脏特异性基因敲除小鼠Mig-6基因显示高胆固醇血症和脂肪肝16]。这份报告表明,表皮生长因子受体信号通路的激活肝脏可能扰乱全身胰岛素抵抗。因此,我们分析了糖尿病mellitus-related肝脏特异性基因敲除小鼠的生物标志物Mig-6 (Mig-6^{d / d})和表型上的高脂肪饮食的影响。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

Mig-6^{d / d}和控制老鼠(Mig-6^{/ f})在动物设施维护韩国化学技术研究所(KRICT)和用于实验根据动物实验的指导方针在承认机构的动物保健和使用委员会(IACUC)KRICT。所有动物都保持在一个房间里照亮每日从07:00晚7:00(十二12 h光/暗周期)、温度(°C)、通风(每小时10 - 12倍)和湿度(%)。老鼠笼单独,允许自由进入自来水和饲料。

老鼠被喂食高脂肪饮食(HFD;研究饮食,D12492)或正常的食物(NC)的20周5周的年龄。体重是每周监测和食物摄取率两周一次的测量。一些器官加权后牺牲的实验。

2.2。分析等离子体浓度和胰岛素生化参数

从通宵禁食老鼠收集血液样本。葡萄糖的浓度、总胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白-胆固醇(低密度脂蛋白),甘油三酯(TG)和nonesterified脂肪酸(NEFA)和比色法测定血浆使用自动生化分析仪,响应920(动画、德国)。血浆胰岛素水平测量使用超灵敏鼠标胰岛素酶联免疫试剂盒(Shibayagi、日本)根据制造商的指示。HOMA-IR值,作为胰岛素敏感性指数,根据以下公式计算:(空腹胰岛素(uIU /毫升)×空腹血糖(mg / dL)) / 405。

2.3。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)

OGTT、小鼠口服葡萄糖在2克/公斤体重后隔夜空腹。采集的血液样本的时间点0,15、30、60、120分钟使用毛细管heparin-coated retroorbital丛。美国ITT、胰岛素(σ)腹腔注射0.54 IU /公斤体重和在同一时间点采集的血液样本OGTT。速率常数为胰岛素耐量试验(小猫)计算使用公式(% /分钟)= 0.693 /t(1/2),t(1/2)计算边坡的血浆葡萄糖浓度在3 - 15分钟后规模管理静脉注射胰岛素。血液样本立即离心机在1000 g×10分钟和由此产生的等离子体样本存储在−20°C,直到被化验。

2.4。组织学分析

小鼠牺牲后,肝脏和白色脂肪组织收集,10%福尔马林固定,石蜡嵌入式,切割的厚度4 ~ 6μm。苏木精和伊红染色进行())。生殖脂肪组织的石蜡包埋组织化学染色部分进行使用macrophage-specific抗体(美国Abcam)和ABC染色工具包(美国圣克鲁斯)检测脂肪组织的炎症。

2.5。免疫印迹分析

20μg总蛋白质的分离NuPAGE 4 - 12% BIS-TRIS凝胶(美国表达载体)和转移到PVDF膜。膜被阻断缓冲区(美国σ)1小时。进行免疫印迹在4°C一夜之间用颤抖的用抗体p-ERK(细胞信号,美国),p-IR, IR, PEPCK, G-6-Pase(美国Abcam), ERK p-PPARγ,PPARγ和GAPDH(圣克鲁斯,美国)。洗后,膜中孵化1:5000稀释的二次抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白,热科学、美国)在室温1小时。蛋白质乐队使用ECL可视化工具包(美国热科学)。

2.6。统计分析

使用学生的统计分析t以及。所有数据报告为±SEM。,, 表明, ,和分别,而最小的致命剂量组。#,# #和# # #显示, ,和分别与野生群体。

3所示。结果

3.1。食物摄取率和体重变化

基因型对食物摄入量的影响率和查阅测量。Mig-6 NC组^{d / d}小鼠体重明显低于Mig-6显示^{/ f}老鼠通过所有年龄。在Mig-6 HFD集团^{d / d}老鼠比Mig-6查阅较低^{/ f}老鼠在几乎所有年龄在25周的年龄但不显著(图1(一))。然而,基因型之间没有明显差异在食物摄取率(图1 (b))。

3.2。等离子体浓度的生化参数

血浆脂质水平进行了分析后隔夜空腹。Mig-6 NC-fed组^{d / d}老鼠总胆固醇浓度升高()和脂蛋白胆固醇()比Mig-6^{/ f}老鼠,这是一样的报告Ku et al。16]。HFD没有或很少对血浆总胆固醇浓度的影响,在Mig-6脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇^{/ f}老鼠。在Mig-6^{d / d}然而,老鼠HFD-fed小鼠血浆总胆固醇浓度增加()、脂蛋白胆固醇()和低密度脂蛋白胆固醇(NC-fed老鼠相比)。HFD也增加等离子Mig-6 TG水平^{d / d}老鼠。这些数据表明,肝脏特异性删除Mig-6可能加速高脂肪饮食的影响血浆胆固醇浓度和TG(表1)。

3.3。测试葡萄糖耐量试验、胰岛素抵抗,胰岛素抵抗指数

基因型的影响,葡萄糖耐受不良饮食和胰岛素抵抗指数测量。口服葡萄糖耐量试验,Mig-6^{d / d}老鼠比Mig-6改善葡萄糖耐受不良^{/ f}老鼠在NC -和HFD-fed集团Mig-6^{d / d}老鼠显示较低的血糖浓度在所有时间点和较低的曲线下的面积(AUC)葡萄糖()(图2(一个))。Mig-6胰岛素耐受性测试^{d / d}老鼠也显示增加葡萄糖清除率(),说明改善胰岛素抵抗,NC -和HFD-fed组(图2 (b))。和HFD导致Mig-6葡萄糖和胰岛素抵抗^{/ f}和Mig-6^{d / d}老鼠。但Mig-6^{d / d}增加小鼠空腹血糖(图3(一个)),而浓度降低空腹胰岛素(图3 (b)(图)和一种改进HOMA-IR索引3 (c))仍然显示,改善胰岛素抵抗()。

3.4。肝脏和脂肪组织的重量

肝脏和脂肪组织的权重,获得在年龄,25周的测量。没有重量的差异基因型之间的肝脏和肝的体重的比率两个基因型NC-fed组没有显著不同。但Mig-6^{d / d}小鼠肝脏的比率增加体重HFD-fed组,表明在Mig-6 HFD有更多的潜在影响^{d / d}小鼠的肝脏重量(表2)。

Mig-6 NC-fed动物^{d / d}小鼠皮下脂肪少()、内脏脂肪(),肥胖指数(比Mig-6)^{/ f}老鼠。但是没有HFD-fed组基因型之间的差异。HFD显著增加脂肪体重和肥胖指数在两种基因型(表2)。这些结果表明,脂肪重量的减少导致体重Mig-6低^{d / d}老鼠。

3.5。组织学分析肝脏和脂肪

没有重量的差异基因型之间的肝脏,但肝)染色显示增加Mig-6液泡^{d / d}老鼠Mig-6相比^{/ f}(数据4(一),4 (b),4 (c)和4 (d)),这表明Mig-6^{d / d}老鼠仍然有肝脂肪变性。这些结果与此同时增加肝脏/体重的比率。

在生殖脂肪)染色,Mig-6^{d / d}小鼠脂肪细胞的体积小于Mig-6透露^{/ f},这是符合Mig-6低脂肪重量^{d / d}老鼠(图4 (e)和4 (f))。没有HFD-fed组(数据的差异4 (g)和4 (h))。当生殖脂肪组织炎症与anti-macrophage抗体应用评估胰岛素抵抗的作为一个指标,没有NC-fed集团(数据的差异4(我)和4 (j)),但Mig-6^{d / d}老鼠透露下巨噬细胞沉积HFD-fed集团(数字4 (k)和4(左))。没有观察到的差异)染色的褐色脂肪组织(蝙蝠)野生和Mig-6之间^{d / d}老鼠(数据未显示)。

3.6。免疫印迹分析蛋白质与胰岛素抵抗有关

胰岛素信号通路的活动被磷酸化水平的胰岛素受体作为测量参数的胰岛素抵抗。在禁食条件下,肝脏p-IR Mig-6下降^{d / d}老鼠,餐后高血糖是一致的。但在小鼠腹腔注射胰岛素(0.54 IU /公斤),p-IR水平的差异Mig-6之间并没有观察到^{/ f}和Mig-6^{d / d}老鼠(图5(一个))。在禁食条件下,生殖脂肪p-IR水平没有显著差异Mig-6之间观察到的^{/ f}和Mig-6^{d / d}老鼠(图5 (b))。另一个胰岛素抵抗指数衡量的PPAR水平γ和phospho-PPARγ一个重要转录因子改善胰岛素抵抗在脂肪组织中。的p-PPARγ/ PPARγMig-6之间的比率并没有不同^{/ f}和Mig-6^{d / d}老鼠(图5 (c))。

的表达PEPCK G-6-Pase,速率限制酶的糖质新生在禁食状态,测量。PEPCK和G-6-Pase Mig-6增加^{d / d}老鼠Mig-6相比^{/ f}老鼠,与空腹血糖浓度升高(图组成6)。

4所示。讨论

Mig-6肝脏中高度表达的比其他器官如脂肪、肌肉、肾上腺和肺1]。根据Ku et al .,肝脏特异性基因敲除小鼠Mig-6显示肝肿大和高胆固醇血症,这表明表皮生长因子受体信号通路或Mig-6蛋白在肝脏可能发挥重要作用在脂质代谢16]。摘要糖尿病引起的生物标记物,如血浆浓度的葡萄糖和脂质和胰岛素抵抗指数几个在野外进行了分析(Mig-6^{/ f})和KO (Mig-6^{d / d}在25周的年龄)的老鼠。研究的结果,Mig-6^{d / d}老鼠被认为是动物体重较低,比Mig-6更高的空腹血浆胆固醇和葡萄糖^{/ f}老鼠,和改善全身胰岛素敏感性。的Mig-6^{d / d}小鼠产生相反的特征而言,糖尿病和高血糖,但改善胰岛素抵抗。

在禁食条件下,Mig-6血糖浓度增加^{d / d}老鼠但不显著(图3)。这些结果并不符合前面的数据从Yoo et al。17),空腹血糖浓度显著增加8-week-old Mig-6^{d / d}老鼠。胰岛素信号通路的活动明显减少肝脏(图5(一个)(图),伴随着PEPCK增加蛋白质6)25-week-old老鼠。此外,肝脏的脂质滴增加(图4)。这些结果表明,胰岛素抵抗可能是发达的Mig-6在肝脏^{d / d}老鼠,PEPCK活性糖质新生,速率限制gluconeogenic通路中的酶(18),可能导致诱导hepaitc脂肪变性。从noncarbohydrate糖质新生产生葡萄糖碳基质如丙酮酸、乳酸、甘油、生成葡糖的氨基酸供应葡萄糖对大脑的饥饿状态,是主要的途径控制空腹血糖浓度(19,20.和空腹血糖糖质新生的增加成正比21]。据报道,PEPCK和SREBP-1c转基因小鼠严重的肝脂肪变性,说明组织在肝脏脂肪变性,但不是肝病或血脂异常(22,23]。SREBP-1(固醇调节元件结合蛋白1)激活肝脏中脂质合成增加PEPCK转基因小鼠(22]。模型动物的非酒精性脂肪肝也有空腹高血糖(24]。这些报告表明,弱空腹高血糖25-week-old Mig-6^{d / d}老鼠似乎弱相关肝肿大的报告比Ku et al。16]。

在这个实验中,我们预期,Mig-6^{d / d}老鼠应该葡萄糖体内平衡,因为Mig-6^{d / d}据报道,老鼠肝肿大(16),有很多报道,表皮生长因子受体信号通路的抑制剂,吉非替尼,改善葡萄糖耐受不良或胰岛素抵抗在人类和实验动物。但OGTT和ITT公司清楚地表明,全身葡萄糖稳态Mig-6提高^{d / d}老鼠(图2)尽管脂肪肝。因此,改善胰岛素抵抗的原因进行了分析。没有显著差异insulin-induced在肝脏胰岛素信号通路(图5(一个))。因此,我们将注意力转向脂肪组织胰岛素抵抗是全身胰岛素抵抗的重要因素。胰岛素抵抗的出现在肥胖是通过长期摄入高脂肪的饮食。在组织和脂肪积累增加炎症发生在同一时间。巨噬细胞在脂肪组织的炎症导致沉积。巨噬细胞分泌各种细胞因子和它会导致胰岛素抵抗通过减少红外和PPAR的磷酸化γ(25,26]。我们没有发现任何差异在脂肪组织胰岛素信号通路。但巨噬细胞染色Mig-6减少^{d / d}老鼠相比,野生老鼠(数字4 (k)和4(左))和PPARγ在Mig-6蛋白质含量增加^{d / d}老鼠(图6),表明改进后的脂肪组织胰岛素抵抗。肝脏和脂肪是主要组织胰岛素抵抗的发展。Mig-6脂肪含量^{d / d}老鼠增加肝脏,但减少脂肪组织,伴有全身改善胰岛素抵抗。这表明,在全身脂肪组织可能更重要比肝脏胰岛素抵抗。

另外,高脂肪饮食的影响被发现是Mig-6更重要^{d / d}老鼠,特别是血浆胆固醇资料尽管改善胰岛素抵抗(表1表皮生长因子受体信号通路),这意味着一个重要的角色在肝脏脂质代谢和胰岛素抵抗。表皮生长因子受体的激活Mig-6删除老鼠表达下调CYP7A1蛋白表达导致高胆固醇血症(16]。吉非替尼时,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,在高脂肪饮食喂养Mig-6接受治疗^{d / d}老鼠,空腹胰岛素浓度、胰岛素抵抗和高胆固醇血症是改善(27]。还有另一个报告,Mig-6表达胰岛素引起的暗示可能会影响胰岛素信号通过Mig-6(表皮生长因子受体信号通路28]。这些报道可能假设mig-6相声的关键中介表皮生长因子受体与胰岛素信号通路。

总之,老鼠Mig-6消融在肝脏导致脂肪肝等多种代谢表型,空腹高血糖和高胆固醇血症但在降低体重,提高胰岛素敏感性。尽管脂肪肝,享年Mig-6脂肪体重下降^{d / d}老鼠。这些结果表明,Mig-6或表皮生长因子受体信号通路发挥重要作用在脂类代谢的体内平衡。定义Mig-6调节代谢综合征的分子机制提供新的见解的发展更有效的方法来治疗和预防糖尿病和高胆固醇血症。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版这篇文章。

确认

这项工作是支持的程度和研究中心(DRC)项目(DRC-15-01-KRICT)通过科技的国家研究委员会(望远镜)和基本项目通过韩国研究所化学技术(KRICT)。