文摘
背景。Smad7是主要的负调控蛋白质转化生长因子-β(TGF -β)下游信号通路,它扮演着一个重要的角色在糖尿病肾病(DN),可能与泛素蛋白酶体通路(UPP)。目的。我们调查了UPP的作用在调节TGF -β/ SMAD信号和探讨泛素蛋白酶体抑制剂MG132疗效的DN。方法。Wistar鼠随机分为糖尿病组和正常对照组。糖尿病组大鼠腹腔注射链脲霉素。糖尿病大鼠被随机分为糖尿病肾病(DN组),一个MG132高浓度(MH)组,和一个MG132低浓度(ML)组。治疗8周后,24小时尿微白蛋白(UAlb),尿蛋白/尿肌酐(/加州)值,ALT, AST, Bcr、肾脏损害,TGF -βSmad7,纤连蛋白(FN)和Smurf2被检测到。结果。体重和Smad7 DN组蛋白表达减少,但肾脏重量,肾脏重量指数,UAlb, /加州,FN和Smurf2 mRNA表达,TGF -β蛋白表达增加。然而,这些变化降低了MG132治疗后,和一个更明显的效果在MH组相比,毫升组明显。结论。MG132减轻肾脏损害通过抑制Smad7泛素退化和TGF -β激活的DN。
1。介绍
糖尿病肾病(DN)是一种最普遍和严重的微血管并发症的糖尿病(DM) [1]。早期病理特征是基底膜增厚,系膜基质的增加,细胞外基质堆积,紧随其后的是阻力指标纤维化,也许可以发展肾小球硬化症和最终导致不可逆肾损害(2- - - - - -5]。糖尿病肾病的确切发病机理尚未完全阐明。
Smad7主要负监管转化生长因子的蛋白质和antifibrotic因素β(TGF -β)下游信号通路6并可以与Smad2/3争夺绑定我TGF -类型β受体,阻断Smad2/3激活。Smad7也可以转移到细胞膜Smad2/3退化和TGF -β受体复合物,以及抑制TGF -β信号激活绑定后Smad泛素调节因子2 (Smurf2)。激活TGF -β扮演着一个重要的角色在糖尿病肾病的病理进展7],其中包括许多细胞因子的表达,增加炎症细胞因子和粘附分子,诱导纤连蛋白(FN)表达(8,9,参与实际开发的糖尿病肾病10,11]。
泛素蛋白酶体通路(UPP)是细胞内蛋白质降解的主要机制,并能降低特定的蛋白质,和调节细胞分化和转录;蓝精灵是一个泛素连接酶,属于E3连接酶家族,特别是降低Smad蛋白质。已经确定Smad蛋白质泛素降解的机制(12]。蓝精灵连接酶家族包括Smurf1和Smurf2。Smurf2的功能是通过绑定TGF -执行β受体通过Smad7复杂,导致泛素降解Smad7,这会削弱Smad7 TGF——的抑制作用β受体(6]。
然而,UPP是否激活或肾脏参与糖尿病肾病的发展仍不清楚。研究表明,MG132治疗对糖尿病肾病的影响(13- - - - - -15),但它的作用的机制尚不清楚。的可能性MG132能够抑制活化的TGF -β信号通路通过阻断泛素降解的Smad7糖尿病肾病并没有被研究过。因此,进一步的研究来理解UPP和TGF -之间的关系β信号通路和MG132在糖尿病肾病的作用机制是必要的。在这项研究中,我们建立了一个通过使用STZ糖尿病肾病大鼠模型和选择MG132作为特定的泛素蛋白酶体抑制剂阻断TGF -β/ SMAD信号通路,以探索UPP和TGF -之间的关系β/ SMAD信号通路在糖尿病肾病。
2。材料和方法
2.1。动物模型
总共45雄性Wistar鼠重200 g从腾兴生物科技公司,重庆(中国)。老鼠放在一个特殊的房间,一个稳定的环境温度18°C-22°C和安置在铁丝笼子免费访问标准饮食和自来水前7天的实验。所有大鼠的血糖水平前测量实验。
老鼠被分为两组,即对照组(NC组,)和实验组();糖尿病大鼠在实验组糖尿病呈现链脲霉素腹腔注射的剂量(美国Sigma-Aldrich) 60毫克/公斤。链脲霉素是溶解在0.1 M柠檬酸缓冲pH值4.5。同时数控组的大鼠腹腔内注射,同样体积的柠檬酸缓冲。3天后注射STZ后,空腹血糖测量进行尾静脉的血液样本;老鼠的血糖水平16.7 L更易被确认为“糖尿病”,和4周后,糖尿病大鼠出现轻度微蛋白尿(DN)的早期迹象,包括在这项研究。糖尿病大鼠被进一步分为三组:糖尿病肾病组(糖尿病控制,)。毫升组(0.05毫克/公斤MG132对待每一天(美国CALBIOCHEM),)和MH组(0.1毫克/公斤MG132对待每一天,),与此同时,数控和糖尿病肾病组收到腹腔内注射同样体积的柠檬酸缓冲每天。
2.2。样本收集和体重和肾脏重量的决心
所有的老鼠都重,每天24小时尿液收集。8周后注射的老鼠牺牲与戊巴比妥麻醉的后(50毫克/公斤,1%浓度)。血液生化分析心脏血液的集合。肾脏都重,减少冠状平面;上的两极对肾脏被用于病理分析,剩下的部分对肾脏被用于透射电子显微镜分析。左肾解剖了生化参数的评估。肾组织不惜−80°C,直到所需的分析。
2.3。生化测量
测量24小时尿微白蛋白(UAlb),尿肌酐浓度、尿蛋白/尿肌酐(/加州)浓度和ALT, AST, TP,铝青铜,包子,克雷亚,GLU的血液被自动生物化学分析仪测量。
2.4。肾脏病理
上的两极对肾脏被迅速删除,固定在10%甲醛,由梯度乙醇脱水,嵌入在石蜡,分段4μ米厚度。肾部分都沾染了他和马森染色。使用光学显微镜所有部分进行评估。
2.5。肾脏透射电子显微镜
肾皮质切成1毫米块和固定在2.5%戊二醛2小时在4°C。洗了三次后为0.01 M磷酸盐缓冲剂,样本你找找1%锇酸3小时4°C。样本然后由梯度丙酮脱水和嵌入在环氧丙烷。(60海里)超薄部分被剪掉了,double-stained与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,并分析了用透射电子显微镜(美国飞利浦Tecnai 10)。
2.6。免疫印迹
肾皮质中均质裂解缓冲(Kaiji、上海、中国)在冰上30分钟。西方墨点法进行如前所述[13]。免疫印迹分析使用TGF -β抗体(兔子,1:1000;细胞信号技术(CST),美国),Smurf2抗体(兔子,1:1000;美国Abcam)、肌动蛋白抗体(兔子,1:1000;美国Abcam)、Smad7抗体(兔子,1:500;博士德生物技术,中国)。辣根peroxidase-conjugated二级抗体(anti-rabbit)从Beyotime获得生物技术研究所、中国。蛋白质被发现使用增强化学发光(ECL)系统和ECL Hyperfilm(美国微孔)。
2.7。实时荧光定量聚合酶链反应
从肾皮质匀浆提取的总RNA是使用一个RNA提取工具(Tiangen生物技术,北京)。PCR进行如前所述[16]。引物序列如下:FN,向前:5′-CATACTCCTCCAGACCTACC-3′,相反:5′-TGGAGGTTAGTGGGAGCATC-3′, Smad7,向前:5′- CTGCAACCCCCATCACCTTA 3′,相反:5′-GCAACGCCTCCATAGTC-3′,肌动蛋白,向前:5′-TGGCATTGTCATGGACTCTG-3′相反:5′-CCAGAAGAAGTTGGGAATCTGA-3′。
2.8。统计分析
所有的实验数据都表示为±s.d。统计评估获得的数据在我们的研究中,单向方差分析(ANOVA)是用于比较两组以上,其次是费舍尔最显著差异(LSD)测试多个比较,用统计软件包SPSS 13.0;一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。体重的变化、肾脏重量和肾脏重量指数
体重较低的实验组与NC组(MH),但它明显恢复,毫升组与糖尿病肾病组()。相反,肾脏重量和肾脏重量指数更大的实验组与NC组(),但在减少MG132治疗()。MH组变化更重要比ML集团()(表1)。
3.2。尿量(UV)、尿白蛋白排泄率(阿联酋),和尿蛋白/尿肌酐(/加州)比例
紫外线、阿联酋和/加州比率增加实验组与NC组相比,在糖尿病肾病组最高()。然而,价值观在MH少和ML组与糖尿病肾病组();MH组更低的值比ML集团()(表2)。与此同时,没有重大改变的ALT、AST和Bcr每组()(表3)。
3.3。肾病理
实验组的肾组织体积大于生产总值(gdp)数控组外观。他和马森染色后,我们观察到,通过光学显微镜、肾小球体积更大的实验组相比数控组。此外,肾小管水肿、肾小球系膜异常沉积,肾肾小球萎缩和退化明显的实验小组,虽然在MH组变化显著减少(图1)。
(一)
(b)
3.4。透射电子显微镜的肾脏组织
在透射电子显微镜下,我们可以想象浮肿的内皮细胞和足细胞,内皮毛孔扩大,不规则增厚和基底膜的电子密度减少,和部分足突融合在实验群体,尤其是糖尿病肾病组,被发现在MH组(图中恢复过来2)。
3.5。免疫印迹
有一个减少的表达Smad7与NC组相比,实验组,在糖尿病肾病组(尤其明显),但Smad7 MG132治疗后表达增加,和MH组增加更明显比ML集团()。相比之下,TGF -β对实验组的表达增加与NC组相比,尤其是在糖尿病肾病组(),但MG132治疗导致TGF -减少β表达式(),有一个显著降低TGF -的表情βMH组比ML集团()(数据3和4)。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.6。实时荧光定量聚合酶链反应
FN mRNA的表达和Smurf2 mRNA增加在每个实验组与NC组相比,尤其是在糖尿病肾病组()。然而有减少FN和Smurf2 mRNA表达在MH和ML组与糖尿病肾病组(),这MH组降低更明显比ML集团()(图5)。的mRNA表达Smad7没有任何重大变化在每组()(图6)。
(一)
(b)
(一)
(b)
4所示。讨论
目前,糖尿病肾病已成为晚期肾脏疾病的主要原因(ESRD) [17- - - - - -19]。以前,一些研究发现,大量的细胞信号通路调节糖尿病肾病纤维化,如NF -κB MAPK TGF -β等等(7,20.,21]。TGF -β信号通路在糖尿病肾病已经被认为是一个重要的纤维化,其主要生理功能是促进肾细胞肥大和调节ECM代谢。TGF -β可以抑制细胞增殖信号通过控制从Gl阶段S期细胞转化,诱导细胞肥大,矩阵合成,增加和减少矩阵退化,促进ECM的积累(11]。
4.1。的监管作用UPP TGF -β信号通路在早期糖尿病肾病UPP之间的关系和DN
泛素蛋白酶体通路(UPP)是一个重要的nonlysosomal蛋白质降解途径,在真核细胞普遍存在。它能够有效降解胞内蛋白具有高选择性,影响细胞周期调控、细胞凋亡、抗原的演讲中,炎症反应,和基因转录22,23]。特别是,UPP可以上调或下调信号通路通过降解细胞内抑制或激活因子的途径(24]。
Smad7是关键的负调控蛋白TGF -β信号通路,位于下游的TGF -β信号通路,由UPP [25,26]。Smad7可以绑定到Smad泛素调节因子2 (Smurf2)转移到细胞膜,其次是Smad2退化和3和TGF -β受体复合物,抑制活化的TGF -β信号通路。Smurf2是一个泛素连接酶,属于E3连接酶家族。它可以专门降低Smad7和削弱TGF - Smad7的抑制效果β受体。
TGF -β激活在糖尿病肾病的发展起着重要的作用,这可能涉及纤连蛋白的表达(FN)。最近的一项研究报道,UPP是为特定的细胞内蛋白质降解的主要方法。此外,发现泛素水平增加2型糖尿病神经病变与对照组相比(27),这表明糖尿病肾病的发展可能是由于neuroproteins的退化。Kaniuk et al。28)显示,大量的泛素胰腺周围被发现β细胞在糖尿病大鼠。近年来,研究确定Smurf2表达式是增加肾脏疾病模型,例如,Smurf2和TGF -β蛋白表达增加7天后在单侧输尿管梗阻肾,但表情然后减少UPP抑制剂,MG132;同时,Smad7表达增加,纤维变性是改善(29日]。据报道,肾脏UPP可以减少Smad7表达式(6,30.]。这些报告表明,UPP参与肾疤痕。
然而,是否泛素降解Smad7,调节TGF -β信号通路,参与了糖尿病肾病的发展UPP是未知的。在这项研究中,我们发现Smurf2, UPP家族的一员,在糖尿病肾病组增加,与此同时增加表达TGF -β和FN,其次是减少Smad7的表情。然而,这些影响是减少UPP抑制剂,MG132。结果表明,监管的TGF -β由Smad7信号通路参与DN的发展。UPP参与激活的TGF -β通路,诱导糖尿病肾病的进展Smad7泛素降解。
4.2。Ubiquitin-Proteasome抑制剂的疗效MG132在早期糖尿病肾病
目前,糖尿病肾病的发病率每年都在增长,随着糖尿病发病率的增加。然而,糖尿病肾病发展的机制还没有完全阐明,并不能预防糖尿病肾病的发生尽管严格控制血糖,血压,血脂由于监控饮食摄入量。因此,有必要探索分子机制参与糖尿病肾病发展为了找到新的治疗目标。
一个关键的催化酶,参与目标蛋白质的泛素降解UPP,是26 s蛋白酶体,它是专门由UPP抑制剂抑制MG132 [11,31日- - - - - -33]。田代等人发现这个UPP抑制剂可以减轻在单侧输尿管梗阻肾病大鼠肾间质纤维化(31日]。最近的研究表明,对diabetes-induced MG132能保护肾脏氧化损伤,炎症和纤维化(13- - - - - -15,34),但确切的发病机理尚未完全阐明。我们先前的研究发现,MG132可以抑制NF -的激活κ我通过抑制炎症信号κBαsumoylation和泛素化,能抑制组蛋白泛素化和诱导细胞凋亡在高葡萄糖引起的大鼠肾小球系膜细胞(13,20.)在糖尿病肾病肾纤维化激活诱导的TGF -β信号通路,介导细胞增殖和分化,但蛋白酶体抑制剂是否能治疗糖尿病肾病通过阻断泛素降解Smad7没有报道。
在我们的研究中,我们发现,管理MG132在糖尿病肾病大鼠体重和Smad7蛋白表达减少,而我们没有观察到显著Smad7的mRNA表达的变化。此外,肾脏重量、肾重量指数,阿联酋,/加州,TGF -β蛋白质和FN mRNA水平下降与MG132抑制。的病理变化与光和电子显微镜观察MH组也显著减少。此外,MG132可以调节浓度的方式Smurf2 mRNA的表达。这表明MG132, UPP抑制剂,可以防止大鼠足细胞损伤,改善内皮细胞水肿,保持基底膜渗透性和减少尿蛋白。它还可以抑制Smurf2表达,减少Smad7泛素降解,提高Smad7-induced TGF -的抑制β信号通路和部分块TGF -β蛋白表达和FN mRNA延缓肾脏纤维化。此外,我们没有发现它对大鼠有明显的副作用在我们的研究中,例如,肝脏和肾脏的功能障碍。因此,一种新的机制在糖尿病肾病可能UPP的激活,从而增加泛素降解Smad7, TGF -这是一个抑制因素β/ SMAD信号通路。MG132可以改善糖尿病肾病的早期阶段通过降低糖尿病大鼠肾脏病理变化,改善肾病尿蛋白,一定程度上降低纤连蛋白表达,减少肾纤维化。
5。结论
我们已经表明,激活的TGF -β信号通路相关的泛素降解增加UPP Smad7蛋白,在早期DN。我们还表明,MG132对早期糖尿病肾病疗效通过阻断泛素降解Smad7从而抑制活化的TGF -β途径。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突在他们的论文中提到的商标。作者克里Aqie co-first作者。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(30670980)。作者要感谢临床中心实验室和Cordis-Myoelectricity实验室技术支持。作者还感谢生物医学校对英语表达抛光。