文摘
保护β细胞的细胞凋亡是一种疗效glucagon-like peptide-1 (GLP1)治疗糖尿病药模拟保护β细胞功能质量暴露致糖尿病的条件包括促炎细胞因子。有丝分裂原激活蛋白激酶10也叫c-jun伴激酶3 (JNK3)分泌细胞具有保护作用对细胞因子引起的死亡。在这项研究中,我们调查是否JNK3表达式与保护作用引起的GLP1模仿exendin 4。我们发现增加大量的JNK3在人类胰岛分离和INS-1E细胞培养与exendin 4。诱导JNK3 exendin 4是增加INS-1E细胞的生存。沉默的JNK3阻止cytoprotective效应exendin 4对细胞凋亡引起的文化条件和细胞因子。这些结果强调的要求JNK3 exendin凋亡影响的4。
1。介绍
β细胞的保护机制适应质量和功能对葡萄糖体内平衡至关重要,随着功能的下降β细胞质量是糖尿病发展的一个关键特性(1- - - - - -5]。肠促胰岛素激素glucagon-like peptide-1 (GLP1)发挥着重要的作用在β细胞质量和功能的控制6- - - - - -8]。改变β细胞敏感性GLP1被认为有助于功能的丧失β细胞群在精益和肥胖者糖尿病(9- - - - - -11]。β细胞异常GLP1敏感性与减少有关GLP1受体表达在一些糖尿病动物模型(12,13]。GLP1管理改善β细胞生存在糖尿病动物模型14,15]。丰富的在体外和在活的有机体内研究表明,这种prosurvival效应是通过抑制β细胞凋亡等致糖尿病的压力引起的促炎细胞因子(6,16- - - - - -23]。通过GLP1及其类似物的影响结果激酶的活化和/或支架蛋白,进而促进凋亡信号级联(6,18,19,24- - - - - -28]。的一个主要激酶激活GLP1及其模拟exendin 4是蛋白激酶B / AKT (16,17,27]。一种蛋白激酶的激活GLP1结果增加大量的胰岛素受体底物2 (IRS2) [27]。在β细胞的表达IRS2由有丝分裂原激活蛋白激酶控制10也叫c-jun伴激酶3 (JNK3) [29日,30.]。沉默的JNK3干扰RNA可以显著降低IRS2 INS-1E细胞丰度(29日]。由于JNK3损耗的增加细胞因子诱导的细胞凋亡随之而来(29日,30.]。针对这些数据,本研究的目的是调查JNK3内容是否与β细胞保护通过GLP1模仿exendin 4。
2。材料和方法
2.1。细胞培养、人类胰岛分离和转染
老鼠分泌细胞细胞系INS-1E维护在RPMI 1640中补充10%胎牛血清(FCS) (Velizy-Villacoublay PAA实验室、通用电气医疗集团,法国),1毫米丙酮酸钠,50μ米β巯基乙醇,10毫米玫瑰(31日]。人类胰腺是从成年脑死亡捐赠者按照法国规定和与当地的机构伦理委员会的“区域et de里尔大学医疗中心。“胰岛细胞分离胰腺导管扩张后消化的组织如前所述32]。所有实验进行了至少在小岛的纯度和活力> 80%。1066年CMRL培养基培养纯化胰岛(Gibco BRL,生活技术)含有游离脂肪酸0.625%人类血清白蛋白(罗氏诊断)、青霉素(100μUI /毫升)和链霉素(100μg / mL)。siRNA工器针对JNK3 (siJNK3)或核控制与GFP (siGFP)以前描述(29日- - - - - -31日]。介绍了siRNA工器使用Lipofectamine 2000(生命技术、圣奥宾、法国)[描述29日,30.]。
2.2。免疫印迹实验
INS-1E和孤立的人类胰岛细胞被取消了在寒冷的PBS缓冲和细胞颗粒孵化30分钟在冰上裂解缓冲(20毫米三羟甲基氨基甲烷醋酸液pH值7,0.27毫米蔗糖、1% Triton x - 100, 1毫米EDTA, EGTA和1毫米,1毫米德勤)补充和antiproteases antiphosphatases(罗氏,Meylan法国)。细胞溶解产物离心液15分钟在18000 g和上层清液用于分析蛋白质。蛋白质提取可溶性在Laemmli缓冲区(40%甘油、20%β巯基乙醇,8% SDS, 0.02%溴酚蓝,0.25毫米Tris-HCl, pH值6.8)和变性在装货前10分钟在95°C到凝胶。蛋白质分离10% SDS-polyacrylamide凝胶和硝化纤维膜电涂抹。一夜孵化后的蛋白质检测膜在4°C的具体主要抗体JNK3(稀释1:1000;细胞信号技术、马、美国),JNK2(稀释1:1000;细胞信号技术、马、美国),β肌动蛋白(1:5000;σ,圣昆廷,法国),或α微管蛋白(1:5000;σ,圣昆廷,法国),稀释缓冲中含0.1%渐变20 2%牛奶(JNK3)或5% BSA (JNK2)或5%(牛奶β肌动蛋白和α微管蛋白)。蛋白质与IRDye800可视化或IRDye700 (Eurobio, Les乌里,法国)作为二级抗体。量化使用《奥德赛》进行红外成像系统(Eurobio) [29日,30.]。
2.3。细胞凋亡检测
细胞凋亡在细胞转染siRNAs和评估暴露于细胞因子鸡尾酒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)的大鼠il - 1β(10 ng / mL),鼠标TNFα(25 ng / mL),老鼠干扰素γ为24小时(150 ng / mL)。细胞凋亡是由得分显示pycnotic核(可视化与赫斯特33342年)(31日]。盲目地执行计算的三个不同的实验。
2.4。统计分析
方差分析是用于统计显著性,其次是事后Bonferroni测试(测试Dunnett)当实验包括两组以上。是水平的意义(SAS统计软件包;SAS、携带、数控)。
3所示。结果
3.1。Exendin 4增加在孤立的人类胰岛和INS-1E JNK3丰富
包括我们在内的几项研究已经表明,GLP1受体受体激动剂防止长期接触引发的细胞凋亡与细胞因子(21,23,31日]。通常,cytoprotective GLP1效果模拟是通过诱导关键prosurvival蛋白(6,25]。在这方面我们质疑exendin 4 JNK3的丰度增加。我们发现的孤立的人类胰岛细胞exendin 4升高JNK3丰富的显示通过免疫印迹分析(图1(一))。JNK3蛋白质的增加开始早在2小时后,拒绝4人力资源(图1(一))。感应的JNK3 exendin 4是可观测10 nM的,但却是最优50海里(图1 (b))。蛋白质免疫印迹实验证实海拔JNK3 exendin 4 INS-1E细胞(图所示1 (c))。然而,感应的JNK3 GLP1受体激动剂后来(4小时后孵化),一直持续到24小时治疗(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。需要JNK3 Cytoprotective Exendin 4 INS-1E细胞的影响
我们下一个调查JNK3是否需要cytoprotective exendin 4的效果。为此,INS-1E细胞转染与双siRNAs针对JNK3 mRNA (siJNK3) [29日,30.]。后者有效和选择性沉默JNK3 INS-1E细胞(图的表达2(一个))。正如预期的那样,孵化24小时引起细胞与细胞因子的细胞凋亡(图2倍增加2 (b))。Exendin 4有效地减少由文化条件所引起的死亡和细胞因子(图2 (b))。正如前面观察到(29日,30.),沉默的JNK3强cytokines-induced细胞凋亡(图2 (b))。此外,减少的JNK3 siJNK3废除了保护作用通过exendin 4(图2 (b))。这些数据指出,JNK3水平耦合的关键exendin 4和保护细胞对凋亡诱发细胞因子。
(一)
(b)
4所示。讨论
越来越多的证据表明,GLP1及其模拟触发cytoprotective影响通过刺激丰富的β细胞凋亡蛋白(6,17,25- - - - - -27,31日,33]。一些报告已经划定JNK3作为一个关键的角色球员在保护β细胞对凋亡[29日,30.]。这种说法的一个特点是选择性沉默JNK3增加细胞因子诱导细胞凋亡的29日,30.]。相反,我们质疑JNK3内容可以刺激GLP1模仿exendin 4。我们发现的孤立的人类胰岛exendin 4增加JNK3蛋白质含量。尽管凋亡机制激活GLP1模拟全球类似人类胰岛和老鼠分泌细胞之间INS-1E细胞(6,17,25,26,31日),特定的时空调控途径诱发GLP1及其类似物可能千差万别。凋亡的不同时态激活ERK通路之间的孤立的小岛和INS-1E细胞已被证明在应对RF26a RFamide肽(34]。而ERK活性肽在人体胰岛和INS-1E细胞,peptide-induced ERK活化更长期INS-1E细胞(35]。一项研究表明,β细胞行为在回应GLP1人类和啮齿动物小岛之间是不同的36]。GLP1促进合作和在人类胰岛β细胞之间的连通性,而它不这样做在啮齿动物细胞(36]。这种差异可能引起一些空间和时间的变化调节基因的表达和途径。在这方面,我们观察到感应JNK3内容exendin 4是更快和更迅速地下降INS-1E相比人类胰岛细胞。
JNK3的感应人类胰岛和INS-1E细胞让我们问这种现象是否导致exendin 4对细胞凋亡的保护作用引起。一条线索是,JNK3含量的增加文化INS-1E细胞24 h与显著减少细胞凋亡在正常的文化条件。这个凋亡效应通过GLP1模仿被废除JNK3内容时减少核。我们以前公布的细胞因子治疗INS-1E细胞与细胞因子恶化死亡引起的细胞凋亡(31日]。死亡的崛起引起细胞因子由coculturing减轻细胞exendin 4 (31日]。实验了,保护INS-1E exendin 4对细胞因子诱导的细胞凋亡时废除JNK3富足是衰减的。
几个关键转录因子和信号蛋白包括蛋白激酶A (PKA), PKB / AKT, PKC-zeta,兵,内质网应激和表皮生长因子受体参与cytoprotective效果通过GLP1模拟(6,18,19,24- - - - - -26]。Abdelli和合作者的减少胰岛素受体底物2 (IRS2)的表达和Akt激活沉默JNK3 [29日,30.]。然而,JNK3主要定位在β细胞的细胞核29日,30.),这表明IRS2不能激酶的唯一目标。未来的研究需要确定所需的其他目标JNK3 exendin 4的凋亡效应。这样的调查可以揭示小说的保护通路β细胞,最终导致创新的抗糖尿病的治疗靶点。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
海琳Ezanno和瓦莱丽Pawlowski同样导致了工作。
确认
这项工作是支持的椅子上卓越的法国国家研究机构N°anr - 10 - cexc - 005 - 01,区域市政局北部不加,欧洲区域发展基金AA,瑞士国家科学基金会(fn 310030 - 133018) CB。这项工作也支持由“欧洲基因糖尿病研究所”(E.G.I.D.ANR-10-LABX-46)和欧盟委员会。