文摘

切口的参与细胞分化的信号通路建立了哺乳动物的肾脏。最近,失调的Notch信号分子已被确定在急性和慢性肾功能损伤,糖尿病肾纤维化模型和活检。Jagged1规范化等级配体,调节转化生长因子- (TGF -β在慢性肾病)依赖的方式。TGF -β肾纤维化的核心中介,是一个主要贡献者糖尿病肾病的发展。探索Notch信号分子的作用和可能机制在糖尿病肾病的发病机制,我们培养的大鼠系膜细胞接触γ分泌酶抑制剂(榫眼)或高葡萄糖和测量了Notch信号分子的表达和纤维化指数。切口pathway-related分子,TGF -β,纤连蛋白增加暴露在高葡萄糖和减少与榫眼治疗。我们的研究结果表明,缺口信号通路可能沉淀通过TGF -糖尿病肾病β激活。

1。介绍

糖尿病肾病是一种常见的糖尿病微血管并发症知之甚少发病机理。血流动力学变化和疾病遗传因素造成的葡萄糖代谢,高血糖和/或血管紧张素ⅱ的行为和其他细胞因子可以沉淀在糖尿病肾病的发展。值得注意的是,Notch信号通路的激活可以诱导肾小球和管状病变的形成这一疾病的特征(1,2]。Jagged1,切口配体及其目标基因产物,Hes1,升高糖尿病肾病患者肾活检,进一步暗示切口激活这种疾病(3- - - - - -5]。尽管有证据表明,缺口激活存在于糖尿病肾病标本在活的有机体内没有报道,调查了Notch信号在糖尿病肾病的发展。

糖尿病肾病的早期阶段与变化在某些细胞因子,生长因子,和粘附分子,包括TGF - ,一个中央纤维化反应的中介。增强纤连蛋白(FN)沉积阻力指标纤维化,也许可以最终导致肾小球硬化症和特征的终末期糖尿病肾病(6]。Jagged1的水平,Jagged2, Notch1 4显著调节人类肾上皮细胞系(cc - 2554)与TGF - 治疗剂量依赖性的方式(7]。Notch信号通路是否直接参与糖尿病肾病的发病机制仍不清楚。

阐明分子事件参与Notch信号可能加速糖尿病肾病,我们调查是否超出正常水平的等级可以启动糖尿病肾病的迹象在体外模型。确定高葡萄糖Notch通路分子的影响,肾小球系膜细胞(gmc)培养与不同浓度的葡萄糖(5.6,15、25或35更易/ L)和不同的时间(12小时、24小时、48小时)。Notch通路的表达水平在GMC然后使用西方墨点法测量组件,rt - pcr和immunofluorescent染色和激光扫描共焦显微镜。我们的初步结果支持Notch信号分子通过TGF -可能导致这种疾病 激活。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

大鼠系膜细胞(HBZY-1)培养 与 有限公司2在低葡萄糖DMEM包含 胎牛血清和 青霉素、链霉素。细胞在第一和第三通道进行了分析。一旦达到细胞 confluency,血清剥夺 24小时的边后卫。随后,细胞被刺激与各种媒体在没有或在不同浓度葡萄糖的存在。high-glucose曝光之前,一些细胞暴露在1μmol / l N - (N - (3 5-difluorophenacetyl) -l-alanyl-S-phenyl-glycine t-butylester(榫眼),可以抑制Notch通路上,添加到低葡萄糖中2 h。gmc被随机分为以下六类:(我)正常对照组(NC组),介质包含5.6 L更易与葡萄糖;(2)15更易/ L葡萄糖组(HG1组),与介质包含15更易/ L葡萄糖;(3)25更易/ L葡萄糖组(HG2组),与介质包含25 L更易与葡萄糖;(iv)35更易与L葡萄糖组(HG3组),与介质含有35更易与L葡萄糖;(v)渗透压集团控制(OP组),与介质包含5.6更易与L / L葡萄糖+ 19.4更易与甘露醇;(vi)榫眼干预组(HD组),介质包含25 L更易与葡萄糖+ 1μmol / L榫眼。

2.2。RNA隔离和一

细胞被收集在12 h, 24 h, 48 h后时间点葡萄糖或榫眼曝光,立即在冰冷的磷酸盐(PBS)洗。细胞细胞溶解在1毫升的试剂盒试剂、和总RNA是孤立的如前所述。样本反向转录(RT)的互补使用上标二世逆转录酶(成都,打破)根据制造商的指示。一个25的互补dna被放大μ互补脱氧核糖核酸(4 L聚合酶链反应混合物模板μL), 1μL每个正向和反向引物,和12.5μl FTC2000 PCR反应混合液(Funglyn生物技术、加拿大)。引物是针对放大Jagged1、Notch1 Hes1, FN, TGF - ,GAPDH基因区域(Shengong、上海、中国)。使用以下引物序列:Notch1,意义上,5′猫CTC CGA CTT猫CTA TC-3′,反义,5′tct有条件现金援助有条件现金援助TGT TGT TC TG-3′;Jagged1感觉5′gct GGG亚美大陆煤层气有限公司棉酚CAA CC-3′,反义,5′有条件现金援助GGA GGG CAG ATA CAC-3′;Hes1感觉5′cgg ACA AAC CAA AGA CC-3′,反义,5′亚美大陆煤层气有限公司TCG CGGGTC ACC TTC a - 3′;FN感觉5′tgc CGA ATG标签ATG gg a - 3′,反义,5′AAA TGA CC法GCC AAA GC-3′;TGF - 感觉5′atg GTG广汽公司治理文化AAC AAC-3′,反义,5′gag CAC TGA AGC棉酚AGC-3′;GAPDH感觉5′有条件现金援助CAA手枪TGT CAG CAA条t - 3′,反义5′cca太极拳ACA GTC TTC TGA GT-3′。

2.3。西方墨点法

收获细胞与PBS轻轻洗两次,然后在5分钟1000 rpm的颗粒状 。300年细胞颗粒细胞溶解μL蔗糖缓冲区(0.125毫升1.0米三pH值7.5,0.125毫升3.0 M氯化钠,25岁μL 10% SDS, 25岁μL TritonX, 100μL蛋白酶抑制剂)/ 100毫米培养皿。溶菌产物都摇动了冰面上15分钟,全细胞蛋白提取得到。sds - page示例加载缓冲区 补充道,和细胞分数煮 无菌水。蛋白质和抗体探测提出了针对Jagged1(鑫公司兔子,1:400年,中国),Notch1(中山z - 6014,北京),Hes1(圣克鲁斯老鼠,1:400年,美国),和 肌动蛋白(鼠标1:1000年,Beyotime生物技术研究所、中国)。TGF - 中科抗体(兔子,1:1000年,美国),GAPDH (Beyotime鼠标,1:1000年,中国),和Smad4抗体(圣克鲁斯兔子,1:500年,美国)。

2.4。免疫荧光显微镜

我们对待GMC 5.6更易与L / L或25更易与葡萄糖的存在与否榫眼24 h。细胞生长在盖玻片6-well盘子。一夜之间坚持后,细胞治疗与媒体包含高葡萄糖、甘露醇、榫眼媒体24小时。这些细胞被固定 多聚甲醛(皮尔斯)和permeabilized 渐变20(σ)10分钟后被短暂PBS。细胞被封锁 血清1 h与初级抗体在一夜之间在室温和孵化与PBS洗紧随其后。40分钟的细胞被孵化与适当的二次抗体共轭FITC荧光染料。盖玻片是清洗和安装到幻灯片使用荧光安装介质(Beyotime、上海、中国)。控制细胞孵化主要抗体。DMIRE图片拍摄2激光扫描共焦显微镜(德国徕卡)。

以下用于免疫荧光抗体:山羊anti-Notch1 (1: 50;z - 6014;中国北京)、鼠anti-Hes1 (1: 50;sc - 166378),和兔子anti-Jagged1(1: 50一心,上海,中国)。

2.5。统计分析

所有的值表示为手段 标准错误(S.E.)从至少三个独立的实验。统计学意义是评估使用方差分析。意义是 。所有数据用SPSS统计软件进行了分析。

3所示。结果

24 h后文化,与正常血糖控制相比,所有Notch信号分子的蛋白质表达水平在GMC HG2组显著增加 。在OP组,Notch通路的表达组件在统计学上类似于NC组 (图1)。rt - pcr证实了这些趋势对mRNA表达(图2)。

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图1
Notch通路的表达组件以治疗后免疫印迹GMC各种葡萄糖浓度24 h。(一)Notch-associated分子蛋白质在不同葡萄糖浓度和高渗透压在24 h。Notch-associated分子增加高葡萄糖组;他们HG2集团最重要的变化,但没有明显的NC组和OP组之间的差异。(b)灰色的图表显示了相对Notch-associated分子为每个组的统计值。Notch-associated分子的表达在高葡萄糖组增加,尤其是HG2组。◊ 与OP组;▴ 与NC组,▪ 对HG集团;* 和HG2组。
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图2
Notch通路组件的mRNA水平在每个群gmc。(一)rt - pcr带图表对不同浓度的葡萄糖。通道组件mRNA高葡萄糖组的增加,特别是在HG2组。(b)相应的mRNA水平的相对灰度值统计图。◊ 与OP组;▴ 与NC组;▪ 与HG1组;* 和HG2组。

细胞培养中有或没有高葡萄糖(25更易/ L)收获暴露后不同时间点(12小时、24小时或48 h)。在24小时的时间点,所有Notch-related蛋白质显著增强 。Notch1蛋白质增加12 h和24小时时间点,与24小时增加更明显(图3)。所有分析了Notch信号组件的信使rna表达水平有显著调节在12 h时间点 。Notch1 mRNA的表达显著增强只有12 h时间点。Hes1 mRNA的表达水平显著调节在12 h和24 h 时间点,12 h增加更明显(图4)。

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图3
Notch通路的表达组件gmc 25 L更易引起的葡萄糖在不同时期决定用免疫印迹。(一)免疫印迹带图表对不同时期。在24小时的时间点,所有Notch-related蛋白质显著增强。Notch1蛋白质增加12 h和24小时时间点,与24小时增加更明显。(b)灰度值统计图的蛋白质水平。▴ 与NC组;• 对12 h组;▪ 与24小时组。
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图4
FN的mRNA水平在每个群gmc。(一)rt - pcr带图表对不同时期。所有Notch信号组件的mRNA表达显著调节在12 h时间点。的表达Notch1信使rna在12 h时间点明显增强。的表达水平Hes1信使rna调节明显在12 h和24 h 时间点,12 h增加更明显。(b)相应的mRNA水平的相对灰度值统计图。▴ 与NC组;• 对12 h组;▪ 与24小时组。

榫眼治疗后,蛋白表达水平的所有Notch通路组件(Jagged1, Notch1和Hes1)显著降低 (图5)。利用rt - pcr(图发现了相同的结果6)。

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图5
Notch通路的表达组件与榫眼决定干预后用免疫印迹24 h。(一)免疫印迹Notch1和Jagged1带图表。(b)免疫印迹Hes1带图。(c)灰色的图表显示了相对统计每组中值Notch通路组件。与NC组相比,通路的表达组件HG2组蛋白显著增加。榫眼干预后,切口途径组件的蛋白表达减少。▴ 与NC组;• 和HG2组。
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图6
Notch通路的表达组件与榫眼干预后决定使用PCR 12 h。(一)rt - pcr Notch1和Jagged1带图表。(b) rt - pcr Hes1带图。(c)灰色的图表显示了相对统计每组中值Notch通路组件。与NC组相比,Notch通路组件mRNA的表达显著增加HG2组。榫眼干预后,Notch通路组件的mRNA表达下降。▴ 与NC组;• 和HG2组。

在细胞immunofluorescent染色和激光扫描共焦显微镜应用程序,Notch1蛋白质在细胞质中弱表达的细胞培养在5.6 L更易与葡萄糖。与25更易/ L高葡萄糖治疗后24 h, Notch1细胞质中的表达水平显著增加,但仍无法觉察的GMC核。GMC接受榫眼,Notch1显著降低在细胞质的表达与细胞暴露于25 L更易与葡萄糖相比。Jagged1蛋白表达在细胞质和细胞核的细胞在正常葡萄糖条件下培养。在治疗25更易与24 h / L葡萄糖,Jagged1表达显著增加。与25 L更易与葡萄糖组相比,Jagged1 DAPT-exposed组的表达下降在细胞质和核箱内,细胞核中表达较弱。Hes1蛋白质在细胞质中弱表达GMC处理5.6更易与葡萄糖/ L。与25更易与治疗后24 h / L葡萄糖,Hes1表达显著增加细胞质和细胞核的GMC。Hes1蛋白质DAPT-exposed组的水平是减少在细胞质和核箱内,与高glucose-treated组相比,比在细胞质中表达较弱核(图7)。


图7
Notch通路的表达组件在gmc immunofluorescent染色和激光扫描共焦显微镜的应用程序。一、数控组;B, HG2组;C, HD组;D, OP组;E -控制。Notch通路组件作为绿色荧光蛋白质在细胞中被检测到。Notch通路组件蛋白质NC组中没有检测到,但这是著名HG2组没有显著变化的结果高渗透压。蛋白质不被探测到的榫眼干预组。原始的放大 。

与NC组相比,TGF -的表达 和Smad4蛋白质在HG2组显著增加。榫眼干预之后,他们减少(数字8和9)。FN和过渡政府的mRNA的表达 改变了在相同的趋势(图10)。

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图8
TGF -的表达 与榫眼干预后确定为24小时使用免疫印迹。(一)免疫印迹带图。(b)灰色的图表显示了相对TGF -统计值 在每一个组。与NC组相比,TGF -的表达 蛋白质在HG2组显著增加。榫眼干预后,蛋白表达的TGF - 降低了。▴ 与NC组;• 和HG2组。
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图9
Smad4的表达与榫眼干预后确定为24小时使用免疫印迹。(一)免疫印迹带图。(b)灰色的图表显示了相对Smad4每组的统计值。与NC组相比,Smad4蛋白质的表达显著增加HG2组。Smad4的榫眼干预后,蛋白表达减少。▴ 与NC组;• 和HG2组。
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图10
FN的表达和过渡政府 与榫眼干预后决定使用PCR 12小时。(一)rt - pcr带图表FN和过渡政府 。(b)灰色的图表显示了相对FN和过渡政府的统计值 在每一个组。与NC组相比,FN的表达和过渡政府 信使rna在HG2组显著增加。榫眼干预后,FN和过渡政府的mRNA的表达 降低了。▴ < 0.05与NC组;• 和HG2组。

4所示。讨论

切口蛋白质是一个家庭的单跨膜蛋白。在哺乳动物中,四个级距指定四种等级受体基因(Notch1 2、3和4)(8,9]。所有Notch-associated蛋白质有助于肾脏发展的过程。Hes1是一个等级目标基因编码转录监管机构。Hes1的表达状态是一个Notch信号通路的激活的标志(10]。Notch1可能参与肝纤维化的发展,这是与肾小球硬化(11]。

畸变Notch通路的表达模式组件影响肾脏的正常发展(12]。通过评估Notch-associated分子的表达,一个人可以间接测量Notch信号的强度。此外,表达、运输和退化Notch-related分子受到几个监管因素(13]。例如,切口受体与配体的相互作用在细胞表面可以触发信号通路和主体第二和第三消化反应的受体14]。第三消化反应后,切口可以被激活,和切口胞内域研究所可以为后续释放到细胞质核易位。在细胞核中,镍镉结合DNA结合蛋白CSL激活靶基因的转录(他,嘿,和蜗牛)老妈代数余子式和p300共激活剂(15- - - - - -17]。除了监管在receptor-ligand层面,Notch通路由泛素化调节,退化,蛋白质运输水平,等等。

之前的报告表明,Jagged1的表达水平,Notch1和Hes1增加培养足细胞和人类胚胎肾细胞治疗后高葡萄糖(18]。同样地,我们发现高葡萄糖可以激活Notch信号(即。,increase Notch1 expression) and upregulate related molecules in mesangial cells. Jagged1 and TGF- 表达与肾小球病变在糖尿病大鼠模型和糖尿病患者局灶节段性肾小球硬化症。Notch信号通路相关基因的失活可以减少肾小管上皮细胞的纤维化和增加Notch1的特异性,导致过度蛋白尿(19)和阻力指标纤维化(也许可以加速发展20.]。Jagged1调节在输尿管梗阻模型在TGF - 端依赖的方式(7]。

TGF - 信号通路由TGF - 总科,TGF - 受体,Smads蛋白质家族,其调节基因。每个组件代表亚型(21]。TGF - 总科包括TGF - 亚科(TGF - 1 - 6)、苯丙酸诺龙和骨形成蛋白(22]。TGF - 可以增加Jagged1和Hes1在人类肾脏的表达(香港)上皮细胞(5]。治疗后TGF - 1 24 h, Jagged1 Hes1 mrna在HK-2增加细胞(23]。在我们的研究中,我们发现在HG2 Smad4的蛋白表达显著增加。Smad4的榫眼干预后,蛋白表达减少。这表明TGF - 确实通路被激活在我们的研究中。

TGF - 可以促进系膜基质的合成和沉积,TGF - 是一个关键因素在肾纤维化的发展24,25阻力指标纤维化也许可以]和[26]。先前的研究已经发现了一个正反馈循环TGF - 切口在角化细胞信号,upregulation TGF - 可以增加切口配体的表达,Jagged1 [27,28]。我们的研究表明,缺口信号分子的表达水平显著降低所有DAPT-exposed组相比,细胞治疗高葡萄糖榫眼的缺失。这一发现表明,榫眼通路可以灭活尽管高葡萄糖背景。

虽然我们的实验表明,高葡萄糖接触可能激活Notch信号和榫眼可以减少TGF -的表达 和FN,没有令人信服的证据证明榫眼可以预防糖尿病肾病的发生。因此,进一步的研究证实了我们使用动物模型是必要的在体外结果。

5。总结

我们报告高葡萄糖可以上调Notch信号的表达在GMC同时上调表达的TGF - 、Smad和FN。Notch信号通路的激活可能诱发TGF - 信号通路,参与了糖尿病肾病的发病机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突,财务或其他。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(30670980)。作者感谢神经生物学实验室的工作人员,临床中心实验室,Cordis-myoelectricity实验室的技术援助。作者还感谢生物医学校对英语表达抛光。Chenlin高co-first作者。