文摘
背景和目的。脂肪组织功能紊乱的结果许多因素,包括glycation-induced微血管损害赔偿金。我们测试的有用性抑制methylglyoxal-induced糖化脂肪组织微脉管系统的工作,使用抗氧化和二羰基清道夫药物吡哆胺。方法。一群Wistar鼠处理日常与丙酮醛(毫克,75毫克/公斤/天,8周)。一半的这组与吡哆胺治疗后4周(Pyr)(100毫克/公斤/天)和另一半没有任何进一步的治疗(毫克)。一群Wistar鼠没有MG治疗被用作控制(C)。结果。MG组显示高密度脂蛋白胆固醇降低,增加血浆游离脂肪酸水平,什么被吡哆胺恢复。毫克还导致增加组织玻璃纸(糖化标记)水平,以及增加PAS染色和马森Trichrome-positive组件。吡哆胺导致玻璃纸和TGF -β所观察到的类似水平控制老鼠和抑制的积累不是和马森Trichrome-positive组件。MG减少bcl - 2 /伯灵顿比引起的(细胞凋亡的标志)和vWF染色(微血管标记),部分恢复的治疗维生素b6。结论。防止methylglyoxal-induced堆积糖化和纤维材料的使用吡哆胺改善脂肪组织的微血管病变。
1。介绍
脂肪组织功能紊乱依赖于很多和异构的因素,包括分泌功能受损、胰岛素抵抗、脂解作用,被认为是引起的炎症机制的激活。反过来,由于过多的脂质会激活炎症吸收,脂肪细胞肥大和缺氧。除了有限的肥厚性脂肪细胞之间的氧的扩散能力,缺氧也从微血管功能障碍和降低补偿血管生成结果1- - - - - -4]。这些机制被认为是导致2型糖尿病的发展和进展。最近,我们的团队表明,微血管功能障碍和伴随的缺氧可能是由于methylglyoxal-induced糖化,脂肪组织功能障碍可能构成一个新的因素在2型糖尿病进展(1]。因此,新策略改善微血管功能的脂肪组织可能强烈有助于防止这些机制。
甲基乙二醛(MG)是一种高活性二羰基化合物,内生形成在脂质过氧化作用和糖酵解。不可逆转的形成晚期糖化终产物(年龄)甲基乙二醛是途径之一负责糖尿病危害并发症,不仅由于增加交联胺基酸和蛋白质错误折叠,但也由于愤怒激活(受体)2,3]。我们表明,Wistar鼠methylglyoxal-induced年龄积累脂肪组织增加导致hypoadiponectinemia,血浆游离脂肪酸增加,纤维化,减少灌溉、缺氧,更高水平的凋亡标记(比例bcl - 2、Bax和半胱天冬酶3),和巨噬细胞招聘1]。,其他作者表明MG-induced年龄积累导致微血管功能障碍在其他模型5- - - - - -8]。
吡哆胺是一种维生素B6导数,这属于B族维生素的家庭,一群被称为辅酶维生素几个细胞代谢通路。吡哆胺是一种抑制剂的美拉德反应和年龄的拦截器从Amadori形成产品,主要是因为它作为一个双自由基的清道夫和羰基的物种。观察吡哆胺减少年龄积累,部分原因在于增加glyoxalase-I表达和减少氧化应激和愤怒水平在糖尿病并发症的几款6,9- - - - - -12]。
这项工作旨在评估年龄的抑制脂肪微脉管系统的有效性,在methylglyoxal-induced糖化。选择吡哆胺由于其年龄超过形成双重抑制功能。
2。材料和方法
2.1。试剂
除非另有说明所有试剂都购买了默克达姆施塔特(德国)、Sigma-Aldrich(欧洲大学协会)或Pancreac Quimica SA(西班牙)。抗体是针对肌动蛋白(美国微孔MAB1501R),移动电话(KH025、转基因Inc .、日本),愤怒(ab3611, Abcam,英国),TGF -β(MAB240、研发系统公司),伯灵顿,bcl - 2 (SC 6236和SC7382,圣克鲁斯生物技术,美国),和vWF(美国DAKO A0082)。
2.2。动物模型
在这个工作我们学习6个月大的Wistar鼠,从我们医学院的繁殖地,Coimbra的大学。一群Wistar鼠是处理甲基乙二醛在日常水(σ,美国)在8周(75毫克/公斤/天,稀释在水里)。在此期间,这些老鼠分成两个子组:一个是接受维生素b6 (Pyr)(美国σ)在接下来的4周(100毫克/公斤/天稀释在日常水)(13,14),而其他没有任何治疗(毫克)。对照组(C)没有任何治疗实验的整个期间(每组)。MG政府暂停了吡哆胺治疗开始的时候,为了避免体外与维生素b6的交互。动物保持每笼(2)标准下通风,温度(22 - 24°C)、湿度(50 - 60%),和光线(12小时光/ 12小时黑暗)免费的水和食物(标准饮食AO4、Panlab巴塞罗那)。在对待动物,用水量是每天监测剂量调整的目的。实验协议批准的当地机构动物保健和使用委员会,和所有的程序都由授权用户(FELASA)。
2.3。在活的有机体内分析和样品收集
在治疗结束时,体重的决心。血糖、空腹(16小时)和腹腔内2小时后血糖管理(1.8 g / Kg),测量在尾静脉葡萄糖氧化酶法,使用一个和活性测试条纹(Elite-Bayer SA、葡萄牙)。糖化血红蛋白测定使用DCA2000 +系统(西门子、葡萄牙)。
血液样本通过心脏穿刺麻醉动物(氯化氯胺酮(75毫克/公斤,i.m.。,Parke-Davis, Ann Arbor, USA) and chlorpromazine chloride (2.65 mg/kg, im, Lab. Vitória, Portugal)), after 16 hours fasting. Serum and plasma were collected using tubes BD Vacutainer and BD Vacutainer K3E, with 5.4 mg EDTA (UK), respectively. Blood was centrifuged at 3500 ×g, 4°C, 10 minutes and plasma and serum were aliquoted and stored at −80°C. After blood collection, animals were sacrificed and epididymal adipose tissue was harvested, washed in 0.9% NaCl, and immediately stored in 10% formalin or frozen at −80°C.
血清胆固醇(总和HDL)和甘油三酯测定使用商业套装(Olympus-Diagnostica、葡萄牙、Produtos de记录SA,葡萄牙)。血清脂联素的浓度是由商用ELISA试剂盒(脂联素免疫测定工具包KRP0041,英杰公司)。血浆游离脂肪酸水平评估spectrophotometrically使用half-micro测试(11383175001罗氏诊断,德国)。
2.4。西方墨点法
组织部分300毫克的均质在缓冲区包含25毫米三,150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1毫米EDTA, EGTA 1毫米,10毫米PMSF和40μL / g组织蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(美国σ),pH = 7.7和离心机在14000×g, 20分钟,4°C。收集上清液,再离心,和蛋白质浓度测定采用BCA法(皮尔斯,美国)。样品(50μg)在10%的丙烯酰胺凝胶和sds - page分离转移到PVDF膜。膜被封锁TBST解决方案(25毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,0.1%的渐变,pH = 7.6)与5% BSA补充。膜在一夜之间被孵化在4°C各自主要抗体(移动电话,愤怒,TGF -β、bcl - 2、Bax稀释1:1000年TBST解决方案补充1% BSA)和在2小时在室温下与二次抗体(anti-rabbit /鼠标1:10000;通用电气医疗集团、英国)。膜是孵化ECF和显示使用台风系统(英国通用电气医疗集团生命科学)。膜使用软件图像定量分析(分子动力学、美国)。
2.5。组织学
组织部分(4μ米)都沾过碘酸希夫(PAS;碳水化合物和马森glycoconjugates)和三色的(胶原蛋白/结缔组织),两片/动物,每组三种动物。免疫染色后进行清蜡、水化和阻塞,遵循制造商的建议(DAB150 immunoperoxidase二级检测系统JH1743622,微孔,美国)。一夜之间,部分被孵化在4°C的主要抗体(TGF -β和vWF,稀释1:100在PBS)和1小时在室温下与二次抗体(Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白和Alexa萤石568山羊anti-mouse免疫球蛋白,英杰公司,美国)。最后,部分安装有安装介质(美国DAKO)和分析在荧光显微镜(徕卡DMIRE2、徕卡微系统公司、德国)。荧光是石蜡的调整来避免背景荧光。vWF量化十随机捕获图像(图像包含大型船只被排除在外)从两片/动物/每组三种动物。荧光定量使用软件执行ImageJ(美国国家卫生研究院)。
2.6。统计分析
结果意味着±SEM。单向方差分析测试是用来确定统计差异。事后图基进行测试来评估群体之间的差异。被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。代谢轮廓和功能系统标记
MG政府在8周(MG组),以及用吡哆胺治疗4周(Pyr组)期间,并没有导致体重的重要改变,血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯和总胆固醇、控制(C)组相比(表1)。然而,MG组显示HDL胆固醇水平明显降低,而C组(),由吡哆胺治疗恢复(Pyr集团)()(表1)。关于血清脂联素水平,无显著变化(图中被发现1(一))。另一方面,MG管理导致循环增加游离脂肪酸水平,相比,C组(),这表明脂肪细胞功能障碍。反过来,吡哆胺治疗规范化血浆游离脂肪酸水平()(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。组织微血管功能障碍的标记
3.2.1之上。糖化
糖化是微血管功能障碍有关。MG治疗8周导致增加nε-(羧乙基)赖氨酸(移动电话)积累脂肪组织,而C组()(图2(一)),但没有造成大的愤怒表情的变化(图2(b))。吡哆胺管理显著恢复玻璃纸积累脂肪组织(),导致价值观类似于控制老鼠(图2(a))。PAS染色是碳水化合物的积累和非特异性糖化材料。按照玻璃纸的水平,大幅增加的不是材料中观察到MG-treated老鼠的脂肪组织,相比,C组。这种积累是由吡哆胺恢复治疗,导致表型类似于控制老鼠(图3(一个))。
(一)不是(200 x)
马森(b)三色的(200倍)
3.2.2。纤维化
马森三色的染色显示组件富含胶原蛋白。MG 8周期间管理导致更多的脂肪组织中的纤维组件。另外,染色观察PAS-positive地区。再一次,吡哆胺治疗导致降低了纤维材料,导致表型相似的控制老鼠(图3 (b))。转化生长因子-β(TGF -β)前身是观察吡哆胺治疗后下降,相比毫克组()(图4(a))。没有观察到显著差异的裂解形成TGF -β(图4(b))。TGF -的组织学染色β显示,毛细血管积累,建议由其colocalization血管性血友病因子(图4(c))。
3.2.3。细胞凋亡
bcl - 2、Bax的比值可以作为细胞死亡的凋亡倾向的指标。MG组中这个比例的减少,相比,C组(),表明MG-induced糖化倾向会导致细胞死亡。这些影响是完全恢复的治疗与吡哆胺()(图5(一个))。
(一)
(b)
3.2.4。内皮功能障碍
量化的vWF荧光染色法是用作脂肪组织微脉管系统的一个标志,因为它是一个标记的内皮细胞,存在于血液循环。MG管理导致明显降低脂肪组织vWF水平,相比,控制大鼠()。吡哆胺治疗后显著差异与C组不再是观察,尽管观察MG和Pyr组之间无显著差异(图5 (b))。
4所示。讨论
本研究探讨吡哆胺的清道夫属性和有益的行动methylglyoxal-induced微血管损害在脂肪组织中。高密度脂蛋白胆固醇的重大改变,游离脂肪酸,玻璃纸,PAS染色,TGF -β前体,马森三色的染色,bcl - 2、Bax比率,和部分vWF被吡哆胺恢复。从我们的实验室按照先前的报道,MG政府在8周体重没有显著改变,血糖和糖化血红蛋白(1,7]。一旦没有发现改变葡萄糖代谢,MG治疗后病变观察只是由于直接MG的效果。然而,MG政府增加系统性游离脂肪酸水平,表明脂肪组织功能障碍,由于较高的脂解作用。这些结果也按照我们之前观察MG治疗后在14周(1]。作为演示在Zucker糖尿病大鼠(二台)13,15)、吡哆胺效果导致降低系统性的游离脂肪酸水平。我们之前和现在的结果表明,MG治疗导致血清脂联素水平降低,但这些影响可能被收购期间,因为它们是重要的只有14周后的MG管理(1,7]。MG治疗8周期间可能对脂联素水平较低的影响,或可能已经失去了效果,因为老鼠一直在MG治疗4周后与水。
玻璃纸决定,因为它是一个重要的时代形成的直接从毫克(8]。以前,玻璃纸水平之间的相关性和MG管理局在自发性高血压大鼠的主动脉16和GLO1转基因大鼠的视网膜6]。正如所料,MG政府在8周导致玻璃纸水平和增加PAS-positive材料积累脂肪组织,按照先前的报道(1,17]。然而,8周的MG治疗愤怒水平并不足以引起重大变化在脂肪组织中,什么是依照以前的数据从我们的实验室(未发表的数据)。然而,这种效应在主动脉后14周MG管理(7]。
以前的在体外长从奥诺拉托和他的同事的研究表明,吡哆胺抑制年龄以及随后的蛋白质形成修改,功能一般在2型糖尿病(18]。几个作者描述,吡哆胺抑制时代形成的反应和扫气二羰基中间体(11,19]。吡哆胺在减少时代形成的作用在体外系统(18),在不同的动物模型,包括STZ-induced糖尿病老鼠和ZDF老鼠,也观察到(11]。根据,在我们的研究中治疗与毫克维生素b6在4周后政府明显降低移动电话引起的水平在脂肪组织和PAS-positive组件。
先前的研究表明,MG诱发微血管损害和糖尿病并发症。在活的有机体内研究中使用Wistar鼠增加TGF -β在肾小球、管状、间质和内皮细胞的肾17]。在体外,造成胶原蛋白糖化MG myofibroblast刺激人类心脏成纤维细胞的分化,TGF -β端依赖的方式。这个过程被称为纤维化的发展糖尿病的关键(20.]。期间,我们报道了MG管理14周也导致增加TGF -β表达式,以及增加马森三色的染色(1]。在目前的研究中,我们表明,即使在MG治疗8周高积累马森三色的组件发生。在体外研究吡哆胺透露,它保护MG-induced整合蛋白绑定和细胞粘附,血管增厚的一件大事10]。在这里,我们表明,吡哆胺治疗降低了TGF -的表达β前体和抑制的积累马森Trichrome-positive材料,表明之间的因果作用增加糖化标记和profibrotic反应。Colocalization TGF -β和vWF表明TGF -β表达主要发生在血管区域。这表明存在纤维化微脉管系统的脂肪组织,可能是为当地的微血管病变的重要因素。
之间的比例bcl - 2、Bax MG治疗后下降,根据一些报告是什么从我们和其他实验室(1,21,22]。我们组表明,减少bcl - 2、Bax比率增加内皮细胞死亡和更高的血管功能障碍在视网膜上(21]。此外,我们表明,这个事件也与脂肪组织血液供应减少,可能导致缺氧,导致脂肪细胞功能障碍的主要因素(1]。观察吡哆胺预防细胞死亡,细胞凋亡在人类晶状体上皮细胞系HLE-B3 ZDF老鼠的洪流的镜头,通过argpyrimidine形成的抑制作用5,23]。维生素B6含量db / db2型糖尿病的小鼠模型,吡哆胺减少建立糖尿病肾病的进展(14]。
正如前面提到的,我们之前报道,MG政府在14周会减少脂肪组织的血液供应,主要通过增加内皮细胞死亡和受损的血管生成。在这项研究中,我们表明,这些效果是类似的8周后,尽管更温和。尽管吡哆胺是有效地减少大多数病变标记,不能够显著提高脂肪vWF水平与MG-treated老鼠。然而,vWF水平不再减少与控制老鼠,暗示部分效果。
5。结论
我们表明,减少脂肪组织糖化和纤维化使用吡哆胺可能是一个有用的策略来改善脂肪组织微血管病变。这可能有助于防止脂肪组织功能紊乱在2型糖尿病进展。
缩写
| W: | Wistar鼠 |
| 年龄: | 高级糖化终端产品 |
| 移动电话: | (nε)-羧乙基赖氨酸 |
| MG: | 甲基乙二醛 |
| 不是: | 高碘酸希夫的 |
| 愤怒: | 高级糖化成品受体 |
| TGF: | 转化生长因子 |
| vWF: | 血管性血友病因子。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢Servico de解剖学Patologica, Coimbra的大学医院,尤其是Ilda摄影记者与组织学技术支持。他们从实验室感谢摄影记者马里奥的技术支持。作者感谢葡萄牙基础科学和技术(FCT,项目PTDC / SAU-OSM / 67498/2006)和医学院,Coimbra的大学。