文摘

HLA类II-restricted调节性T细胞(Treg)抗原表位免疫球蛋白(也称为“Tregitopes”)已报告抑制免疫反应coadministered抗原刺激自然亚群的扩张(nTregs)。我们评估其影响人类对胰岛细胞抗原的免疫反应体外和1型糖尿病的调制(近年来)在小鼠模型在活的有机体内。合并施打Tregitopes内转至抗原延迟发展点头小鼠高血糖和糖尿病的发病率。抑制糖尿病发病后甚至可以观察到疾病。测量Tregitope治疗T细胞反应的影响,我们评估在DO11.10 Tregitope治疗小鼠的影响。Upregulation FoxP3的KJ1-26-stained OVA-specific CD4细胞⁺治疗后观察T细胞与Tregitopes DO11.10老鼠,以及减少anti-OVA搞笑和T效应响应。在体外研究人类T细胞、外周血单核细胞(PBMC)反应GAD65抗原表位存在和缺乏Tregitope变量。抑制GAD65免疫反应的抗原表位体外由Tregitope似乎更有效地分析利用新诊断糖尿病患者PBMC主题名糖尿病患者比其他更成熟,抑制的程度的相关性和预测HLA限制Tregitopes的证实。实现定义的这些调节性T细胞抗原表位的治疗近年来和其他自身免疫性疾病可能导致疾病管理的范式转换。

1。介绍

诱导免疫抗原宽容是一个逻辑策略治疗1型糖尿病(近年来)。近年来是一个瀑特异性自身免疫性疾病造成破坏产生胰岛素的胰岛β细胞。在刻意,删除胰岛抗原T细胞在胸腺发展,呈现的无能,或者转换为调节性T细胞亚群),积极抑制效应对胰岛细胞抗原的反应。在人与近年来非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型近年来,这些致耐机制不正常工作。在人类中,缺陷提出了亚群作为一个机制,个人发展近年来,这个缺陷是功能性和定量(1]。在缺乏监管的有效抑制,CD8⁺和CD4⁺auto-reactive胰岛抗原T细胞反应了人类白细胞抗原(HLA)分子。胰岛细胞的渐进破坏这些auto-reactive细胞最终会导致葡萄糖耐受不良。

自然亚(nTregs)免疫调节的一个重要组成部分在末梢循环,抑制auto-reactive无关抗原的T细胞反应contact-dependent和独立的机制(2]。的扩张nTregs小说被认为是一个潜在的治疗糖尿病的治疗(3]。理想情况下,在这里,政府的nTregs或nTreg-inducing疗法与胰岛细胞“目标抗原(s)”将auto-reactive T细胞转化成适应亚群,恢复抗原宽容。扩大nTregs通常是通过非特异性方式执行(2)以来,很少有例外(4,5),nTregs仍未知的抗原特异性。自身免疫反应可以通过nTregs调制通过抑制附近auto-reactive效应器的抗原活动和/或通过改变表型的效应物诱导Treg (iTreg)表型。

我们之前确定一组Treg抗原表位来自免疫球蛋白G(免疫球蛋白)诱发亚群扩大,导致抗原公差(6)(图1)。我们假设这些Tregitopes (T regulatory细胞epitopes)中包含的是自然的T细胞抗原表位免疫球蛋白;他们的存在免疫球蛋白的高度保守的领域或许可以解释为什么静脉注射免疫球蛋白治疗与nTregs在老鼠和人类的扩张7,8]。Tregitopes可以被定义为肽(a)绑定到多个MHC II级分子,(b)诱导抑制效应T细胞亚群co-delivered抗原反应,(c)上调Treg-associated细胞因子和趋化因子。T细胞,扩大针对Tregitopes展览T监管表型()[6]。除了于2008年首次描述的Tregitopes,几个Tregitopes符合上述标准已确定的工厂(框架)和免疫球蛋白的Fc地区。我们和其他人认为Tregitopes可能发生在其他常见血清蛋白质如白蛋白(9]。Tregitopes用于本研究包括两个先前描述人类Tregitopes (hTregitopes), 167年和289年,和两个小鼠同源染色体的hTregitopes 167年和289年(mTregitopes),它位于免疫球蛋白Fc的CH1和CH2域,分别。

亚被抑制T细胞反应直接或间接(10]。一致对nTregs现有理论,旁观者的直接抑制T细胞可能由Tregitope-specific nTregs [10,11)通过某些细胞因子的表达和/或调制的抗原呈递细胞(APC)对致耐表型。间接抑制(不是特定于T细胞表位或者Tregitope认可nTreg)是由自适应亚群,也称为iTregs [2,10]。在目前的研究中,我们测试了Tregitopes抑制免疫反应的能力在活的有机体内有和没有鼠preproinsulin (PPI,胰岛细胞抗原)抗原表位的点头模型近年来。我们还与Tregitopes DO11.10治疗小鼠,以确定对旁观者效应细胞的影响在活的有机体内,使用定义良好的试剂检查从这些小鼠抗原T细胞。DO11.10研究允许考试Tregitope效应引起完全是因为感应nTregs和随后的感应iTregs, DO11.10的情况下,将卵巢抗原特异性。

如果像本文所演示的,激活nTregs Tregitopes和随后的感应iTregs可以减缓或停止的免疫破坏胰腺的胰岛β细胞,Tregitopes可能使用在糖尿病早期治疗保护内源性胰岛素的分泌。此外,潜在的Tregitopes诱导抗原公差(相比更广泛的免疫抑制治疗)可能导致自身免疫性疾病的临床管理的转变,从对抗原免疫抑制和免疫调节。

2。材料和方法

2.1。在网上Immunoinformatics方法

2.1.1。外基质

外基质是一种T细胞epitope-mapping算法用于识别假定的HLA配体/ T细胞抗原表位,如Tregitopes,包含在蛋白质序列(例如,抗原表位鉴定病原体基因组的引用(12,13])。计算是通过比较执行的肽序列的HLA allele-specific系数矩阵。完成一个分析使用外基质算法,目标蛋白质序列解析成重叠9 mer帧,每一帧重叠的最后8个氨基酸。中的每个氨基酸9 mer然后分配一个积极或消极的系数基于先前决定积极的还是消极的倾向影响肽绑定时位于HLA-binding槽内氨基酸的位置(14]。系数然后总结出每个9 mer的原始分数。原始分数归一化对一个分布来源于大量的随机生成的肽序列。从这个分布产生的z分数直接预测不同等位基因进行比较。

2.1.2。ClustiMer

重复执行这个操作在一个大范围的蛋白质序列,从病原体自体蛋白质,我们已经确定,T细胞抗原表位并非随机分布在蛋白质序列,而是倾向于“集群”在一个蛋白质序列15]。T细胞表位“集群”的范围从12至约25个氨基酸长度和可以包含四到40绑定图案重叠9 mer帧。ClustiMer优先识别抗原决定基集群受到多个等位基因HLA二类覆盖95%的人口(16];集群选择以这种方式展示强大的HLA亲和力、T细胞反应(13,17- - - - - -19]。许多最免疫原性T细胞表位的集群包含一个功能我们现在称之为一个EpiBar (20.]。EpiBar是一个9 mer框架预计至少有四种不同的HLA等位基因活性。肽包含EpiBars似乎比预期能够诱导T细胞反应的刺激或抑制表型。这可能是由于强烈的HLA绑定的协同定位主题(12,13]。

2.1.3。选择GAD65抗原表位和集群

外基质GAD65的分析的基础上,我们选择了14肽包含EpiBars在体外HLA绑定化验和T细胞化验使用外周血单核细胞(PBMC)近年来学科。人类GAD65序列从基因库序列数据库获得国家生物技术信息中心(NCBI:入世Q05329)。这个序列被解析成577重叠9-mers和评分预测HLA亲和力使用外基质算法如前所述[21,22]。图2说明了GAD65集群的位置(在深浅的红色突出显示,符合整体外基质分数)选择外基质,以及比较外基质预测和内转至抗原表位发表在最近的一本(蓝色(23])。序列的细节测试在体外也提供了更加详细的表吗1。

数据3(一个)和3 (b)提供更详细的外基质集群报告两个GAD65肽。“EpiBars”出现在这些肽。450年集群位于氨基酸位置(GAD65 450年,图3(一个)),一个EpiBar始于455年框架,第二个从456年开始,三分之一(弱由于整体的得分越低),享年459岁。这个GAD65序列没有之前被确认或发表作为抗原决定基。如图2和图3 (b)有发表GAD65抗原表位位于肽GAD65 550帧557;相同的序列包含一个EpiBar。

2.1.4。项目分析

项目(个性化的T细胞表位测量)工具提供了一个估计是否一个给定的个人将开发一种T细胞反应蛋白抗原,基于HLA绑定的预测。我们用一个数学公式转换DRB1等位基因绑定生成的预测外基质allele-specific评分系统。因此,项目可以被用来定义一个HLA绑定阈值,上面的免疫反应可能是现在和下面的免疫反应可能是个别研究对象缺席。条目分数已被证明与免疫反应在T细胞化验肽在体外(24]。一项得分计算为每个Tregitope肽,结果相比在体外在有关酶联免疫斑点试验两步反应生成。

2.2。肽和多肽合成

本研究中使用的所有肽合成了9-fluoronylmethoxy-carbonyl (Fmoc)合成的纯度> 80%,由高效液相色谱的新英格兰肽(美国马加德纳)和21世纪生化药剂(美国马马尔堡)。肽群众被证实使用q * nanospray质谱仪(新英格兰肽)或MALDI-TOF质谱(21世纪生化药剂)。第三方质量控制是由细胞必需品(美国Cambridge, MA)。Tregitope肽是如前所述6];鼠Tregitopes 167和289中描述Elyaman et al。25]。Tregitope序列,小鼠PPI肽序列,和类II-binding控制肽序列表中列出2。鼠Tregitopes 167年至289年期间,每个包含一个重要的得分(1.98和1.73,分别地。)小鼠二类MHC基因I-Ag7(点头)的基础上在网上分析使用一个外基质实验预测矩阵。无关紧要的控制肽包含预测绑定分数略低点头MHC基因(最高得分为1.51分)。

2.3。脂质体的制备

Sterically稳定的阳离子脂质体是准备从三个脂质部分:dioleylphosphatidylethanolamine(涂料),dimethylaminoethane-carbamoyl-cholesterol (DC-cholesterol)和聚乙二醇2000 -磷脂酰乙醇胺(挂钩)。脂质涨跌互现,干在旋转蒸发器和resuspended磷酸盐(PBS;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)空multi-lamellar囊泡。这些囊泡是用五次30秒每4°C到它们转换成单膜脂质体。单膜脂质体与肽(10 nmol)涨跌互现,flash冷冻,冷冻干燥过夜。封装肽脂质体,由此产生的粉末与无菌蒸馏水和涡resuspended 15秒每五分钟在室温下30分钟。PBS是添加到收益率最终脂质体10 mM脂质/毫克肽的浓度。囊泡直径小于150纳米是由20 - 30挤压通过聚碳酸酯过滤器使用周期Liposofast挤出机(Avestin、加拿大)。脂质体配方被储存在4°C到使用。

2.4。在活的有机体内研究方法

2.4.1。小鼠模型

非肥胖糖尿病(NOD / ShiLtJ)小鼠,近年来的多基因模型,从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)。点头/ ShiLtJ小鼠表现出糖尿病开始在12周的年龄,特点是胰岛炎,胰岛细胞的白细胞的浸润[26]。血浆葡萄糖水平是用来确定疾病发作。T细胞受体(TCR)转基因DO11.10 / FoxP3-GFP和DO11.10 / FoxP3-GFP / Rag2^−−/开发中描述(27]。短暂,FoxP3-GFP鼠标是交叉线DO11.10或DO11.10 / Rag2^−−/老鼠和backcrossed创建纯合子DO11.10 / FoxP3-GFP线。所有的动物都被安置和培育无菌micro-isolator笼子在动物设施由马里兰大学医学院的。

2.4.2。免疫接种

组雌性小鼠免疫肽或蛋白质的运载工具之一:PBS、不完全弗氏佐剂(IFA;Sigma-Aldrich)或脂质体(如上所述)。免疫接种是作为每一个实验表明,腹腔内或在一个后拦路贼被针扎。附加实验提供的细节部分致力于每一个化验。

2.4.3。T细胞表现型和扩散化验(DO11.10)

排水腹股沟和腘节点收获和样本评估通过流式细胞仪对T细胞增殖和Treg扩张。KJ1-26马伯的反应与clonotypic TCR DO11.10表达的转基因老鼠是用来识别T细胞表达转基因OVA-specific识别。发现FoxP3 / GFP⁺亚群,引流淋巴结的单细胞悬浮孵化2.4 g2马伯(anti-CD16/32,写明ATCC) 15分钟块货代,然后沾CD4-PE anti-clonotypic KJ1-26-APC 40分钟在4°C。细胞被收购FACSCalibur流式细胞分析仪(becton dickinson,富兰克林湖,新泽西,美国)和分析使用FlowJo软件(美国Treestar、亚什兰或)。CD4⁺KJ1-26⁺活细胞门人口成立,这些封闭的细胞分析FoxP3表达的GFP荧光指示性的存在。

抗原T细胞增殖是评价(³H]胸腺嘧啶核苷掺入(27]。引流淋巴结收获和单细胞悬液制备210⁶细胞/毫升。细胞被添加到96 - 100孔板μL每口井的存在表明卵巢323 - 339的浓度(美国新英格兰肽,加德纳,MA)。48小时后,这些细胞被脉冲与1μCi /的[³H]胸苷和孵化为另一个16 - 20个小时。细胞在玻璃纤维过滤器,然后收获和³H)并入DNA用MicroBeta2板计数器测量。

2.5。在体外研究方法

2.5.1。HLA绑定化验

的16 GAD65肽选择在这项研究中,14可以合成和纯化≥80%的纯;GAD65 324 - 342是不包括在这里的研究报告将在多肽合成技术上的困难,和GAD65 108 - 131不包括由于低纯度。因此,我们验证了14抗原表位研究用于HLA-DR绑定体外有关酶联免疫斑点试验两步与人类PBMC。

人类Tregitopes GAD65抗原表位进行评估对HLA绑定在体外。我们使用了一个HLA绑定化验最初被斯逖尔et al。28在我们实验室)和适应更高的吞吐量。在96孔板,测试多肽和肽争夺的引用绑定纯化二类HLA分子(由威廉•郭Benaroya研究所,西雅图,佤邦,美国)24小时37°C。nonbiotinylated测试肽进行评估的浓度范围,而生物素化的参考肽举行一个固定浓度(0.1 - 1μ根据HLA)。参考多肽浓度如下:biotin-Flu-HA 306 - 318 (PRYVKQNTLKLAT)为0.1μM DRB1 * 0101和DRB1 * 0401和1μDRB1 * 0701米;和biotin-MBP 84 - 102 (NPVVHFFKNIVTPRTPPPS)为0.5μDRB1 * 1501 M。绑定到二级的肽分子被捕获ELISA板使用锅anti-class第二抗体(L243 anti-HLA-DRα链)。streptavidin-europium化验由加法和时间分辨荧光板的读者阅读。使用的四个参数标准曲线分析物流执行SigmaPlot软件,和一个集成电路₅₀值计算每一对peptide-allele 50%抑制被测试的范围包含肽稀释(表1)。一些肽可以在供应有限,因此只有检测绑定DRB1 * 0401。

2.5.2。研究对象

受试者诊断为近年来,谁拥有HLA-DR4等位基因在哈雷特招募中心糖尿病和内分泌学、罗德岛州医院(美国普罗维登斯RI)。消极的控制下受试者招募了一个单独的IRB协议与威廉·贝力弗博士合作的临床Partners LLC(美国国际扶轮Johnston)。这些人类研究进行了符合当地的机构审查委员会的指导方针。

2.5.3。人类PBMC两步T细胞化验

从个体受试者从全血分离PBMC使用聚蔗糖梯度分离。巴菲外套洗在PBS和resuspended RPMI人类AB血清含有10%(美国弗吉尼亚州谷生物医学,温彻斯特)、庆大霉素1%谷酰胺(Sigma-Aldrich)和0.1% (Sigma-Aldrich)。池的所有细胞都prestimulated 14肽来源于GAD65为2.5μg / mL /肽以及外生(10国际单位/毫升)和IL-7 - 2 (20 ng / mL),半也接受5μ人类Tregitopes g / mL的167年和289年。这些细胞被镀在密度为2.5×10⁶可行的细胞/毫升和培养7天在24-well文化包含2毫升PBMC悬挂在每个盘子。每2 - 3天在这段时间里,一半的媒介是新鲜中包含2和IL-7所取代。结束时的主要孵化(步骤1),这些细胞被有关酶联免疫斑点板(步骤2)收获和重振与个别GAD65抗原表位,肽池,或整个GAD65蛋白质(英国Kronus)。

2.5.4。人类PBMC ELISpot分析()

epitope-specific T淋巴细胞的频率决定使用Mabtech干扰素γELISpot板块(Mabtech、瑞典)。在最初的文化扩张(步骤1),细胞被洗了三次,在200000 - 250000年有关酶联免疫斑点板转移到每口井的细胞,和孵化37°C 48小时与个别肽,肽池,或整个GAD65蛋白质一式三份(步骤2)。消极的控制(不刺激)和有丝分裂原控制(PHA)包括在内。现货数量由第三方供应商(Zellnet咨询公司,李堡,新泽西,美国)有关酶联免疫斑点板使用蔡司读者(表3)。反应被认为是积极的,如果满意的标准有两个:(1)点的平均数量至少一式三份测试井两次背景的平均井,和(2)的平均数量是每100万个细胞至少50点/背景。由于大量的血液的变化从研究对象,获得细胞产量分离PBMC从全血后,主文化和恢复后,并不是所有的主题PBMC样本测试每个GAD65肽有关酶联免疫斑点试验中,ND所示”。“减少点数量Tregitope-treated文化,总结如表4,还进行了统计学意义,相对于对应的现货数量不是Tregitopes处理生成的细胞,称为单侧学生的t以及执行有关酶联免疫斑点一式三份的一对。

3所示。结果

3.1。在活的有机体内研究结果

3.1.1。Tregitope点头小鼠发病前糖尿病的治疗

的目的在活的有机体内流行性流感减毒活疫苗的研究是确定Tregitopes是否有或没有mPPI肽可以预防糖尿病的发病特征明显的点头自发的自身免疫性糖尿病的小鼠模型。在第一预防研究女性点头,我们给小鼠腹腔内的三倍(i.p)。9, 10, 11周的年龄(女;10老鼠/组,3组)与(1)一个无关紧要的卵子肽(肽控制,100μ每个动物g)在盐水,(2)盐控制,或(3)mTregitope 289年和167年mTregitope盐水(50μ100年g / Tregitope肽μg总/动物)。每周两次血糖(BG)水平测定30周;老鼠被认为是糖尿病如果BG水平≥250 mg / dL连续两个测量。

Tregitopes治疗(不增加胰岛细胞抗原肽)管理ip在9,10,11周的时候有一个适度抑制影响糖尿病NOD小鼠(图的发展4)。在所有三组的老鼠在这个实验中,测试BG水平开始增加在11到13周的年龄;一些老鼠成为糖尿病周11 - 12。管理两个Tregitopes (mTregitope 167和mTregitope 289)降低糖尿病的发病率,平均BG水平比两个对照组(卵子肽和盐水治疗);这种效果变得明显从周16 - 17和持续研究的持续时间(周29)。这些检验结果未达到统计上的显著水平尽管趋势明显,与后续研究一致,我们将在下面进行讨论。

在第二个预防研究,点头老鼠(女性;8老鼠/组)被分成五个治疗组(a e),其中每个收到5注射(在周8 - 10,疾病的发病和周14日至15日)各自的治疗。在这项研究中,我们管理Tregitopes T1D-associated鼠preproinsulin (mPPI)抗原表位来确定Tregitopes单独或Tregitopes结合目标抗原导致更好的结果。

A组(mPPI)收到表中列出的五鼠PPI肽2脂质体;B组(mPPI + Tregitopes)收到mPPI肽+ 4 Tregitope肽(h167, h289、m167 m289)在脂质体;C组托克斯(mPPI +春节)收到mPPI肽与控制肽(MHC-binding破伤风毒素肽830 - 844)在脂质体;D组(Tregitopes)仅接受四个Tregitope肽脂质体;和E组(脂质体)收到空白脂质体。在50 Tregitopes服用μg /鼠标/ Tregitope肽,共有200名μg /鼠标。mPPI肽在前10μg /鼠标/肽,总共50μg /鼠标。托克斯春节是在200年μg /鼠标。BG测量如上所述。所有治疗都开始前出现疾病(周8 - 10),总共持续了5治疗。

治疗和mPPI老鼠和人类Tregitopes 167年和289年镇压在近年的发展点头老鼠(图5)。没有老鼠对待Tregitope + mPPI肽(B组)开发的糖尿病,尽管半数(50%)的老鼠接受mPPI肽单独成为糖尿病患者(A组)。

糖尿病发病率的抑制Tregitopes是持久的。在20周,小鼠接受Tregitopes + mPPI (B组)仍然diabetes-free,显示没有明显的血糖升高()。两只老鼠在D组(Tregitopes)近两周患病之前其他组,但是到研究结束的总发病率较低,低水平的BG比任何其他组除了组b没有收到任何Tregitope治疗的三组(组a、C、E)都有20周的糖尿病发病率在50%以上,平均BG测量超过350 mg / dL。

3.1.2。Tregitope点头老鼠后出现疾病的治疗

剩下的两项研究的目的是确定Tregitopes是否在糖尿病的发病可能解决高血糖模型点头。女点头老鼠每天监测BG,进入治疗组在BG水平200 - 250 mg / dL之间连续两天。在进入研究,老鼠收到一个注入mTregitopes 167年和289年(共20μg)制定在IFA皮下注射的侧面。控制老鼠收到PBS IFA(车辆控制)或不及时治疗。BG水平测量每周治疗后30周,和老鼠被认为是糖尿病如果BG水平≥250 mg / dL。实验进行了两次。

如图6(一),单个Tregitope-IFA治疗减少了25周的BG在一段时间内第一个实验。PBS-IFA控制表现出初步抑制,但最终的BG在大多数的老鼠。收到的那组在IFA Tregitopes更强更持久的效果。25周的研究(约35周的年龄),七12 (58%)Tregitope-treated糖尿病小鼠BG从大于250降低到正常水平,非糖尿病,而只有两个9 (22%)PBS控制仍非糖尿病,和所有12个(100%)在两周内未经处理的小鼠糖尿病的发展。当diabetes-free老鼠在每组的比例绘制随着时间的推移kaplan meier曲线和分析使用生存率较和成对Holm-Sidak比较,有显著()未经处理和Tregitope-treated组之间的区别,但是不是PBS-IFA和Tregitope-treated组。

在第二个实验中(图6 (b)所有未经处理的控制老鼠迅速发展,达到2 - 3周内BG 500 mg / dL。组的老鼠收到Tregitope-IFA, 10, 11(91%)小鼠BG在26周低于250 mg / dL研究(大约36周的年龄),和四个(36%)这些短暂的海拔,自我调整,表明有一个持久的影响Tregitope治疗免疫内稳态。一般来说,老鼠的治疗开始时他们的BG大于350 mg / dL Tregitope治疗没有回应。PBS-IFA集团三7(43%)小鼠BG低于250 mg / dL 20周结束时(30周的年龄),研究表明IFA仅可能有部分影响糖尿病的发展。尽管如此,有意义)diabetes-free百分比随时间差异Tregitope-treated Holm-Sidak组治疗和PBS-IFA-treated组的方法。

如果两个实验相结合,十七23(74%)最初Tregitope-IFA组的糖尿病小鼠的BG低于250 mg / dL的观察。相比之下,只有五个16(31%)老鼠独自处理车辆在IFA (PBS) BG水平低于250 mg / dL的20周,建议Tregitopes由注射得宝(IFA)发病时的能够逆转糖尿病NOD老鼠。

3.1.3。抗原的适应性宽容感应

抗原特异性不能测量点头模型作为试剂(胰岛细胞抗体染色细胞特定抗原和四聚体NOD小鼠抗原表位)当时无法获得这些研究进行。相反,DO11.10老鼠,TCR转基因(Tg)线的识别特定的肽来源于卵白蛋白抗原(卵子),被用来进一步检查的影响Tregitope自适应感应的宽容在活的有机体内。在这些老鼠,CD4的大约80%⁺细胞,其中自然FoxP3 3 - 5%⁺,拥有特定的Tg TCR卵子323 - 339肽和承认的anti-clonotype马伯KJ1-26。其他的CD4细胞的20%⁺T细胞,FoxP3的10 - 15%⁺,有内生重组细胞。

六DO11.10 FoxP3 / GFP小鼠敲入Tg(来自老鼠从杰克逊实验室购买中描述方法和在27])都注射15μ克mTregitopes 167年和289年;5控制DO11.10 FoxP3 / GFP敲入Tg老鼠注射等量的MHC-binding控制肽从流感病毒血凝素(表无关2、流感哈306 - 318),在IFA通过乳化后拦路贼。10天后,老鼠牺牲和消耗腹股沟和腘淋巴结T细胞隔离被移除。我们测量(i)抑制OVA-specific增殖的T细胞对刺激的反应与卵子323 - 339肽体外由(³H]胸腺嘧啶核苷掺入试验和(2)诱导GFP表达CD4(具体)⁺/ KJ1-26⁺染色后T细胞,流式细胞仪。

如图7Tregitope治疗抑制OVA-specific增生性卵子的T细胞反应323 - 339肽与控制(流感公顷)和增加FoxP3-expressing CD4的比例⁺T细胞轴承OVA-specific Tg TCR (KJ1-26⁺)。CD4的⁺FoxP3 Tg T细胞,超过8%⁺(与流感病毒HA控制)。这在FoxP3-GFP显著增加⁺/ KJ1-26⁺细胞表明自适应宽容感应,Tregitopes在小鼠MHC OVA-peptide不能直接识别的特定Tg T细胞。类似的实验是在破布^−−/DO11.10老鼠,OVA-specific T细胞但缺乏内源性细胞受体,因此将缺乏Tregitope-specific nTregs。没有抑制体外增殖或干扰素γ生产被观察到在这种情况下(数据未显示),表明Tregitope-specific nTregs所需Tregitope治疗引起iTreg归纳。

3.2。在体外研究结果:表位预测和验证

3.2.1之上。GAD65表位预测

我们进行了一个详细的在网上对胰岛细胞抗原GAD65的分析。已经决定在其他蛋白质一样,GAD65 T细胞抗原表位被外基质并非随机分布在整个蛋白质序列,而是倾向于特定区域的“集群”,这与以前公布的抗原表位(图2和表1)。T细胞表位集群范围从12到大约25个氨基酸长度和包含8个8绑定主题共同HLA等位基因;这个观察是一致的与之前的描述这些抗原表位作为潜在高活性T细胞表位集群为人类内转至主题和非糖尿病的受试者(23,29日]。16个抗原决定簇在人类GAD65具有较强约束力的主题至少四个HLA DR4和确认。

3.2.2。HLA绑定化验

十四16肽被外基质和ClustiMer合成纯度> 80%,检测亲和力的体外竞争HLA DR4绑定分析中描述的方法。除了执行HLA-DR4约束力的研究中,我们评估绑定到选择HLA类型。在十四个抗原表位预测和合成,十二是绑定HLA-DR4预测。绑定中分析等位基因,7显示高亲和力(μ米)而另一个两个显示弱关联(μ米),总共九真阳性预测。剩下的五肽显示没有DR4亲和力;两个五non-binders外基质得分低于阈值的意义,使他们真阴性预测。因此,准确预测了绑定外基质试验结果十一14肽(79%)。在我们的经验中,可以观察到缺乏约束力更长时间序列可能让多肽折叠或聚合在体外,干扰HLA绑定。

额外的HLA绑定化验进行定义特定的集成电路₅₀曲线绑定DRB1 * 0101, DRB1 * 0701和DRB1 * 1501(表1)。总的来说,当所有外基质预测(不仅仅是出版HLA绑定限制),肽绑定为超过90%的情况下预测。外基质预测,证实了几个新的HLA限制GAD65 DR4-restricted发表抗原表位。例如,对于肽GAD65 243 - 267,亲和力HLA-DR4和许多其他等位基因被外基质预测和实验验证绑定化验。GAD65 450 - 470(图3(一个)),一个未发表的抗原决定基,也必然杂乱地(预测)。

3.2.3。体外与人类PBMC化验

我们评估人类GAD65肽的免疫反应Tregitopes的存在与否。上面的方法部分中描述的主题。PBMCs从六个DR4-positive主题和五个非糖尿病受试者(表3干扰素(IFN)检查γ)分泌反应引发刺激与个体GAD65肽后培养池的肽的存在与否hTregitope 167年和289年的有关酶联免疫斑点试验两步(描述的方法)。

如表所示3七11个科目(64%)显示广泛的基线GAD65免疫反应(与一些spot-forming细胞,或证监会,高于50每10⁶细胞在背景至少一半的抗原表位)。这与以前公布的结果是一致的23]。的平均数量GAD65积极干扰素的抗原表位γELISpot反应观察每内转至8.3(表3)。的平均数量GAD65积极干扰素的抗原表位γELISpot反应观察每正常(非糖尿病)控制主体为6.0(表没有明显不同3)。因此,没有明显的差异观察干扰素γ分泌细胞数量和epitope-specific反应GAD65糖尿病与非糖尿病组,之前已经观察到(23]。

所有14肽来源于GAD65测试和选择使用外基质诱导干扰素γ反应的有关酶联免疫斑点在至少一个衡量测试主题,确定预测。注意,EpiMatrix-selected抗原决定基GAD65 450 - 470图中描述3诱导干扰素γ反应在PBMC的五名糖尿病患者中,6例(83%)和三个五个阴性对照组(60%);这种肽免疫反应没有以前文献中描述。

3.2.4。总结两步分析的结果

co-incubation后GAD65肽与PBMC Tregitopes 167年和289年在体外,有一个趋势减少召回GAD65肽反应,虽然抑制水平肽之间在患者之间存在着显著的差异,甚至对于一个给定的患者进行测试。这种变化可以归因于不同的HLA关联GAD65抗原表位和Tregitopes个体主体的HLA等位基因(见项目分析,部分3.2.4)。有关酶联免疫斑点,在总结如表4干扰素,Tregitope-treated PBMC安装减弱了γ反应到78%(糖尿病受试者)或74%(正常对照组)GAD65抗原表位包含在每个试验,相比PBMC pre-cultured Tregitopes。减少点数量统计学意义()的26%肽进行测试。

3.2.5。个性化的T细胞表位测量(项)和近年来响应

抗原表位的T细胞反应,无论是T效应或监管,可能取决于HLA绑定关联,一个以前描述的效果Tregitopes [6]。我们已经开发出一种方法预测是否免疫反应(T效应或监管)将测量对于给定的主题,基于研究的预测亲和力肽为主题的HLA等位基因,称为个性化T细胞表位测量或物品(24]。糖尿病受试者的干扰素γELISpot反应GAD65肽显著相关条目分数为每个肽标准卡方分析(),而条目分数之间没有显著的关系被确认和证监会对健康对照组()。的影响来确定Tregitopes Tregitopes的与项目相关的分数,条目分数计算的Tregitopes 42肽/主题对有关酶联免疫斑点显示显著的响应GAD65抗原决定基引发刺激(大于50证监会/ 10⁶细胞在缺乏Tregitopes背景)。当Tregitope抑制的程度相应的分析,执行Tregitopes,由线性回归分析评估为42肽/主题对更高的条目分数之间没有观察趋势Tregitope肽和Tregitope强度的效果。然而,回归分析16例,显著抑制Tregitope GAD65免疫反应的发现表明更大的相关性()之间的Tregitope项得分和Tregitope反应的强度(以实际数量的减少证监会/ 10⁶细胞)。具体来说,更高的条目分数这些16肽/病人的组合与更大的减少证监会/ 10⁶细胞后Tregitope co-incubation。线性模型的准确性,如所示价值,是更大的数据子集(有关酶联免疫斑点结果()比)。因此个人的影响Tregitopes基于HLA等位基因的个体对象博士亲和力是重申了在目前的研究6]。

3.2.6。从诊断Tregitope功效和时间之间的关系

我们推断Tregitope影响可能更明显在近年来的发展,早期的炎症反应内转至抗原可能会限制更少的抗原表位。仔细看看两个最近诊断为主题,我们发现1107年主题,诊断抽血前7个月,有更少的反应GAD65抗原表位,和那些在场的T细胞反应低,更容易抑制通过coincubation Tregitope比其他科目。糖尿病的发病是很难精确地确定;因此强大基线反应和缺乏Tregitope-mediated镇压1104年主题(图8),他被诊断出抽血前6个月,可能是一个指示器,主题糖尿病很大一段时间医学诊断。

4所示。讨论

4.1。在活的有机体内研究

新的治疗方法诱导持久islet-specific内转至需要宽容和保护。干预的关键时期是在糖尿病的发病,当亚可以保护胰岛细胞质量(30.]。在这里描述的研究中,我们表明,合并施打Tregitopes和mPPI肽糖尿病发病前废除了糖尿病的15到20周。糖尿病是完全抑制的研究(20周)在小鼠治疗目标抗原(mPPI)和Tregitope;Tregitope单独温和的效果观察,没有影响时观察小鼠接受mPPI肽和控制托克斯肽春节或空白脂质体。

在治疗模型也用点头的老鼠给mTregitopes 167年和289年(没有额外的目标抗原),我们表明,政府Tregitopes IFA糖尿病发病后导致糖尿病的发病率显著降低比生理盐水控制。在重复这个实验,宽容的时间持续了超过15周后只有一个Tregitopes治疗。

以下4.4.1。诱导适应性宽容

一个潜在的解释效果Tregitopes点头模型将诱导胰岛细胞抗原宽容。为了验证这一点,我们评估了Tregitope对抗原的影响自适应公差在现有TCR-Tg小鼠模型。TCR-Tg FoxP3-expressing iTregs (GFP-fluorescent模型)被确定后治疗mTregitopes 167年和289年在KJ1-26浇注⁺T细胞(Tg) TCR的标志)。控制肽治疗流感哈306 - 318并没有导致类似的iTregs水平。我们也表明,这些亚群的功能,在卵子peptide-specific增殖抑制T细胞反应,如细胞因子表达。在重复实验中表现在破布^−−/DO11.10老鼠(缺乏nTregs),没有观察到Tregitope效应,这表明抑制免疫反应可能需要Tregitope-specific细胞的诱导和激活,随后导致修改TCR Tg T细胞的表型。因此,这项研究是完全符合的两步模型自适应宽容感应Tregitopes: (i)诱导Tregitope-specific KJ1-26⁻(非TCR-Tg) nTregs(2)诱导KJ1-26紧随其后⁺(TCR Tg) iTregs。在作用机理的研究(Cousens et al .,投稿),我们已经证实孵化Tregitope T细胞和APC导致以下实足的一系列事件:Treg扩张和激活,紧随其后的是修改的APC表型(72小时),之后的抗原诱导适应性宽容。

自适应宽容胰岛细胞抗原被认为是近年来治疗成功的一个关键组件。自适应Treg感应特定于卵巢肽,Tregitopes治疗后,在DO11.10 / FoxP3-GFP / TCR-Tg老鼠相似的iTreg感应观察到桦树花粉抗原在原来的已发表的研究6]。此外,van der Marel等人Tregitope 167年交付使用一个AAV在结肠炎小鼠模型,观察到显著减少疾病端点(31日]。免受疾病与胸腺Treg种群的控制——从7%上升至11% Tregitope-treated老鼠。这提供了独立的证据,即使是小量增加Treg人口有很大影响炎性疾病的改善。虽然亚最初被认为产生只在胸腺(32在老鼠和人类),后来的研究表明,自适应或诱导亚可以开发外围在各种条件下(2,33]。

4.2。在体外研究

4.2.1。准备GAD65抗原表位

柳条等人进行HLA DR4绑定化验使用重叠从GAD65肽,证实三high-binding肽也刺激增殖Tg小鼠T细胞反应表达HLA-DRB1 * 0401 (34]。Endl等人证实肽的一篇266 - 285和556 - 575 T细胞抗原表位在糖尿病受试者(35];我们确认这些发现使用HLA DR4外基质的分析(36]。四大的三个序列包含三个GAD65肽外基质的选择。额外的出版GAD65抗原表位在这里定义的EpiMatrix-predicted集群可以找到。我们描述一个新的抗原决定基位于GAD65氨基酸450年以前没有发表。所有的抗原表位被重新检验它发表在HLA绑定检测和T细胞检测,和一个以前未发现的抗原决定基被确认在这项研究中,确认epitope-prediction工具的效用,如外基质和ClustiMer用于自身免疫的研究。我们发现正常类型的影响和控制主体PBMC回应类似T1D-associated抗原,正如前所述[23]。

4.2.2。两步化验

当我们人类Tregitopes co-incubated PBMC在体外我们观察到许多实例Tregitopes抑制免疫反应的抗原表位来自GAD65。GAD65抗原决定基的反应不同的主题(如可能会给予HLA背景),和Tregitopes的效果也不同的基线反应GAD65抗原表位。在这种情况下,T细胞反应是强(ELISpot-forming每百万PBMC细胞)Tregitopes通常没有抑制免疫反应。然而,我们观察到一个整体相关的条目得分Tregitopes Tregitope抑制在体外。虽然在数量有限的主题和免疫反应的数量,项目之间的相关性分数(Tregitopes能力的上下文中提出了受试者的HLA等位基因)博士和抑制免疫反应在体外与以前公布的一致(6)和未发表的数据(费德里科•Mingozzi、个人通信)。

消极的控制井仅包含介质;在这些控制肽没有使用在体外研究。免疫反应的主题范围从高到低的肽。尽管如此,在先前发表的研究(6]在研究投稿(Cousens,作用机理研究),没有类似的抑制效应的控制(MHC-binding)肽在活的有机体内或在体外Tregitopes相比,这也直接导致亚群的扩张。Tregitope抑制并不是由于毒性,再次,因为全球免疫抑制和未见在体外抑制的反应与HLA的能力高度相关的肽所定义的项目。此外,没有任何毒性与Tregitope治疗相关的四个点头这里描述的研究。

5。结论

减少胰岛细胞破坏和保护胰岛细胞功能是治疗的目标旨在治疗近年来。提出治疗与anti-CD3单克隆抗体(mab)如Teplizumab、诱导亚群,表明一些功效,但Treg感应机制是难以捉摸的,效果似乎是短暂的和/或需要治疗早期内转至疾病(37]。干预的关键时期是在糖尿病的发病,当亚可以保护胰岛细胞质量(30.]。Treg函数也可以更好的保存在近年来早期。类似药物靶向效应T细胞如Abatacept和Otelixizumab也可能的疗效有限,部分原因在于他们缺乏特异性的致病性T细胞。Tregitopes内转至抗原诱导抗原可以宽容和管理,因此,可以更有效的比先前研究致耐方法。

Tregitopes点头小鼠发病的糖尿病管理解决高血糖只要29周,并行研究DO11.10 Tg老鼠,Tregitope治疗诱导抗原亚群在这些老鼠。有效的宽容,一剂实现了感应Tregitopes在IFA,加在一起,在活的有机体内研究表明,Tregitopes诱导抗原宽容和Tregitopes可能有效的初始(早期)治疗近年来。维护公差可能需要间歇性低剂量维持种群Treg [- 238]。

Tregitope疗法可能被认为是类似的,但也不同于,丙种球蛋白(多克隆人类静脉免疫球蛋白G)治疗(39]。在许多动物和人类自身免疫性疾病状况,丙种球蛋白可以诱导亚群的扩张和il - 10分泌40- - - - - -43];树突细胞处理所需的丙种球蛋白的影响在一些研究[44]。Tregitopes也类似于许多其他IgG-derived肽(独立确定为Tregitopes由于其实现标准Tregitope标准)等CDR1,也称为Edratide [45- - - - - -47),它提供了额外的Tregitopes独立确认。这些人类的推理研究,Tregitope肽管理对人类可能类似丙种球蛋白的安全性。

两个额外的肽免疫疗法类似Tregitope他们刺激抗原免疫调节T细胞反应,迦得和DiaPep277在临床试验中。这些是基于单个多肽或蛋白质。与DiaPep Tregitope治疗策略可能包括多个Tregitope肽免疫球蛋白g管理与胰岛细胞抗原,这将增强Treg对这些抗原的反应。同样,迦得内转至患者的免疫治疗可能会增强Tregitopes之外的。

最后,Tregitope在小鼠移植研究的初步研究表明,他们不可能对慢性有效但急性移植排斥(纳德Najafian、个人通信)。因此Tregitopes也可能使用的再生方法治疗近年来通过增加β细胞质量和促进胰岛细胞移植。应用程序和其他自身免疫性疾病和酶替代疗法也被认为是(48,49]。是否作为预防、治疗或移植方案,归纳公差使用Tregitopes胰岛细胞抗原可能导致疾病管理的范式转换,允许临床医生安全解锁treg调节免疫反应的潜力,扩大免疫治疗策略的数量可以治疗自身免疫性糖尿病。

确认

这项工作由一个青少年糖尿病研究基金会支持的“行业授予”和SBIR I / II阶段奖(1/5R43DK081261)国家健康研究所。专家的帮助瑞恩Tassone和编辑劳伦·李维兹的努力是感激地承认。