文摘

背景。高血糖扮演关键的角色糖尿病肾病(DN)的发展,可能与表观遗传代谢记忆。其中一个最重要的组蛋白的化学修饰是表观遗传机制,这是与纤维化因子在血管损伤的表达。目的在这项研究中,我们研究了组蛋白的泛素化H2A、H2B探索DN的表观遗传机制。材料和方法。gmc是培养如下:正常组,高葡萄糖组,甘露醇组和干预组。后12小时、24小时和48小时,组蛋白泛素化,转化生长因子- (TGF - ),纤连蛋白(FN)测量使用世行,rt - pcr,如果。结果。高葡萄糖能促使FN的upregulation。H2A泛素化在gmc增加高葡萄糖组 ,而它在干预组显著降低 。相比之下,H2B泛素化减少葡萄糖的浓度增加,但这是在干预组恢复 。表达TGF - 改变以应对异常组蛋白泛素化。结论。高葡萄糖可能诱发H2A泛素化和减少H2B gmc的泛素化。组蛋白泛素化的变化可能是由于部分DN通过激活TGF - 信号通路。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的最严重的微血管并发症之一,它仍然是晚期肾脏疾病的最常见原因(ESRD)。糖尿病的患病率和患者患有糖尿病微血管并发症增加全球(1]。近三分之一的糖尿病患者患肾病,早期诊断是关键在预防长期的肾脏损失(2]。然而,机制导致DN尚未完全阐明,治疗选择是有限的。

高血糖扮演关键的角色激活各种炎症通路的开发和进展DN。它诱导纤维化因子转化生长因子- (TGF - )和纤连蛋白(FN)、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(老城),和先进的糖化终端产品直接或通过基因转录,导致肾小球和肾小管基底膜增厚,逐步积累细胞外基质(ECM)的蛋白质,间质纤维化,肾小球硬化症(3- - - - - -6]。FN ECM的主要成分之一,是细胞损伤的一个重要象征。升级FN的表达将最终导致糖尿病肾病的发展。临床试验报道,严格的血糖控制可以减少糖尿病并发症的发展。糖尿病并发症,包括慢性肾脏疾病如DN,已被证明存在,即使血糖控制取得了进展,可能由于之前的高血糖,被认为是表观遗传代谢记忆(7]。初步使用内皮细胞表明瞬态事件的高血糖能引起基因表达的变化依赖于修改(即组蛋白尾巴。甲基化)(8]。持久性的修改尚未完全解释道。额外的研究关于表观遗传机制是必要的,以提供有价值的新见解的病理DN。

转译后的修改nucleosomal aminoterminal反面的组蛋白,包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、中扮演关键角色,类泛素化调节染色质结构和基因转录与调节糖尿病并发症的新陈代谢(9]。修饰的组蛋白泛素化是一种重要的表观遗传标记,可能会影响基因表达的改变,涉及各种chromatin-based事件,如基因沉默和修复DNA损伤(10]。大多数的组蛋白泛素化发生在染色质的一个泛素分子通过isopeptide链接到一个特定的赖氨酸残基上组蛋白H2A、H2B的c端尾。在较小程度上,组蛋白H1、H3和H4 ubiquitylated体内,和不同的组蛋白泛素化有不同的功能(11]。然而,在DN组蛋白泛素化的影响尚不清楚。

最近的研究表明,组蛋白修饰与糖尿病直接或间接相关的攻击(12- - - - - -15]。组蛋白乙酰化作用可以激活TGF - 信号通路,在DN肾纤维化中发挥着重要作用。同样,DN与增加肾H3K9和H3K23乙酰化作用,H3K4 dimethylation, H3磷酸化丝氨酸10,增强了染色质展开和基因表达16,17]。迄今为止,它是未知是否参与组蛋白泛素化间质纤维化和肾小球硬化症等DN还是高血糖的影响可以通过TGF -介导的表观遗传事件 信号通路。蛋白酶体抑制剂MG132,建议减弱降心脏重构和功能障碍的表达下调TGF -的水平 (18]。是否泛素蛋白酶体抑制剂可以抑制肾纤维化是激活的TGF -紧随其后β信号通路在糖尿病肾病尚不清楚。因此,进一步的研究开发新的治疗DN是必要的。在这项研究中,我们评估的影响高葡萄糖感应的组蛋白H2A泛素化,减少了组蛋白H2B泛素化在全球大气环流模型,和TGF -的表达变化 其次是异常的组蛋白泛素化。作为泛素蛋白酶体抑制剂MG132,可以防止H2A、H2B的改变引起的泛素化高葡萄糖。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

细胞培养基和胎牛血清买来Hyclone(美国)。大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)从武汉大学保存中心购买和维护在低葡萄糖与10%胎牛血清DMEM 37°C和5%的公司2。gmc第二和第五章节之间用于所有试验和随机分为以下六类:(我)正常对照组(NC组),与含有5.6 L更易与葡萄糖的媒介,(2)10更易/ L葡萄糖组(HG1组),与含有10 L更易与葡萄糖的媒介,(3)20 L更易与葡萄糖组(HG2组),与含有20 L更易与葡萄糖的媒介,(iv)30 L更易与葡萄糖组(HG3组),与含有30 L更易与葡萄糖的媒介,(v)渗透压集团控制(OP组),与介质包含5.6更易与L / L葡萄糖+ 22.4更易与甘露醇,(vi)MG132干预组(MI组),介质包含30 L更易与葡萄糖+ 1 mol / L MG132。MG132被添加到培养基块组蛋白的泛素化。

每个小组培养了12小时,24小时和48小时。

2.2。蛋白质提取和免疫印迹

总蛋白是从gmc孤立使用总蛋白提取工具包(Kaiji、上海、中国)。蛋白质浓度测定用BCA分析(Beyotime、上海、中国)。西方墨点法进行如前所述[19]。免疫印迹分析使用anti-ubiquityl-histone H2A(鼠标,1:1000;美国微孔),anti-ubiquityl-histone H2B(兔子,1:1000;美国CST), anti-GAPDH和肌动蛋白(兔子,1:1000;中国上海Beyotime)。辣根peroxidase-conjugated二级抗体(anti-rabbit和anti-mouse)从Beyotime获得生物技术研究所,上海,中国。蛋白质使用增强化学发光检测系统和ECL Hyperfilm(美国微孔)。

2.3。RNA提取和半定量PCR

使用一个RNA提取总RNA提取gmc工具包(Tiangen生物技术,北京)。总共有500 ng RNA是反向转录20的最后一卷 L使用豆类RNA PCR试剂盒(Baoshengwu,大连,中国)。4毫升cDNA放大在梯度热循环(埃普多夫,德国)使用PCR反应混合液(Baoshengwu,大连,中国)。结果是决定使用紫外线透照器和归一化3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。引物序列如下:组蛋白H2A泛素化(uH2A), 5′gca CCC TGA有条件现金援助TGC CTA T 3′,相反,5′太极拳CAG CCA CCA条T - 3′,有条件现金援助组蛋白H2B泛素化(uH2B), 5′公司治理文化CTG GCT猫TAC AAC-3′,相反,5′ctt GGT TTC CGA CA-3′,转化生长因子- (TGF - ),向前,5′ATG GTG广汽公司治理文化AAC AAC-3′,相反,5′gag CAC TGA AGC棉酚AGC-3′, FN,向前,5′- TGC CGA ATG标签ATG AGGA 3′,相反,5′aaa TGA CCA CTG CCA AAGC 3′, GAPDH,向前,5′有条件现金援助CAA手枪TGT CAG CAA T 3′,相反,5′CCA太极拳ACA GTC TTC TGA GT-3′。

2.4。免疫荧光

细胞生长在盖玻片6-well盘子。一夜之间坚持后,细胞治疗与媒体包含高葡萄糖、甘露醇、MI媒体24小时。细胞被固定在4%多聚甲醛(皮尔斯)和permeabilized 0.2%渐变20(σ),10分钟后洗短暂PBS。细胞被封锁与5%的山羊血清1小时在室温和孵化一夜之间与主要抗体与PBS洗紧随其后。40分钟的细胞被孵化与适当的二次抗体共轭FITC荧光染料。DAPI (4′, 6′-diamino-2-phenylindole)用于染色细胞的细胞核。盖玻片是清洗和安装到幻灯片使用荧光安装介质(Beyotime、上海、中国)。控制细胞孵化主要抗体。DMIRE图片拍摄2激光扫描共焦显微镜(德国徕卡)。

2.5。统计数据

所有的实验数据都来自三个独立实验一式三份。数据被表示为的意思 SD ( ),使用SPSS 11.5统计软件进行分析。统计差异计算使用单向方差分析(ANOVA)比较两组以上,其次是LSD检验多重比较。 被定义为具有统计学意义。

3所示。结果

不同葡萄糖培养基的细胞形态没有明显变化(图1),但FN的表达增加高葡萄糖组随着时间的推移,特别是HG3组48小时(图2)。


图1
每组细胞图像的gmc倒置相差显微镜( 100)。没有明显的细胞形态的变化。
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图2
FN的mRNA水平在每个群gmc。(一)rt - pcr带图表对不同浓度的葡萄糖。FN mRNA在高葡萄糖组增加,尤其是在HG3组。(c)相应的mRNA水平的相对灰度值统计图。 与NC组, 与NC组和 和HG2组。(b) rt - pcr带图表对不同时期。随着时间的推移FN mRNA的表达增加。(d)相应的mRNA水平的相对灰度值统计图。 与NC组。

在文化48小时后,免疫印迹分析显示低H2A泛素表达NC组。表达更高的高葡萄糖组与NC组( 以浓度依赖的方式)。最强的表达式是30更易/ L高葡萄糖组( )。相比之下,H2B泛素化表达强烈的NC组。没有显著差异H2B泛素化表达式10更易/ L高葡萄糖组相比NC组( )。表达较低在20和30更易/ L高葡萄糖组相比NC组( )和最弱的30更易/ L高葡萄糖组。OP和NC组没有差异的泛素化H2A、H2B ( )(图3)。

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图3
组蛋白的表达H2A、H2B泛素化在每组gmc的免疫印迹(48小时)。(一)uH2A uH2B蛋白质在不同葡萄糖浓度和高渗透压在48小时:uH2A增加高葡萄糖组和uH2B随着葡萄糖浓度的增加而减少;他们HG3集团最重要的变化,但没有明显的NC组和OP组之间的差异。(b)的灰色图像显示了相对统计值uH2A每组。uH2A的表达在高葡萄糖组增加,尤其是HG3组。 与NC组, 和HG1集团 和HG2组。(c) uH2B的灰色图像显示了相对统计值为每个组。uH2B蛋白的表达减少浓度依赖性,显然在HG3组。 与NC组, 和HG1集团 和HG2组。

uH2A蛋白的表达增加HG3组在不同的时间间隔,特别是在24小时后的文化。uH2A表达的增加在不同时间点是统计学意义( )。uH2B蛋白的表达明显减少了时间依赖方式( )(图4)。MG132干预后,uH2A的表达明显减少而表达式30 L更易与葡萄糖组( )。相比之下,uH2B的表达是恢复MI组相比HG3组( )(图5)。相同的结果被发现使用细胞immunofluorescent染色法和激光扫描共焦显微镜的应用程序(图6)。

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图4
组蛋白H2A、H2B的表达引起的泛素化在gmc 30 L更易与葡萄糖在不同时期决定用免疫印迹。(a)与NC组相比,uH2A表达增加与30 L更易与葡萄糖刺激后24小时后,但uH2B表达减少。(b)灰色的图表显示了相对uH2A统计值为每个组蛋白表达在不同的时间点。uH2A的表达是在24小时急剧增加。 与NC组, 对12 h,和 与24小时。(c)灰色的图表显示了相对uH2B统计值为每个组蛋白表达在不同的时间点。和uH2B表达式是一个与时间有关的变化。 与NC组, 对12 h,和 与24小时。
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图5
组蛋白的表达H2A、H2B泛素化与MG132干预后决定使用免疫印迹(uH2A 24 hr和uH2B 48小时)。(一)免疫印迹带图。(b)的灰色图像显示了相对统计值uH2A每组。与NC组相比,uH2A蛋白的表达在HG3组显著增加。uH2A MG132干预后,蛋白表达下降。 与NC组和 与1 HG3组。(c) uH2B的灰色图像显示了相对统计值为每个组。与NC组相比,uH2B蛋白的表达明显减少HG3组。MG132干预后,uH2B相对于正常组织发生了变化。 与NC组和 与1 HG3组。
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图6
组蛋白的表达H2A、H2B泛素化在gmc immunofluorescent染色和激光扫描共焦显微镜的应用程序。A1, NC组,B1, HG3集团,C1, MI组,D1, OP组,E1,消极的控制,和A2, B2, C2, D2, E2代表相应的组核染色。(一)uH2A蛋白质和(b) uH2B蛋白质。uH2A和uH2B蛋白质在细胞核中发现绿色与蓝色荧光重叠核污渍DAPI荧光发射。uH2A蛋白中没有检测到数控集团,但它是杰出的HG3组。蛋白质是强烈MG132干预组中检测到,并没有显著改变结果的高渗透压。的结果uH2B蛋白质与uH2A结果。

TGF -的表达 信使rna增加高葡萄糖组与NC组( )浓度和时间依赖性的方式(图7)。它减少了uH2A正常化和H2B蛋白表达( ),尽管uH2A和H2B的mRNA水平在每组(图并没有统计上的不同8)。

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图7
的mRNA水平TGF - 在每个组gmc。(一)rt - pcr带图表对不同浓度的葡萄糖。(c)的相对灰度值统计图mRNA水平不同浓度的葡萄糖。(b)和rt - pcr (d)条图和相对灰度值统计图的mRNA水平不同的时间。 与NC组和 与NC组。
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图8
的mRNA水平uH2A uH2B, TGF -β在gmc MG132高葡萄糖和抑制引起的。(一)rt - pcr带图。(b)的相对灰度值统计图mRNA水平。与NC组相比,uH2A的mRNA水平和uH2B没有组织之间的不同。TGF -的表达 mRNA在HG3集团大大增加,减少心肌梗死组相比HG3组。 与NC组和 与1 HG3组。

4所示。讨论

高血糖扮演着一个重要的角色在DN的开发和发展,进而诱发FN的表达,导致细胞损伤,但是DNA序列的变化不能完全解释遗传的基因表达模式。然而,高血糖的记忆或许可以解释为什么强化血糖控制未能改善糖尿病患者的心血管结果,虽然这一现象的分子机制还有待阐明。目前的研究发现组蛋白修饰可以改变染色质的疏散和聚合状态影响组蛋白之间的兼容性和双链DNA和亲和力的影响结构基因启动子的转录因子,它可以调节基因的表达(20.]。最近的研究表明,diabetes-induced表观遗传变化可以影响基因表达在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞和持久的表观遗传修饰的改变在关键炎症基因启动子后暴露在糖尿病条件(7,21]。组蛋白乙酰化作用变弱表皮生长因子信号,一个关键的角色在DN的发展,与全基因组研究都表明特异性组蛋白甲基化模式的改变条件下的DN (22,23]。在糖尿病视网膜病变中,组蛋白乙酰化作用在糖尿病大鼠视网膜的显著增加,导致高血糖诱导upregulation促炎的蛋白质,从而对糖尿病性视网膜病变的发展(24]。在DN,组蛋白乙酰化作用,特定组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰酶抑制剂显著增强TGF - 1-induced基因表达在大鼠系膜细胞和肾小球的糖尿病小鼠和增强肾小球功能障碍与糖尿病肾病(25]。组蛋白甲基化也获得了关注潜在的分子机制基础代谢记忆和DN。具体Set7赖氨酸甲基转移酶是最好的特征酶,显示高表达在DN。此外,Set7对糖尿病并发症的病因学的贡献可能扩展到其他转录事件通过非组蛋白的甲基化基板(26,27]。然而,在糖尿病肾病组蛋白泛素化是知之甚少。在这项研究中,我们发现高葡萄糖可能导致细胞损伤,诱导组蛋白H2A的泛素化,减少组蛋白的泛素化H2B gmc。

结果表明,组蛋白H2A、H2B泛素化可能参与的开发和进展DN表观遗传机制。虽然行动的机制是不同的不同的组蛋白,组蛋白的泛素化H2A K119可能诱发DN和组蛋白泛素化的H2B K120可以延缓DN的发生。

TGF - 涉及多种人类疾病,包括血管和肾脏疾病,主要纤维变性的因素。糖尿病肾病(DN)是一种慢性肾并发症表现为肾小球和肾小管基底膜增厚和进步积累细胞外基质(ECM)的蛋白质,如I型和IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白在肾小管间质和肾小球膜。TGF - 增加ECM积累和发展中起着重要作用的慢性肾脏疾病通过下游效应器的感应,这是一种结缔组织生长因子,减少矩阵退化通过蛋白酶的抑制或激活蛋白酶抑制剂(28]。TGF - 信号通路是由很多因素,包括组蛋白修饰和染色质的表观遗传标记,如组蛋白H3 TGF -赖氨酸甲基化 1-induced基因表达在大鼠系膜细胞在正常和高葡萄糖条件下。TGF - 1已被证明ECM-associated基因的表达增加,胶原结缔组织生长因子- 1,纤溶酶原激活物inhibitor-1。水平的提高组蛋白H3 K4甲基化与活跃的基因和减少相关的组蛋白H3 K9在这些基因启动子甲基化水平随变化的表达式(29日]。TGF - 1也增加了H3 K4甲基转移酶的表达SET7/9这些启动子和招聘。SET7/9基因沉默与siRNAs显著减毒TGF - 1-induced ECM基因表达(9]。在这项研究中,我们没有检查uH2A的mRNA水平的变化和uH2B由于uH2A和uH2B蛋白质刺激高葡萄糖。这意味着没有差异的基因顺序组蛋白H2A、H2B除了转译后的修改,包括组蛋白泛素化。我们观察到的mRNA水平TGF - 极大地提高了uH2A和uH2B蛋白质的变化紧随其后。总之,uH2A和uH2B蛋白质表达改变诱导高葡萄糖在gmc可能提高TGF -的激活 的发病机理和影响DN。

最近的一项研究报道,泛素蛋白酶体抑制剂MG132 antifibrotic函数。MG132施加一个antifibrotic效果同时表达下调I型胶原蛋白和组织抑制剂metalloproteinase-1和移植metalloproteinase-1生产在人类皮肤成纤维细胞(30.]。管损伤大鼠2型糖尿病模型被证明是预防MG132通过减少肾小管间质纤维化(31日]。多项研究表明,MG132会影响减轻肾纤维化通过抑制肾脏纤连蛋白mRNA的表达与早期糖尿病肾病大鼠,可以改善蛋白尿等症状32]。

组蛋白泛素化研究是稀缺的,具体有效的抑制剂可以阻止组蛋白的泛素化并没有被描述。组蛋白泛素化的过程类似于其他蛋白的泛素化。MG132是一个特定的泛素蛋白酶体抑制剂,可以抑制活化的TGF - 信号通路,它是重要的DN(纤维化的发展33]。然而,在文献中没有任何证据是否MG132可以抑制组蛋白泛素化障碍或消除表观遗传代谢记忆治疗DN。我们的实验表明,疾病包括组蛋白H2A、H2B泛素化可以表现出一个明显的逆转趋势的基础上治疗大鼠肾小球系膜细胞和MG132 30更易/ L高葡萄糖。组蛋白泛素化消除障碍后,TGF -的表达 信使rna MG132干预后被抑制。这表明,泛素蛋白酶体抑制剂可能有积极的功能在糖尿病肾病的治疗中通过抑制障碍包括组蛋白H2A、H2B泛素化影响基因表达的TGF - 。

蛋白酶体抑制剂MG132诱发细胞凋亡。例如,MG132抑制PI3K / Akt和NF B通路,促进线粒体去极化,减少线粒体凋亡蛋白的浓度。MG132还p38-JNK1/2信号介导的激活和增强选择性凋亡在胶质母细胞瘤细胞(34,35]。MG132承诺为癌症治疗,因为它明显抑制恶性肿瘤细胞的生长,并逮捕了细胞G2 / M期细胞周期,细胞变得凋亡[36]。斯特罗姆和Panlsen报道,MG132抑制泛素蛋白酶体降解细胞凋亡的诱导物NGFI-B和核受体(37]。Thakur建议MG132抑制组蛋白脱乙酰作用通过增加组蛋白脱乙酰酶的降解引起的前列腺癌细胞系绿茶多酚,其次是逮捕和凋亡细胞(38]。因此,泛素蛋白酶体抑制剂MG132可以抑制蛋白酶体和诱导细胞凋亡。可能的答案关于组蛋白泛素化的原因被确定在这项研究中,但具体机制需要进一步的研究。确定的特定抑制剂组蛋白泛素化和发现组蛋白泛素化在糖尿病肾病肾纤维化的作用仍然是一个挑战。

总之,我们证明了高葡萄糖诱导组蛋白H2A的泛素化和减少组蛋白的泛素化H2B gmc。组蛋白泛素化的变化在gmc可以激活TGF - 信号通路参与了糖尿病肾病的发病机制。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(30670980)。作者要感谢神经生物学实验室,临床中心实验室,Cordis-myoelectricity实验室技术支持。